全 文 ：收稿日期:2007-11-05;修回日期:2008-07-09
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30070702);广东省科技重
点专项资助项目(2003A3080502);深圳市科技计划资助项目
(200326);海南省自然科学基金计划项目(80570)
作者简介:姚　敏 , 女 , 副主任技师 , 主要从事花粉变应原的基础
与应用研究。
通讯作者:刘志刚(E-mai l:lzg@s zu.edu .cn)
重阳木花粉相关变应原 profilin基因的克隆 、表达及免疫学鉴定
姚　敏2 , 刘志刚1 , 邬玉兰1 , 孟　光2 , 李春林2
(1.深圳大学过敏反应与免疫学研究所 , 深圳　518060;2.海口市人民医院检验科 、 耳鼻喉科 , 海口　570208)
摘要:克隆 、 表达和纯化重阳木花粉相关变应原 profilin基因 , 并对其免疫学活性进行鉴定。采用 RT-PC R和 3 -RACE技
术获得整个 profilin 基因的开放阅读框 , 将其与 PET28a 载体连接并转化大肠杆菌 E.cdi BL21(DE3)进行诱导表达 , 通过
Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化 , 采用Weste rn blot 检测其 IgE 结合活性。克隆获得了 profilin 的全长基因 , 开放阅读
框为396 个碱基(包括终止密码子), 编码 131 个氨基酸。成功地构建了原核表达载体 , 并在大肠杆菌中大量地表达了 pro fi-
lin , 纯化后的重组蛋白进行免疫印迹 , 结果显示重阳木花粉过敏患者血清对重组 profilin反应呈阳性。
关键词:重阳木;花粉过敏原;肌动蛋白抑制蛋白;重组过敏原
中图分类号:R392.12 文献标识码:A 文章编号:1001-2478(2008)05-0385-05
　　变态反应疾病长期以来一直是医学界的一大难
题 , 而且 , 随着人类生活方式和饮食习惯的变化以
及因健康因素蔬菜和水果消费的增加 , 对植物性食
物的过敏反应在过去的十年里迅速增加[ 1] 。临床发
现 , 有超过 70%的花粉过敏患者在食用一些水
果 、 蔬菜后会出现过敏症状[ 2] 。其中 , 肌动蛋白抑
制蛋白是引起这种现象的原因之一[ 3] 。
肌动蛋白抑制蛋白(prof ilin)是一个存在于几
乎所有真核细胞中的蛋白 , 其功能是将肌动蛋白单
体隔开 , 并且抑制肌动蛋白丝延长 。在植物中肌动
蛋白抑制蛋白序列的同源性很高 , 一般在 71%～
85%, 而且有一个保守的序列长度 , 131 ～ 134 个
氨基酸 , 分子量在 14.0 ～ 14 .5 kD之间 。当具有高
度交叉反应性的桦树变应原 Bet v 2被确认为肌动
蛋白抑制蛋白时 , 该蛋白才引起了变态反应学的注
意。实验证明 , 肌动蛋白抑制蛋白广泛存在于花
粉 、 水果 、蔬菜 、香料 、 种子 、坚果 、 乳汁等致敏
物质中 , 因此被称为泛变应原(pan-al lerg en)[ 4] 。
重阳木(B ischof ia poly carpa), 别名乌杨 、
枫杨 、赤木等 , 为大戟科重阳木属 , 是一种热带 、
亚热带常见植物 , 广泛分布于我国长江流域及以南
各省 , 国外越南 、印度 、 印度尼西亚 、 菲律宾 、 日
本 , 澳大利也有分布。是一种优良的庭荫树和行道
树及堤岸绿化树种 , 也是很重要的建筑用材[ 5] 。自
然界花粉种类繁多 , 仅少数可引起花粉症 。绝大多
数花粉变应原为风媒传播 , 须具备以下条件:产生
花粉的植物广泛生长;花粉量大 、授粉期长;花粉
体积小 、 质量轻 、 易飘散。由于重阳木花粉为风媒
花粉 , 分布广泛 , 在授粉季节所产花粉量较大 , 因
此就具有很大的过敏潜能。但到目前为此 , 国内外
尚未见对重阳木花粉变应原进行的研究报道。本研
究利用简并性引物 , 结合 RT-PCR和 3 -RACE 技
术 , 成功地表达了重阳木花粉相关变应原 profi-
lin , 经纯化后具有很好的免疫学活性 , 为进一步
开展热带和亚热带致敏花粉变应原诊断和免疫治疗
奠定了基础。
1 材料与方法
1.1　材料　RNA 提取试剂为 Qiagen 公司产品;
AMV First St rand cDNA Synthesis Kit 购于 BBI
公司;DNA 胶纯化试剂盒购于 OMEGA 公司;
pMD18-T 载体 、 Ex-T aq酶 、 cDNA 末端快速扩增
试剂盒(3 -Full RACE Core Set )、 限制性内切酶
Nde I与 Xho I 、 T4连接酶都购于 T aKaRa 公司;
原核表达载体 pET-28a 及大肠杆菌 E.col i BL21
(DE3)均为 Invit rogen公司。本研究所用的血清来
自于有重阳木花粉过敏史的患者 。所有患者血清都
由海口市人民医院提供并储存于-80 ℃备用 。
1.2 　简并引物的设计 　从 SWISS-PRO T 和
TrEMBL(www.expasy.org)以及 NCBI(www .nc-
·385·《现代免疫学》 2008 年第 28 卷第 5 期
bi.nlm.nih.gov)的 GenBank 等数据库下载到 67
例植物性食物 profi lin 的核酸序列 。利用 Clustal
W程序对这些序列进行同源性比较 , 确定其保守
区域 。根据这些保守区域的序列 , 设计并合成简并
引物(由上海生工合成):p83:5 -A TG TCG TGG
CAG GCG TAC GT-3 ;p84 :5 -CAA CAA (C/
T)CAT GT T GCA (T/C)T TG TCC -3 。
1.3　总 RNA的提取和 RT-PCR 取新鲜重阳木花
粉于液氮中充分研磨 , 称取大约 100 mg , 转入
RNase Free离心管中 , 提取过程按照 Qiagen 公司
试剂盒说明书进行。采用 BBI 公司 AMV First
S t rand cDNA Synthesis Kit , 以总 RNA 为模板进
行逆转录合成第一链 。从合成的 cDNA 第一链产
物中取 2 μl为模板进行 PCR反应。反应体系为 50
μl:10 ×buffe r 5 μl , 10×dN TP 4 μl , ddH 2O 35.
75 μl , 引物 p83 为 1 μl(50pmo l/μl), 引物 p84 为
2 μl(50pmol/μl), 0.25 μl Ex-Tag 酶。PCR反应
程序为:95℃3 min 后用 Touchdown 方式进行扩
增 , 第一个循环为 94 ℃45 s , 65 ℃45 s , 72 ℃2
min , 此后每个循环的退火温度下降 1 ℃ , 当退
火温度下降到 57 ℃时 , 则以 94 ℃45 s , 57 ℃ 45
s , 72 ℃2 min运行 35个循环 , 再于 72 ℃延伸 10
min结束 。电泳检测 PCR产物 , 并切胶回收。
1.4　RT-PCR产物的 T/A克隆和测序 回收纯化
的 RT-PCR产物与pMD18-T Vecto r进行连接 , 并
转入 E.col i Top 10 中。通过含氨苄青霉素
(Amp)、 X-G al和 IPTG 的 LB 平板进行蓝白斑和
抗氨苄筛选 , 并进行菌落 PCR验证 。阳性菌落进
行序列测定(上海生工完成)。
1.5　序列分析与同源性比对 将测序所得序列通
过GenBank进行序列比对 , 同时推导其相应氨基
酸序列 , 对该蛋白质的等电点和分子量利用在线程
序 Compute pI/Mw tool(ht tp://www .expasy .
org/ tools/pi too l.html)进行评估 。利用在线程序
CLUSTA L W (ht tp ://www.ebi.ac.uk/clust-
alw/)将所得克隆与来自不同材料的泛变应原 pro-
f ilin基因进行多序列比对 , 分析其序列同源性 。
1.6　构建重组表达质粒 提取阳性菌落质粒 , 所
得质粒与原核表达载体 pET28a分别进行 Nde I 和
Xho I双酶切 , 并将获得的基因片段与 pET28a 的
酶切产物相互连接 , 构建重组表达质粒 。以重组质
粒转化大肠杆菌 Top10 , 菌落 PCR鉴定 , 提取阳
性质粒 , 进行双酶切鉴定 , 阳性克隆经测序鉴定后
转入大肠杆菌 E.coli BL21(DE3)用于诱导表达。
1.7　表达和纯化重组重阳木 prof ilin 挑取单菌落
培养过夜 , 按 5%比例接种于 1 000 ml LB培养基
(含卡那霉素 50 μg/ml), 37 ℃培养至菌液的 D600
达到 0.6 时 , 加 IPTG 至终浓度为 1 mmol/ L , 诱
导表达过夜 。离心收集菌体 , 重悬于 20 mmo l/L
Tris-HC l(pH 7 .5)。三次冻融后超声波破菌。然
后于 4 ℃, 15 000×g离心 15 min , 收集上清。装
好 Chela ting Sepharo se 柱 , 按常规上 Ni2+ 、 用平
衡缓冲液(0.02 mol/ L Tris-HCl , pH 7.5)平衡层
析柱 , 上样品 , 平衡至基线后 , 用 200 mmol/L 咪
唑洗脱 , 收集洗脱峰 , 对含目标蛋白的洗脱组分进
行透析并冻干保存 。
1.8　IgE免疫印迹实验 重组重阳木花粉 pro filin
进行 SDS-PAGE 电泳 , 然后电转到硝酸纤维素膜
上 , 取下膜用 2 %牛血清白蛋白(BSA)4 ℃封闭过
夜;与 1:5稀释的过敏病人阳性血清 37℃孵育 2
小时;加入经 TBS T(TBS/0.05% Tween-20)稀释
(1:3000)生物素标记的抗人 IgE抗体 , 37℃孵育
2h ;再加入经 TBST 稀释(1 :1000)的 HRP 标记
的链霉亲和素 , 37 ℃孵育 1 .5h ;以上每个步骤进
行完后都用 TBS T 洗 3次(5min/次)。将膜放入新
鲜配制的二氨基联苯胺(DAB)底物溶液中显现 ,
双蒸水洗涤终止显色反应 , 观察结果 。
2 结果
2.1　RT-PCR产物与 TA克隆的测序与鉴定 提取
重阳木花粉总 RNA , 用设计好的简并引物进行
RT-PCR扩增 。扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳
(图 1), 可见到一个大约为 400bp的清晰条带 , 大
小与预期结果相同 。
图 1　RT-PCR扩增结果
1.DNA 分子量标准;2 、3.引物 p83和 p84 RT-PCR扩增产物
将 RT-PCR产物与 pMD18-T Vector 连接后转
化 E.coli Top10。阳性菌落进行测序 , 测序结果用
·386· 《现代免疫学》 2008 年第 28卷第 5期
NCBI中的 BLAS T 程序进行序列同源性分析 , 发
现它们与 GenBank 中已知的花粉和植物源性食物
的肌动蛋白抑制蛋白序列有很高的同源性 , 只是所
得克隆并非全长基因 , 这与预期结果一致。因为在
设计引物时 3 末端有约 30个碱基未能包括其中。
2.2 3 -RACE及全长基因的获得 根据测序结果
设计特异性引物进行 3 -RACE , 扩增的产物进行
琼脂糖凝胶电泳(图 2), 可见到一个大约为 500 bp
的清晰条带 , 回收后连接入载体并转化 E.coli
Top 10。选取阳性克隆进行测序 。将测序结果与非全
长序列进行拼接后得到重阳木花粉泛变应原 profilin
的全长序列(图 3)。
图 2　3 -RACE扩增结果
1.DNA 分子量标准;2～ 5.3 -RACE扩增产物
图 3　重阳木花粉 profilin cDNA序列及推导的氨基酸序列
2.3 表达载体的构建及鉴定 提取经菌落 PCR
鉴定为阳性的重组表达质粒 , 进行 Nde 和 Xho 双
酶切和琼脂糖凝胶电泳分析(图 4)。载体片段约为
5 000 bp , 插入的重阳木花粉 profilin 的基因片段
396 bp , 同预期的大小一致。对阳性克隆进行
DNA 序列测定 , 以确保插入的片段准确无误 。所
构建的重组质粒包括重阳木花粉 prof ilin的完整编
码序列(包括起始密码子和终止密码子)。
2.4　表达和纯化重组重阳木花粉 prof ilin 将鉴定
为阳性的重组表达质粒转入大肠杆菌 E.coli BL21
(DE3)进行诱导表达。37 ℃经 IPTG 诱导过夜获得
图 4　重组表达质料 pET28a/ proff ilin的双酶切鉴定
1.DNA 分子量标准;2 、3.重组质粒 pET 28a/ p rof ilin 经
Nde I and Xho I 双酶切
·387·重阳木花粉相关变应原 pro filin 基因的克隆 、 表达及免疫学鉴定
重组的蛋白 , 表达蛋白进行 SDS-PAGE 电泳 , 考
马斯亮蓝染色显示在14 kD左右处有外源蛋白表达
条带出现 , 蛋白分子量与预期结果相符 。破碎菌体
后分别取上清和沉淀进行可溶性分析 , 结果显示 ,
表达的重组蛋白主要分布在上清中。利用 Ni2+柱
亲和层析的方法纯化重组蛋白 , 收集峰液 , SDS-
PAGE分析发现用 200 mmol/L 咪唑洗脱的峰中含
有大量高纯度的目的蛋白(图 5)。
图 5　重阳木花粉 prof ilin在大肠杆菌中的诱导表达及纯化
A:洗提液片段; A1:洗脱峰; f ract ion A2: 200 mmol/ L 咪唑
洗脱峰;B: SDS-PAGE凝胶 , M .蛋白质分子量; 1.诱导前;
2.诱导后; 3.纯化重组 profi lin
2.5　重组重阳木花粉 prof ilin的免疫学活性 重组
重阳木花粉prof ilin进行 SDS-PAGE电泳后 , 经电
转移到 NC膜上 , 用重阳木花粉过敏的患者血清作
一抗 , 进行Western blo t印迹检测 。对重组重阳木
花粉 prof ilin的免疫学活性进行检测 , 结果在大约
14 kD处有一明显的识别条带 , 说明重组重阳木花
粉 pro filin具有良好的 IgE结合活性 。
3 讨论
过敏性疾病是当前世界性的重大卫生学问题之
一。在引起过敏反应的变应原中 , 花粉变应原是导
致呼吸道变态反应性疾病的主要因素之一。由于吸
入飘散在大气中的花粉 , 大约有 20%的人会引发
IgE介导的过敏性哮喘 、 过敏性鼻炎等疾病[ 6] 。
据孟光(2006)报道重阳木花粉是海南引起过敏
性疾病最主要的吸入性过敏原[ 7] 。目前 , 国内临床
仍使用该花粉的粗浸液对花粉症患者进行诊断和脱
敏治疗 , 但粗浸液的组分非常复杂 , 难以纯化和标
准化 , 且容易引起诊断假阳性及过敏反应。现有的
研究结果表明 , 只要恰当地确定构成组分及各组分
的含量 , 重组变应原混合物的抗原性可与其天然提
取也几乎完全相同[ 8] , 因此重组变应原是当今乃至
未来变态反应学的重要研究方向 。
重组变应原疫苗具有纯度高 、 无杂蛋白 、 易
标准化 、 无外源性毒性物质和病原微生物污染的优
势。而且 , 目前体外试验及皮肤试验的结果显示 ,
大部分重组变应原的变应原活性与天然变应原相
当 , 如由大肠杆菌所表达的重组变应原 DerP2 的
IgE 抗体反应与纯化的天然 DerP2 无差别[ 9] 。因
此 , 重组变应原被认为是诊断和治疗过敏性疾病的
有效手段[ 10] 。在过去几年中 , 国外已完成克隆
cDNA测序的花粉变应原达 30多种 , 而且部分重
组花粉变应原已用于临床诊断[ 11] 。
本研究的目的是对重阳木花粉中的 profi lin进
行克隆 、 表达和纯化 , 并对重组 pro filin蛋白免疫
学活性鉴定。为了对其进行表达 , 将重阳木花粉
profi lin 的整个开放阅读框与原核表达载体 pET28
(a)连接 , 在大肠杆菌 E.coli BL21(DE3)中经
IPTG 诱导进行表达。经可溶性分析发现 , 表达的
蛋白主要分布在上清中 , 这就省略了包涵体变复性
的复杂过程 , 方便了蛋白的纯化。上清经 Ni2+亲
和柱进行纯化即可得到了大量的重组重阳木花粉
profi lin 。
本研究利用简并性引物 , 结合 RT-PCR和 3 -
RACE 技术 , 成功地表达了重阳木花粉 profi lin ,
经纯化后具有很好的免疫学活性 , 为进一步开展热
带和亚热带致敏花粉变应原诊断和免疫治疗的深入
研究奠定了基础。
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Cloning and expression of gene encoding pollen allergen profilin protein
from Bischo f ia polycarpa and its immuological activities
YAO Min
2 , LIU Zhi-gang 1 , WU Yu-lan1 , MENG Guang2 , LI Chun-lin2(1.A llergy and Immunology
I nst itute , ShenzhenUniversity , S henzhen 518060 , China;2.Haikou People s Hospi tal , Haikou
570208 , China)
Abstract:The complete sequence o f the open reading fr ame(ORF)w as obtained by RT-PCR and 3 RACE technique , linked
to expression vector pET28a and then tr ansfo rmed to E.coli BL21(DE3)for induction expr ession.The recombinant pro tein ex-
pre ssed w as identified through Ni + affinity chr omatog raphy and its I gE-binding activity w as a ssayed by Western blo tting.I t
was found that the complete sequence of ORF fo r pro filing gene consisted of 396 ba se pair s(including the stop codon)coding
131 amino acids.In addition , the recombinant pr ofilin pro tein could react specifically with ser a of patients aller gic to pro filin
protein fr om B.poly car pa indicating the specific IgE-binding activity o f the recombinant pr ofiling pro tein.
Key words:Bischo f ia polycarpa pollen; po llen aller gy; profilin; r ecombinant allerg y
·389·重阳木花粉相关变应原 pro filin 基因的克隆 、 表达及免疫学鉴定