全 文 ：第 32 卷 第 3 期
2010 年 5 月
北 京 林 业 大 学 学 报
JOURNAL OF BEIJING FORESTRY UNIVERSITY
Vol. 32，No. 3
May，2010
收稿日期:2009--04--02
基金项目:“948”国家林业局引进项目(2003--4--05)。
第一作者:李玲莉，博士生。主要研究方向:林木栽培生理生态。电话:13480252959 Email:linglil009@ 163. com 地址:100083 北京市
清华东路 35 号北京林业大学林学院。
责任作者:郭素娟，教授，博士生导师。主要研究方向:森林培育。电话:010--62338128 Email:gwangzs@ 263. net 地址:同上。李吉
跃，教授，博士生导师。主要研究方向:森林培育及栽培生理生态。电话:020--85280260 Email:ljyymy@ vip. sina. com 地址:510642 广州
市华南农业大学林学院。
本刊网址:http:∥www. bjfujournal. cn;http:∥ journal. bjfu. edu. cn
北美柔枝松组织培养研究
李玲莉1 郭素娟1 李吉跃1，2
(1 北京林业大学省部共建森林培育与保护教育部重点实验室 2 华南农业大学林学院)
摘要:以柔枝松的幼嫩顶芽为外植体，对不定芽的诱导、增殖和生根条件进行筛选。结果发现:在附加 0. 5 mg /L BA
和 0. 1 mg /L NAA 的 SH 培养基中，不定芽的诱导率为 86. 67%;诱导 4 周后，将外植体继代于 SH 基本培养基中，使
不定芽伸长生长;然后，将伸长的不定芽转至含有 2. 0 mg /L BA 的 SH 培养基中进行增殖培养，4 周后，增殖系数为
3. 75;继而在 SH 基本培养基或含有 0. 05%活性炭的 SH 培养基中进行壮苗培养;当不定芽长至 1 ～ 1. 5 cm 时，转入
无植物生长调节剂的 1 /2GD 培养基中进行生根诱导，培养 6 周后，在不定芽基部形成 1 ～ 3 条不定根;炼苗后，植株
在土壤中(V(草炭土)∶ V(蛭石)= 1∶ 1)移栽成活率为 64. 86%。
关键词:柔枝松;不定芽诱导;不定芽增殖;生根
中图分类号:S791. 24;S722. 3 + 7 文献标志码:A 文章编号:1000--1522(2010)03--0209--04
LI Ling-li1;GUO Su-juan1;LI Ji-yue1，2 . Tissue culture protocol of limber pine of North America.
Journal of Beijing Forestry University (2010)32 (3)209--212［Ch，13 ref.］
1 Key Laboratory for Silviculture and Conservation of Ministry of Education，Beijing Forestry University，
100083，P. R. China;
2 College of Forestry，South China Agricultural University，Guangzhou，510642，P. R. China.
The tender apical bud of limber pine was taken as explant to investigate the induction and
multiplication of adventitious buds and the formation of adventitious roots. It was found that the induction
frequency of adventitious buds was 86. 67% when the tender apical bud was cultured on SH medium
supplemented with 0. 5 mg /L BA and 0. 1 mg /L NAA. Four weeks later， the induced buds were
subcultured on SH basal medium for elongation. Then the elongated shoots were transferred to SH
medium containing 2. 0 mg /L BA for multiplication for 4 weeks，and the number of average buds per
shoot was 3. 75. After cultured on the SH basal medium or supplemented with 0. 05% AC，shoots with a
height of 1--1. 5 cm were transferred on 1 /2 GD medium without growth regulator to induce roots. Six
weeks later，1--3 adventitious roots were formed at the base part of adventitious buds. Finally，the
plantlets were transplanted in soils (peat∶ vermiculite = 1∶ 1)and the survival rate was 64. 86% .
Key words limber pine (Pinus flexilis James);induction of adventitious buds;multiplication of
adventitious buds;rooting
柔枝松(Pinus flexilis James)原产于美国北部，
以枝条柔软而得名。其树型较小，平均胸径为 50. 8
cm，树高 12. 19 m;生长缓慢，需要几百年才能成熟，
寿命长达 1 650 年;成年树的树皮厚达 5 cm，并呈鳞
片状龟裂。它大多生长在开阔、干旱的环境中，特别
是岩石裸露的山区，对风沙和干旱具有很好的抗
性［1
--2］。柔枝松特殊的生长环境注定其成为生态价
值极高的针叶树种之一。目前，柔枝松主要以种子
繁殖，但由于其生长环境较差，种子产量和质量受环
境影响较大，因此，价格十分昂贵。
DOI:10.13332/j.1000-1522.2010.03.016
组织培养作为一种高效的无性繁殖方法倍受人
们的青睐。目前，在我国成功引种的针叶树种中，湿
地松(P. elliottii)、美国黄松(P. ponderosa)和火炬
松(P. taeda)等均建立了完善的组织培养体系［3--5］。
然而，柔枝松作为一种经济价值有限的先锋树种，在
国内外的研究甚少，国内只有马书燕等［1］对其进行
了引种试验，尚未见到关于柔枝松组织培养的研究
报道。本试验以引自北美的柔枝松幼嫩顶芽为外植
体，对其进行组织培养研究，为柔枝松的规模化育苗
及在我国的成功引种奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 外植体的培养
柔枝松种子为 2005 年引种于美国加利福尼亚
的成熟种子。经过 2 周低温层积催芽后，播种于沙
盆中。28 d 后，当种壳完全脱落之时，剪取幼嫩顶
芽作为外植体。外植体的消毒过程为:幼嫩顶芽先
用肥皂水浸泡 20 min，流水冲洗 30 min 后，于无菌
条件下，先用 70%乙醇表面灭菌 30 s 后，无菌水冲
洗 5 ～ 6 次，然后用 15%的 NaClO 消毒 20 min，无菌
水冲洗 5 ～ 6 次，最后接种于不定芽诱导培养基中。
1. 2 不定芽的诱导和增殖
不定芽的诱导试验中采用的 3 种基本培养基分
别为:GD［6］、SH［7］和 MS［8］。培养基中添加 BA
(0. 5、1. 0、2. 0 和 4. 0 mg /L)和 NAA(0. 1、0. 5 和
1. 0 mg /L)进行植物生长调节剂组合试验。每种培
养基均做相同处理，以观察不同培养基和植物生长
调节物质对不定芽诱导的影响。
然后将外植体继代于 SH 基本培养基中，进行
伸长培养。4 周后，对伸长的不定芽进行进一步增
殖培养。采用的培养基为 GD、SH 和 MS 3 种，附加
BA(1. 0、2. 0 和 4. 0 mg /L)和 NAA(0、0. 5 和 1. 0
mg /L)，试验采用 L9(3)
4 正交试验设计。以上试
验，培养基中添加蔗糖 30 g /L、琼脂 7 g /L、pH 5. 8。
每个处理共接种 60 个外植体，重复 3 次。
1. 3 不定根的诱导
不定根的诱导采用 1 /2GD 基本培养基，添加 IBA
(0、0. 5 和 1. 0 mg /L)和 NAA(0、0. 05 和 0. 10 mg /L)，
蔗糖 20 g /L，琼脂 6 g /L，pH 5. 8。试验采用 L9(3)
4
正交试验设计。4 周后，将诱导后的不定芽转入无植
物生长调节剂的 1 /2GD 基本培养基中进行生根诱
导，以观察 IBA 和 NAA 对不定根诱导的影响。
以上所有试验除了不定根的诱导需要暗培养 2 周
外，其他处理均在光照条件下完成，光照时间为 16 h /
d，强度为 50 μmol /(m2·s)，温度为(24 ±2)℃。
1. 4 数据处理
试验获得的数据采用 SPSS13. 0 进行数据的方
差分析和多重比较。多重比较采用 5% 的 Duncan
检验，相同字母表示处理间差异不显著。百分率数
据在反正弦变换后再进行分析。
2 结果与分析
2. 1 不同培养基对不定芽诱导的影响
幼嫩顶芽接种于不定芽诱导培养基中，1 周后
茎段处开始变红，4 周后基部形成愈伤组织，同时子
叶基部和叶腋形成不定芽(见图 1a)。结果表明，
SH 培养基对幼嫩顶芽诱导不定芽作用显著，其诱导
率达 86. 67%，增殖系数为 3. 14(见表 1)。虽然 MS
培养基也有较高的增殖系数，但是幼嫩顶芽更容易
诱导形成愈伤组织，从而大大降低了不定芽的诱导
率，只有 63. 33%。GD 培养基对不定芽的诱导效果
居中，为 83. 71%，与 SH 培养基无显著差异，而增殖
系数最低为 1. 90。
表 1 不同培养基对不定芽诱导的影响
Tab. 1 Effects of different medium on the induction
of adventitious buds
培养基 诱导率 /% 增殖系数
MS 63. 33b 2. 39 ± 0. 23b
GD 83. 71a 1. 90 ± 0. 10b
SH 86. 67a 3. 14 ± 0. 26a
注:GD、SH 和 MS 3 种不定芽诱导培养基中分别添加 0. 5 mg /L BA
和 0. 1 mg /L NAA。同列中不同字母表示在 0. 05 水平上差异显著。
表 2 同此。
3 种培养基的不同表现可能与培养基中的盐离
子浓度相关，特别是 NH +4 和 NO
－
3 的含量。三者的
盐离子浓度从大到小的顺序为:MS > GD > SH。可
见，含有较高盐离子浓度的培养基，对柔枝松不定芽
的诱导产生抑制作用，只有含量适中或偏低的培养
基才有利于针叶植物不定芽的诱导。这在火炬松、
长白落叶松(Larix olgensis)和美国黄松的组织培养
中也有相似的结果［5，9
--10］。
2. 2 不同浓度 BA和 NAA组合对不定芽诱导的影响
方差分析和多重比较结果表明:不同浓度 BA
和 NAA 组合对柔枝松不定芽的诱导有显著影响
(见表 2)。MS 培养基中，9 个组合的不定芽诱导率
和增殖系数间有显著差异。其中，不定芽诱导率和
增殖系数的最大值出现在组合 2 和组合 1，分别为
73. 48%和 2. 39;最小值都出现在组合 6，分别为
43. 06%和 1. 33。GD 培养基中，各植物生长调节剂
组合对不定芽诱导率有显著影响，但是对增殖系数
的影响无显著差异。不定芽诱导率和增殖系数最大
值都出现在组合 1，分别为 83. 71%和 1. 90;最小值
出现在组合 5 和组合 9，分别为 36. 79%和 1. 32，同
时，这也是 3 种培养基中的最小值。SH 培养基中，
不同组合在不定芽诱导率和增殖系数上有显著不
012 北 京 林 业 大 学 学 报 第 32 卷
同。其中，组合 1 的不定芽诱导率和增殖系数均为
最大，分别为 86. 67%和 3. 14，这也是所有培养基中
的最大值;最小值分别为组合 9 的 44. 02%和组合 4
的 1. 60。可见，培养基在不定芽诱导中起决定性作
用，它直接决定了不定芽的诱导和增殖水平。
表 2 不同浓度 BA 和 NAA 对不定芽诱导的影响
Tab. 2 Effects of different concentration of BA and NAA on the induction of adventitious buds
序号
BA + NAA /
(mg·L － 1)
MS GD SH
诱导率 /% 增殖系数 诱导率 /% 增殖系数 诱导率 /% 增殖系数
1 0. 5 + 0. 1 63. 33b 2. 39 ± 0. 23a 83. 71a 1. 90 ± 0. 10a 86. 67a 3. 14 ± 0. 26a
2 1. 0 + 0. 1 73. 48a 1. 92 ± 0. 04bc 79. 12ab 1. 49 ± 0. 26a 66. 67bc 2. 53 ± 0. 07ab
3 1. 0 + 0. 5 54. 50c 1. 73 ± 0. 07cd 72. 58bc 1. 77 ± 0. 07a 76. 67ab 2. 03 ± 0. 14bc
4 2. 0 + 0. 1 53. 37cd 2. 06 ± 0. 06ab 59. 02d 1. 64 ± 0. 10a 78. 70ab 1. 60 ± 0. 10c
5 2. 0 + 0. 5 44. 55de 1. 44 ± 0. 06ef 36. 79f 1. 83 ± 0. 10a 85. 30ab 2. 14 ± 0. 34bc
6 2. 0 + 1. 0 43. 06e 1. 33 ± 0. 04f 57. 88d 1. 52 ± 0. 02a 83. 33ab 1. 72 ± 0. 15c
7 4. 0 + 0. 1 47. 20cde 1. 63 ± 0. 19de 65. 38cd 1. 68 ± 0. 10a 56. 15cd 2. 36 ± 0. 22bc
8 4. 0 + 0. 5 51. 28cde 1. 60 ± 0. 06def 58. 25d 1. 54 ± 0. 13a 70. 33abc 1. 67 ± 0. 18c
9 4. 0 + 1. 0 48. 48cde 1. 87 ± 0. 07bcd 46. 63e 1. 32 ± 0. 10a 44. 02d 1. 61 ± 0. 45c
综上所述，低浓度 BA 和 NAA 组合对不定芽的
诱导具有促进作用。在 3 种培养基中，不定芽的诱
导率和增殖系数的最大值多出现在组合 1 中，其中
以 SH 培养基最大。在其他 BA 和 NAA 浓度较大的
组合中，不定芽的诱导率和增殖系数均低于组合 1，
并伴有最低值出现。可见，附加 0. 5 mg /L BA 和
0. 1 mg /L NAA 的 SH 培养基是柔枝松幼嫩顶芽诱
导不定芽的最佳培养基。
2. 3 不同培养基、BA和 NAA对不定芽增殖的影响
将在不定芽诱导培养基中诱导 4 周的外植体，
继代于 SH 基本培养基中，4 周之后获得大量伸长的
不定芽(见图 1b)。以伸长的不定芽为材料，对其进
行不定芽的增殖诱导，结果见表 3。
表 3 不同培养基、BA 和 NAA 对不定芽增殖的影响
Tab. 3 Effects of different medium，BA and NAA on
the multiplication of adventitious buds
序号 培养基
BA /
(mg·L － 1)
NAA /
(mg·L － 1)
增殖系数
分化
率 /%
1 MS 1. 0 0 1. 17 2. 94
2 MS 2. 0 0. 5 2. 50 6. 90
3 MS 4. 0 1. 0 0 0
4 GD 1. 0 0. 5 1. 40 3. 45
5 GD 2. 0 1. 0 1. 50 3. 23
6 GD 4. 0 0 1. 25 6. 45
7 SH 1. 0 1. 0 0 0
8 SH 2. 0 0 3. 75 40. 00
9 SH 4. 0 0. 5 1. 25 6. 45
K1 9. 84 6. 39 49. 39
K2 13. 13 50. 13 16. 80
K3 46. 45 12. 90 3. 23
x1 3. 28 2. 13 16. 46
x2 4. 38 16. 71 5. 60
x3 15. 48 4. 30 1. 08
R 12. 20 14. 58 10. 86
结果分析表明，各处理对柔枝松不定芽的增殖
效果差异较大，特别是植物生长调节物质的作用更
为明显。根据 R 值判断，培养基、BA 和 NAA 对不
定芽的增殖作用为:BA > 培养基 > NAA。NAA 的 3
个水平中，以不添加 NAA 的诱导效果最好(x1 为
16. 46)。试验观察发现，NAA 诱导不定芽基部能形
成大量愈伤组织，甚至使整个不定芽愈伤化，它对不
定芽的增殖诱导无促进作用。当 BA 浓度为 2. 0
mg /L 时，其 x2 最大为 16. 71。3 种培养基中以 SH
培养基的 x3 最高，为 15. 48。因此，柔枝松不定芽的
最佳增殖培养基配方为附加 2. 0 mg /L BA 的 SH 培
养基，其分化率为 40. 00%，增殖系数为 3. 75，均为
各处理中的最大值。不定芽在最佳培养基中诱导 4
周后产生的增殖芽见图 1c。
2. 4 IBA 和 NAA 对不定根诱导的影响
将增殖培养后的不定芽置于 SH 培养基或含有
0. 05%活性炭的 SH 培养基中，进行伸长培养［3］。
当不定芽长至 1 ～ 1. 5 cm 时，转入生根培养基中，进
行生根诱导。6 周后，不定芽基部便有不定根形成
(见图 1d)。
由表 4 可知，无植物生长调节剂处理 1 的生根
率最高，达 11. 67%。处理 4 和 7 中，不定芽的基部
会形成类似于根原基的白色突起，但是这些突起很
难伸长生长。虽然处理 6、处理 8 和处理 9 也有不
定根发生，但是在 NAA 和 IBA 的诱导下，不定芽的
基部会形成大量愈伤组织，许多畸形的不定根从这
表 4 NAA 和 IBA 对不定根诱导的影响
Tab. 4 Effects of NAA and IBA on the induction
of adventitious roots
序号
NAA /
(mg·L － 1)
IBA /
(mg·L － 1)
外植体数 生根数
生根
率 /%
1 0 0 60 7 11. 67
2 0 0. 5 60 0 0
3 0 1. 0 60 0 0
4 0. 05 0 60 3 5. 00
5 0. 05 0. 5 60 0 0
6 0. 05 1. 0 60 1 1. 67
7 0. 10 0 60 2 3. 33
8 0. 10 0. 5 60 2 3. 33
9 0. 10 1. 0 60 1 1. 67
112第 3 期 李玲莉等:北美柔枝松组织培养研究
a.幼嫩顶芽诱导产生的不定芽;b.伸长生长的不定芽;c.不定芽的增殖;d.生根的不定芽;e.移栽成活的再生植株
图 1 北美柔枝松组织培养再生过程
Fig. 1 Regeneration of limber pine
些愈伤组织上产生。当不定根形成时，不定芽开始
干枯死亡，这在巴尔干松(P. heldreichii)的研究中
也有发生［11］。可见，IBA 和 NAA 对柔枝松不定根
的诱导作用不大，在某种程度上，他们对柔枝松正常
不定根的诱导产生了抑制作用。
在无植物生长调节剂处理的 1 /2GD 培养基上，
不定芽培养 6 周之后，基部形成 1 ～ 3 根正常的不定
根。当不定根长至 3 cm 左右时，在室温下培养 7 d
后，移栽至混合基质(V(草炭土)∶ V(蛭石)= 1∶ 1)中
培养，移栽成活的植株见图 1e。本试验，移植了 37 棵
组培苗，当组培苗长出针叶或形成顶芽时，进行成活
率统计，发现有 24 棵成活，成活率为 64. 86%。
3 结论与讨论
本试验首次建立了柔枝松的组织培养体系:诱
导培养基为 SH 基本培养基附加 0. 5 mg /L BA 和
0. 1 mg /L NAA;增殖培养基为 SH 基本培养基附加
2. 0 mg /L BA;在 SH 基本培养基或含有 0. 05%活性
炭的 SH 培养基中壮苗培养后，于 1 /2GD 基本培养
基中进行生根培养。
在针叶树种的组织培养中，细胞分裂素 BA 对不
定芽的诱导效果最佳。在巴尔干松［11］和弗吉尼亚松
(P. virginiana)［12］不定芽诱导时，单独使用 BA 即可
获得大量的不定芽。而在火炬松［5］、马尾松(P.
massoniana)［13］和湿地松［3］不定芽诱导时，BA 和
NAA 或 IBA 配合使用时，诱导效果最佳。BA 的单独
使用或与其他植物生长调节剂配合使用，可能与试验
选用的外植体种类相关［3］。另外，BA 和 NAA 在用量
上有较大变化，这不仅与培养的植物材料相关，还与
培养的阶段及培养目的相关。因此，不同植物的组织
培养在 BA 及 NAA 的用量上，有较大区别。
IBA 和 NAA 作为诱导不定芽生根的主要植物
生长调节剂，被广泛地用于植物的无性繁殖。他们
单个或配比使用，均视植物材料的不同而不同。试
验发现，IBA 和 NAA 对柔枝松不定根的诱导效果不
明显，可能与诱导时间和诱导强度有关，仍需进一步
研究。同时，柔枝松的不定芽在无植物生长调节剂
的 1 /2GD 培养基中，能诱导出正常不定根。虽然生
根率只有 11. 67%，说明柔枝松不定芽的诱导生根
有别于其他针叶树种，其最佳的不定根诱导配方仍
需进一步研究。
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(责任编辑 董晓燕)
212 北 京 林 业 大 学 学 报 第 32 卷