全 文 ：·药理学 ·
荛花酚对 H2 O2 和兴奋性神经递质诱导的大鼠皮层神经元细胞损伤的
保护作用
叶　莉 ,祝德秋 ,叶显撑(上海市同济医院 ,上海 200065)
[作者简介 ] 　叶　莉(1975-),女 , 药学本科 , 学士 ,药师.Tel:(021)
66111239, E-mail:kisszhou@yeah.net.
　　[摘要 ] 　目的　从中药祖师麻中发现有效的神经保护成分 , 阐明其治疗神经退行性疾病的药效物质基础。方法　使用
体外培养的大鼠皮层神经元细胞作为筛选系统 ,综合运用各种色谱技术进行活性跟踪指导下的分离 ,对发现的活性成分在体
外细胞水平研究其神经保护机制。结果　我们发现中药祖师麻的甲醇提取物可显著地减轻由谷氨酸(L-glutamate)、海人藻酸
(kainicacid, KA)和过氧化氢(H2O2)诱导的大鼠皮层神经元细胞损伤。从祖师麻中分离纯化了一系列化合物 ,其中活性最强
的是荛花酚(wikstromol)。荛花酚在 50 μM的浓度下可显著地降低 H2O2诱导的细胞损伤。荛花酚显著地减少了细胞内谷胱
甘肽 、超氧化物歧化酶等抗氧化物质的下降 , 并减轻由兴奋性神经递质(谷氨酸 、海人藻酸)诱导的神经毒性损伤 ,但不能减轻
由 N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)诱导的神经毒性损伤。结论　本研究确证了荛花酚可作为一种天然神经细胞保护剂 , 推测其
神经保护机制可能是通过抗氧化作用实现的。
[关键词 ] 　荛花酚;皮层神经元细胞;过氧化氢;谷氨酸;海人藻酸;N-甲基-D-天冬氨酸
[中图分类号 ] 　R285.5　　　[文献标志码 ] 　A　　　[文章编号 ] 　1006-0111(2010)03-0189-05
Theprotectiveeffectofwikstromolonculturedcorticalneuronsinducedby
H2O2 andexcitatoryneurotransmitter
YELi, ZHUDe-qiu, YEXian-cheng(ShanghaiTongjiHospital, Shanghai200433, China)
[ Abstract] 　Objective　Toidentifythematerialbasisofthenovelneuroprotectivecompoundsfromtraditionalchinesemedicine
Daphnegiraldiinthetreatmentofneurodegenerativedisorders.Methonds　Activity-guidedfractionationofseveralchromatographic
techniqueswereusedfortheisolationoftheneuroprotectivecompounds.Theculturedcorticalneuronsofratswereusedasscreening
system.Results　ThemethanolicextractfromdriedrootsofDaphnegiraldisignificantlymitigatedtheneurotoxicityinducedbyL-gluta-
mate, kainicacidandH2O2inthisscreeningsystem.Theneuroprotectivecompoundwasidentifiedaswikstromol.Ataconcentrationof
50 μM, wikstromolsignificantlyreducedneurotoxicityinducedbyH2O2.Wikstromolsignificantlyreducedthedecreaseofglutathione,
superoxidedismutase, andotherenzymesthatparticipateinthecelulardefenseagainstoxidativestress.Furthermore, wikstromolalle-
viatedneurotoxicityinducedbytheexcitotoxicneurotransmiter, L-glutamateandkainicacid, butnotthatmediatedbyN-methyl-D-as-
partate.Conclusion　Wikstromolwasdemonstratedtobeeficaciousinprotectingneuronsfromoxidativestress.Theneuroprotective
mechanismofwikstromolmayduetoitsantioxidantefect.
[ Keywords] 　wikstromol, corticalcells;H2O2;glutamate;kainicacid;N-methyl-D-aspartate
　　在老年痴呆 、帕金森病等很多中枢神经系统的
神经退行性疾病过程以及脑缺血和老化过程中多伴
有氧化损伤发生 [ 1 ～ 4] 。大脑易受氧化损害可能与它
耗氧率高 、出现高水平的脂肪过氧化反应的底
物 ———多不饱和脂肪酸 、以及高反应性自由基有关 。
具有神经毒性的氧的形式包括过氧化氢(H2O2)、超
氧阴离子(O2-· )和羟基 (OH· )。最近有报告提
示 ,在老年痴呆中 H2O2可能介导 β -淀粉样蛋白诱
导的神经毒性[ 5] 。哺乳动物的大脑中存在细胞内
抗氧化成分 ,包括还原型谷胱甘肽 (GSH)、谷胱甘
肽过氧化物酶(GSH-px)、过氧化氢酶和超氧化物歧
化酶(SOD),它们发挥抗氧化保护作用 ,负责应对
H2O2蓄积 ,减轻反应性氧造成的损伤 [ 6, 7] 。
很多中药在民间用于治疗多种神经退行性疾
病。但是 ,缺乏科学研究对这些中药进行系统的活
性成分筛选。为了找到这些药物的活性成分 ,我们
建立了大鼠皮层神经元体外筛选模型 ,用于研究缺
血性损伤和由谷氨酸或氧自由基造成的直接损伤。
在这一模型中 ,神经元同下列物质共同孵育时会导
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致神经元损伤:①L-谷氨酸;②NMDA;③KA;④
H2O2。
笔者对原代培养的大鼠皮层细胞的初步研究表
明 ,祖师麻甲醇提取物可以减轻 H2O2导致的氧化
损伤 ,然后利用色谱分析技术从祖师麻中分离并鉴
定出神经保护成分荛花酚 。在培养的大鼠皮层细胞
中 ,荛花酚可以显著降低 H2O2导致的神经毒性 ,且
荛花酚还可以通过显著降低谷胱甘肽 、超氧化物歧
化酶 、与谷胱甘肽通路有关的酶来保护皮层神经元 。
更令笔者感兴趣的是 ,荛花酚还通过对抗谷氨酸和
KA介导的神经毒性来保护神经元细胞 ,但其具体
机制不明。
1　材料
DMEM,胎牛血清和 Hanks平衡盐溶液购自上
海明睿生物技术有限公司 。丙酮酸钠 、青霉素 /链霉
素 、胰蛋白酶 、 MTT、 4-乙烯基吡啶购自 Sigma-
Aldrich公司 。其它化学试剂购自上海国药集团化
学试剂有限公司 。
2　方法
2.1　神经保护成分的提取和分离　祖师麻药材用
80%甲醇提取 ,再用石油醚 、氯仿 、正丁醇依次萃取 。
氯仿层反复上色谱柱(用 CHCl3 -MeOH洗脱)得到
单体化合物 ,化合物结构通过高分辨质谱和一维核
磁共振(1HNMR, 13CNMR)确定为荛花酚(wikstro-
mol)[ 8] ,结构式见图 1。 HPLC分析显示化合物纯
度 >98%。
图 1　荛花酚的结构
2.2　皮层细胞的培养　依据 Kim报道的方法 [ 9] ,
包含神经胶质和神经元的混合皮层细胞取自 17 ～
19 d龄的胎鼠(大鼠)。将皮层细胞以 1×106个细
胞 /ml的密度置于覆盖有胶原蛋白的培养皿内 ,培
养液为 DMEM、10%的热灭活的胎牛血清 、1 mM丙
酮酸盐 、双抗(100 IU/ml的青霉素和 100 mg/ml的
链霉素)。培养温度 37 ℃, 95%空气 , 5% CO2。预
实验显示 ,皮层细胞培养少于 10 d,谷胱甘肽 、超氧
化物歧化酶和其他参与抗氧化损伤的酶还不够成
熟;培养超过 14 d,谷氨酸受体不能完全表达 。因
此 ,实验中皮层细胞培养时间确定在 10 ～ 14d。
2.3　神经毒性的评估　将荛花酚溶解在 DMSO中
(DMSO在培养液中的最终浓度为 0.1%)。评估荛
花酚对抗 H2O2导致的氧化损伤的神经保护活性 ,
采用培养 10 d的胎鼠皮层细胞 ,将荛花酚加入皮层
细胞培养基 ,预处理 1 h,然后暴露在 50 μMH2O2
之下 ,再维持 3 h。评估荛花酚对抗兴奋性毒素(L-
谷氨酸 、海人藻酸 、NMDA)导致的损伤 ,采用的是培
养 14 d的皮层细胞 ,将荛花酚加入皮层细胞培养
基 ,预处理 1 h,再暴露于 50μML-谷氨酸 3 h,或 50
μMkainate3h,或 100 μMNMDA15min,然后洗去
兴奋性毒素。再将皮层细胞置于含有化合物的
DMEM中 24 h。神经元的存活能力用 MTT法测量 ,
该方法可反映线粒体酶的功能。化合物活性强度用
实验组细胞与对照组细胞存活能力的比值表示。细
胞存活能力的计算方法是 OD(H2O2 +荛花酚处理
组)-OD(H2O2处理组)/[ OD(空白对照组) -
OD(H2O2处理组)] ×100。
2.4　抗氧化酶的测定　处理结束的皮层细胞用超
声裂解 , 4℃ 3 000g离心 30 min。上清液由细胞质
和线粒体组成 ,可用于测定抗氧化酶活性。超氧化
物歧化酶的活性用黄嘌呤 /黄嘌呤氧化酶反应测定。
在 200 ml底物溶液(0.2 mM羟胺次黄嘌呤)和蒸馏
水中加入 200ml上清液 ,在 37 ℃条件下 ,同黄嘌呤
氧化酶共同孵育 30 min。加入含有 300mg/ml对氨
基苯磺酸 、5 mg/mlN-α-萘二胺和 16.7%乙酸的试
剂终止反应。在 550 nm下测量吸光率 。活性单位
依照以人红细胞酶为标准的 SOD标准曲线测定 。
谷胱甘肽过氧化物酶在细胞上清液中的活性测
定方法是:通过氢过氧化异丙基苯计算被氧化的还
原型谷光甘肽(GSH)和氧化型谷光甘肽(GSHG)的
比例 ,这一反应是由谷光甘肽过氧化酶(GSH-px)催
化的 。这一测定方法以测量 340 nm吸光度的减少
量确定 NADPH转化为 NADP。过氧化氢酶活性的
测定根据 Beers和 Sizer建立的基于 H2O2分解的方
法 ,在装有磷酸盐缓冲液和 H2O2的试管中加入 200
ml的上清液 。在 240 nm条件下记录分解率 。 1个
单位等于消耗 1 μmolH2O2 /(min· mg)蛋白质。
GSSG-R的活性测定在 340 nm的条件下进行 , 以
GSSG-R和 NADPH导致的 GSSG下降为基础 。
2.5　GSH和 MDA的测定　GSH的水平通过酶循
环的方法用分光光度计测定。测定 GSSG时 ,首先
通过与 4-乙烯吡啶反应从上清液中去除 GSH。
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MDA的测定通过改良的硫代巴比土酸法 。光谱化
学光度吸收的测定条件是 535nm, MDA的浓度根据
1, 1, 3, 3-氯化四乙铵标准曲线测定。
2.6　蛋白质测定　蛋白质含量通过 Lowry报道的
方法测定[ 10] ,以小牛血清白蛋白为标准 。
2.7　统计学分析　数据评价采用 SPSS计算机统计
包进行 ,方法为方差分析 。统计学阳性结果的可信
水平为≤0.05。
3　结果
在浓度为 1 ～ 100μM时 ,荛花酚可以保护神经
元抵抗 H2O2导致的毒性损伤 ,且其神经保护作用
呈现较好的量效关系(图 2)。在浓度为 50M时 ,荛
花酚最为有效。
图 2　不同浓度的荛花酚对 H2O2损伤的原代
培养的大鼠皮层神经元细胞存活率的影响
1)P<0.05;2)P<0.01。
荛花酚可显著提高 SOD、过氧化氢酶和 GSH-px
的活性 。SOD的结果为(单位 mU/ml):对照组 50.2
±4.1;H2O2-处理组:20.5±3.1;H2O2 +荛花酚组
32.8±3.2;P<0.01;n=3。过氧化氢酶的结果为
(单位为 μmolH2O2 consumed/(min· mg)protein):
对照组 39.2±4.2;H2O2 -处理组 19.1±5.1;H2O2
+荛花酚组 28.5±2.1;P<0.01;n=3。 GSH-px
的结果为 [单位为 μmolNADPHconsumed/(min·
mg)protein] :对照组 17.0 ±2.7;H2O2处理组 7.2
±0.9;H2O2 +荛花酚组 10.3±0.5;P<0.05;n=
3。但是 ,荛花酚对 GSSG-R的活性没有保护作用
(数据略)。
另外 ,在 50 μM的浓度下 ,荛花酚可以显著提
升 GSH的水平 ,并降低 H2O2损伤的皮层细胞中生
成 MDA的水平。 GSH测定结果为 (单位 mol/mg
protein):对照组 6.7±0.9;H2O2处理组 1.9±0.5;
H2O2 +荛花酚组 3.4±0.4;P<0.05;n=3。 MDA
测定结果为 (单位 nmol/mgprotein):对照组 70.4±
5.4;H2O2处理组 180.4±4.3;H2O2 +荛花酚组:
114.2±11.2;P<0.01;n=3。
我们还通过实验测定了荛花酚化合物本身的抗
氧化强度。结果发现荛花酚在体外可以显著清除过
氧化氢。在没有细胞的培养物中 ,将 H2O2(50 μM)
直接与荛花酚(50 μM)反应 1h,利用过氧化氢酶测
试 ,结果 H2O2的浓度下降 40%。
荛花酚显著保护皮层细胞不受谷氨酸的神经毒
性损伤 ,实验结果显示荛花酚可以对抗由海人藻酸
诱导的神经元损伤 ,但不能应对由 NMDA导致的神
经元损伤(图 3)。
4　讨论
笔者以前曾利用原代培养大鼠皮层细胞 ,进行
体外测定的方法从天然产物中分离具有对抗氧化损
伤 、发挥神经保护作用的化合物 。神经保护活性最
初是通过评估经过 H2O2处理后培养的皮层细胞神
经元的存活率来确定的 。初步研究中通过相差显微
镜检查 ,笔者观察到在没有神经保护性化合物的情
况下 ,暴露在 50 μMH2O2 3 h后 , 95%的皮层神经
元都已死亡 ,而非神经元细胞的存活率则不受影响。
预实验表明 ,祖师麻的甲醇提取物可以减轻 H2O2
导致的氧化损伤。利用色谱分析技术 ,进一步对祖
师麻的甲醇提取物进行活性指导下的分离 ,发现了
具有神经保护作用的化合物荛花酚。本研究显示 ,
从祖师麻中分离出的荛花酚可以保护培养的神经
元 , 降低 H2O2和谷氨酸对其造成的损伤 ,提高神经
元存活率 。
H2O2是著名的细胞毒素 , 具有很强的透膜能
力。因为大脑的氧利用度很高 ,而且神经系统的细
胞内含有大量的多不饱和脂肪酸 ,所以中枢神经系
统神经元特别容易受到氧化损伤。但是 ,大脑在细
胞内也有对氧化损伤的防御系统 。该系统包括几种
高活性的抗氧化物质(例如 GSH)和抗氧化酶 (例
如过氧化氢酶 , SOD, GSH-px, 和 GSSG-R)。 GSH
和 GSH-px在清除大脑内过多 H2O2中发挥重要作
用[ 6 ～ 11] 。有研究表明星型胶质细胞含有高浓度的
GSH和抗氧化酶 ,提示星型胶质细胞可能保护神经
元不受氧化损伤[ 12, 13] 。我们的研究显示 ,荛花酚可
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以保护皮层神经元 ,使受 H2O2损伤的皮层神经元
的还原型谷光甘肽水平和抗氧化酶的活性不会明显
下降。因为笔者使用的皮层培养物中既含有神经
元 ,也含有胶质细胞 ,所以无法确定荛花酚是否直接
提高了神经元的抗氧化损伤活性 ,推测荛花酚的抗
氧化损伤作用可能部分是由星形胶质细胞介导的。
脑缺血 、癫痫 、创伤 、痉挛和一些神经退行性疾
病中发生神经元凋亡 ,都有谷氨酸的神经毒性的作
用 。谷氨酸神经毒性的急性表现形式是由 Na+和
K+进入神经元引起细胞肿胀以至死亡。由 NMDA/
AMPA/海人藻酸等激动剂导致的迟发性神经元退
行性病变是 Ca2+依赖性的 ,要求短时暴露在高浓度
的 Ca2+或长时间暴露在低浓度的 Ca2 +。还有几种
信号通路也参与了谷氨酸诱导的神经元凋亡 ,例如
花生四烯酸以及超氧化物阴离子 (O2-· )、羟基
(OH· )和 H2O2等氧自由基的释放。这为进一步
荛花酚抗谷氨酸诱导的神经元损伤作用的机制提供
了思路 。
现在 ,荛花酚细胞内和分子水平的作用机制还
不完全清楚 。但是 ,结果显示该化合物对培养的皮
层神经元具有显著地神经保护作用 ,该作用至少部
分是通过抗氧化作用实现的。天然产物可以减轻
H2O2或谷氨酸导致的神经毒性 ,这可能会为治疗氧
化损伤导致的神经退行性疾病提供一个有用的治疗
方向。
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[收稿日期 ] 　 2009-12-21
[修回日期 ] 　 2010-03-15
《药学实践杂志 》2010年第 3期继续教育试题答题卡
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