全 文 ：中国耳鼻咽喉头颈外科/2012年4月，第19卷，第4期
CHIN ARCH OTOLARYNGOL HEAD NECK SURG/April 2012, Vol.19, No.4 175
刘环海，廖建春，赵舒薇，吴建，彭浒，纪振华，范静平
（上海长征医院耳鼻咽喉头颈外科，上海　200003）
线粒体参与荛花酚诱导人鼻咽癌CNE细胞凋亡机制
基金项目：上海市科委自然科学基金项目（09ZR1410000）
第一作者简介及通讯：刘环海，男，医学硕士，主治医师，主要研
究方向为头颈部肿瘤的诊治。　
Email：liuhuanhaiok@sina.com
通讯作者：廖建春（Email：abliaojc@163.com）
[摘　要]　目的　探讨荛花酚诱导人鼻咽癌CNE细胞（简
称CNE细胞）凋亡的效应，初步探索其与线粒体相互作用
的机制。方法　以不同浓度的荛花酚作用于CNE细胞，
MTT检测分析荛花酚对细胞增殖的影响，Annexin V/PI双
标后流式细胞仪检测凋亡情况，Western blot检测凋亡相关
蛋白（caspase-3、caspase-9、PARP、细胞色素C、Bax、
Bcl-2）的表达。JC-1染色检测线粒体膜电位，DCFH-
DA染色检测活性氧（reactive oxygen species，ROS）
生成。结果　荛花酚以时间和剂量依赖性方式抑制CNE
细胞的增殖，荛花酚处理诱导CNE细胞发生明显凋亡，
Bax/Bcl-2比值增加，细胞色素C从线粒体释放到胞浆，
caspase-3和caspase-9活化，PARP发生剪切。荛花酚还
可诱导CNE细胞线粒体膜电位下降，线粒体膜通透转运孔
（PTP）开放，ROS含量升高。结论　荛花酚可显著诱导
CNE细胞的凋亡，机理与影响线粒体功能密切相关。
[关键词]　抗肿瘤药，植物；细胞凋亡；线粒体；荛花酚
Mitochondrial dysfunction is involved in the
apoptosis of human nasopharyngeal carcinoma CNE
cells induced by wikstromol
LIU Huanhai, LIAO Jianchun, ZHAO Shuwei, WU Jian,
PENG Hu, JI Zhenhua, FAN Jingping
(Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery,
Changzheng Hospital, Shanghai, 200003, China）
Corresponding author：LIAO Jianchun（Email：
abliaojc@163.com）
[ABSTRACT] OBJECTIVE The effect of wikstromol
on inducing apoptosis of human nasopharyngeal
carcinoma cells（CNE cells）and its interaction with
mitochondria was examined. METHODS　CNE cells
were acted by wikstromol at different concentrations.
Cell proliferation was measured by MTT assay. Cell
apoptosis was determined by Annexin V/PI staining.
The expressions of apoptosis-related proteins were
measured by Western blot. The mitochondrial membrane
potential was determined by JC-1 staining. The reactive
oxygen species generation was measured by DCFH-DA
staining. RESULTS　Wikstromol significantly inhibited
the proliferation of CNE cells, by inducing apoptosis
in a dose-dependent and time-dependent manner. In
addition, wikstromol triggered the mitochondrial/caspase
apoptotic pathway, which was indicated by enhanced
Bax-to-Bcl-2 ratio, loss of mitochondrial membrane
potential, cytochrome c release, caspase cascade and
RARP splitting in human nasopharyngeal carcinoma
CNE cells. Moreover, wikstromol provoked the disruption
of mitochondrial membrane potential, opening of
mitochondrial permeability transition pore（PTP）, and
increase of ROS content. CONCLUSION　These results
showed that wikstromol could significantly induce the
apoptosis of human nasopharyngeal carcinoma, in which its
function was related with its effect on mitochondrial function.
[Key words] Antineoplastic Agents, Phytogenic;
Apoptosis; Mitochondria; wikstroemia phenol
随着抗肿瘤药物研究热潮的日益高涨，从天然产物中
寻找抗肿瘤药物或先导化合物已成为有效的途径之一。瑞
香科植物南岭荛花（中药了哥王）临床上可消热解毒、化
痰散结、消肿止痛，主要用于治疗痈肿疮毒、风湿性疾病
以及肿瘤。荛花酚是中药了哥王的主要活性成分之一，具
有杀菌、抗病虫害以及抗肿瘤的作用，存在于茎叶中，研
究发现其可以抑制白血病细胞p-388的增殖[1]，然而抗肿瘤
的详细机制至今仍不清楚。目前，线粒体已经成为筛选新
型抗肿瘤药物的重要靶位之一[2]。
本研究通过观察荛花酚对人鼻咽癌CNE细胞（简称
CNE细胞）生长和凋亡的影响，及线粒体功能的变化来进
一步探讨其抗肿瘤作用的分子机制，为荛花酚的应用研究
提供实验依据。
DOI:10.16066/j.1672-7002.2012.04.004
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细
胞
存
活
率
（
%
）
B
1 资料与方法
1.1　试剂。荛花酚购买于苏州宝泽堂医药科技有限公
司，纯度为98%，贮存液用二甲亚砜（DMSO）配制。应
用液用含10%小牛血清的（MEMGibco）配制。 DMEM
（Life Technologies Inc，Grand Island，NY，内含100 U/ml
青霉素、100 µg/ml链霉素，3.7 mg/ml碳酸氢钠，双
蒸水配制，过滤灭菌），FBS（Fetal Bovine Serum，
GIBCO）。NAC购于Sigma公司，Annexin V-FITC
（fluorescein isothiocyanate）/PI（propidium iodide）kit
购于联科生物有限公司，anti-cleaved caspase-3，anti-
cleaved caspase-9购于Cell Signaling Technology公司，
Anti-α Tubulin购于Santa Cruz公司，DCFH-DA活性氧
（reactive oxygen species，ROS）检测试剂盒购于碧云
天生物工程公司，JC-1购于Molecular Probes公司，其他未
特殊说明的试剂均购买于Sigma公司。
1.2　细胞株及培养。CNE细胞、人肝癌SMMC-7721细胞
以及人胃癌BGC-823细胞均购于中科院上海细胞库；用含
10%小牛血清的DMEM培养液在37℃、5% CO2及饱和湿
度的培养箱中培养。
1.3　主要仪器。Thermo CO2培养箱，MD SpectraMax
190酶标仪，BD FACS Calibur流式细胞仪，Nikon eclipse
TE2000-5荧光显微镜。
1.4　MTT法检测细胞活性。96孔板取对数生长期细胞
（4×104个/ml），药物处理48 h后加MTT（1 mg/ml），
37℃、4 h，加100 µl DMSO，酶标仪于570 nm处测光吸
收值。相对抑制率（%）=（1-吸光值给药组/吸光值对照
组）×100%。
1.5　流式细胞术检测细胞凋亡。6孔板培养CNE细胞，24 h
后加入不同浓度的荛花酚，24 h后收集细胞，Annexin V/PI
染色，温育30 min，流式细胞仪检测。
1.6　线粒体功能检测。ROS、线粒体膜电位检测按
试剂盒（JC-1）说明进行操作。ROS含量以FAU表示
（单位数量细胞的荧光强度），荧光强度由荧光酶标仪
（Spetrum MAX，MD）测得。线粒体膜电位以JC-1染
色，流式细胞仪进行分析。
1.7　免疫印迹法。取20 µg蛋白样品上样进行SDS-PAGE
电泳分离，电泳完毕后将PAGE胶于转膜缓冲液静置10 min
后夹好硝酸纤维素膜（Millipore），排除气泡，按湿转转
膜法以350 mA转移60 min。取出硝酸纤维素膜，在1×
TBS中摇5 min，用封闭液室温封闭1 h，加1∶1000稀释
的一抗，4℃过夜，次日用TBST洗硝酸纤维素膜4次，然
后加1∶5000 HRP标记的二抗，于杂交炉上室温反应2 h。
用TBST洗4次，将膜与荧光底物（ECL）共敷1 min，排
去液体，用保鲜膜包裹，与X光片在增感屏中紧密接触，
使X线片感光、显影、定影、冲洗、晾干、扫描。
1.8　统计学方法。采用SAS统计软件，ANOVA方差分
析，组间比较采用q检验，数据以 ±s表示，各实验至少
重复3次。
2 结 果
2.1 荛花酚时间和剂量依赖性的抑制细胞增殖。MTT实验
结果显示，荛花酚呈时间和剂量依赖性抑制CNE细胞的增
殖，10 μmol/L的荛花酚对CNE细胞作用48 h时的抑制率
可达60%（图1A）。与此同时荛花酚亦剂量依赖性的抑制另
外两种肿瘤细胞SMM-7721和BGC-823的增殖（图1B）。
图1　MTT法检测荛花酚抑制多种人肿瘤细胞的增殖
情况。不同浓度荛花酚对 A CNE细胞，B 人肝癌细胞
SMMC-7721和人胃癌细胞BGC-823的增殖影响。*与药
物未处理组比较，P<0.01
抑
制
率
（
%
）
A
2.2　荛花酚诱导CNE细胞凋亡。为进一步检测荛花酚是
否诱导CNE细胞凋亡，本研究采用Annexin V/PI双染流式
细胞仪检测其凋亡情况。以0、5、10、20 μmol/L荛花酚
处理细胞24 h，未加药（对照）组中自发凋亡的细胞占
1.3%，10 μmol/L荛花酚处理后，早期凋亡细胞数比例升高
到42.6%（图2A）。使用caspase-3特异性抑制剂Z-DEVD
处理后，可反转荛花酚的诱导凋亡的作用（图2B）。
蛋白印迹试验进一步检测发现，分别用0、5、10、
20 μmol/L的荛花酚处理细胞24 h，caspase-3蛋白出现活
化，PARP1出现剪切（图3A）。同时促凋亡蛋白Bax表
达增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少，Bax/Bcl-2比值增加
（图3B），以上结果提示荛花酚可通过影响相关凋亡蛋
白表达和caspase级联活化从而诱导CNE细胞凋亡。
0 5 10 20 40
荛花酚（μmol/L）
100
80
60
40
20
0
SMMC-7721
BGC-823
100
80
60
40
20
0
0 5 10 15 20 25 30 40
荛花酚（μmol/L）
24 h
48 h
72 h
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由于线粒体是产生和清除ROS的主要场所，故进一
步采用DCFH-DA染色检测CNE细胞内ROS的含量。以
10 μmol/L的荛花酚作用于CNE细胞，与对照组相比，荛
花酚处理2 h后细胞荧光强度开始增强；荛花酚处理4 h后
ROS含量显著升高（图5A）。CNE细胞用1 mmol/L ROS
产生的抑制剂NAC预处理1.5 h，然后与10 μmol/L荛花酚
孵育24 h，结果发现明显反转了荛花酚诱导的细胞内ROS
水平。初步考虑荛花酚可能损伤线粒体，诱导ROS水平的
增加，干扰细胞内氧化还原平衡。进一步发现，CNE细胞
在1 mmol/L NAC预处理1.5 h后，与10 μmol/L荛花酚孵育
24 h，明显抑制了荛花酚的凋亡诱导作用（图5B）。
图3　荛花酚引发线粒体相关CNE细胞凋亡。10 μmol/L荛花酚处
理细胞在不同时间内，A caspase，B Bcl-2、Bax相关蛋白的表
达情况。注：Tubulin微管蛋白
图4　荛花酚影响CNE细胞线粒体跨膜电位
荛花酚 0 5 10 20 μmol/L
荛花酚
Z-DEVD
A
B
A
B
2.3　荛花酚可引起CNE细胞线粒体损伤。线粒体外膜的
通透性控制内外膜之间凋亡因子的释放，因而控制细胞的
生死。而评价线粒体功能的主要指标之一是线粒体外膜的
通透性即膜电位的高低。为探明线粒体是否参与荛花酚
介导的细胞死亡，以10 μmol/L的荛花酚处理细胞不同时
间，JC-1染色检测线粒体膜电位，随着处理时间的增加，
线粒体膜电位逐渐倒塌（图4）。
孵育时间（h）
对照 荛花酚 荛花酚+NAC
3 讨 论
鼻咽癌的发病尽管在欧洲和北美是比较罕见的，但在
亚洲部分地区如中国的南部以及东南亚地区却并不少见，
大约每10万人群15～50人患鼻咽癌[3]。通常情况下，放疗
是治疗鼻咽癌的常用手段。然而，鼻咽癌目前的治疗并不
理想，主要原因是鼻咽癌早期发现较少，首次确诊往往有
转移以及与鼻咽癌细胞抵抗放疗有关[4]。因此，增加新的
治疗策略，以提高鼻咽癌患者的生存率。越来越多的证
据表明，使用各种不同的天然化学小分子或结构类似物
用于癌症的化学预防和治疗，可明显改善鼻咽癌患者的
预后[3，5，6]。
肿瘤是一种多因素导致的复杂性的疾病，在过去几十
年间其治疗手段和治疗策略不断取得新的进展，例如化学
预防手段的运用。越来越多的研究者开始重视使用各种不
同的天然化学小分子或结构类似物用于肿瘤的化学预防和
治疗[6]。以往的研究表明，荛花酚可抑制白血病细胞的增
A
B
对照
荛花酚
荛花酚+NAC
图5　荛花酚诱导ROS的产生导致CNE细胞凋亡。CNE细胞在荛
花酚和NAC处理下的A ROS水平，B 细胞凋亡水平
图2　荛花酚诱导CNE细胞凋亡情况。A 分别用不同浓度荛花酚处理
CNE细胞24 h，B CNE细胞预先用Z-DEVD处理12 h后与10 μmol/L
的荛花酚孵育24 h
0 6 12 24 h
cleaved caspase-9
cleaved caspase-3
PARP1
cleaved PARP1
Tubulin
Bcl-2
Bax
Tubulin
0 6 12 24 h
0 6 12 24 h
8.36% 28.78% 47.56% 55.41%
荧
光
强
度
200
150
100
50
1 2 3 4 5 6
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殖[1]，但对其机制缺乏进一步的深入研究。本研究结果表
明，荛花酚在5～40 μmol/L的浓度范围内对CNE细胞有着
显著的增殖抑制作用，且与作用时间和剂量有关，表现出
明显的剂量和时间依赖效应。
细胞凋亡发生时，伴随着细胞染色质的固缩及片段
化，膜磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）的外
翻，细胞膜通透性的增加，凋亡执行者caspase-3的激
活，最终形成凋亡小体。荛花酚作用于CNE细胞后，
AnnexinV/PI双染色表明膜磷脂酰丝氨酸发生外翻，细胞
膜通透性增加，caspase-3出现活化。线粒体Bcl-2蛋白家
族被激活，而线粒体结构和功能的变化是细胞凋亡的枢纽
环节[7]。线粒体作为生物细胞能量代谢的中心，是多种信
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8：1881-1890．
（收稿日期：2011-11-28）
编辑　卢曦
息传递、整合的中转站。而线粒体通透性的改变是凋亡过
程中的重要事件，表现为线粒体跨膜电位的下降，继而细
胞色素C、AIF等从线粒体释放到细胞质中。此外，ROS
在细胞的生存和死亡中扮演着重要角色 [8]，而线粒体是
ROS的主要产生场所，可见线粒体掌控着细胞的命运，因
此通过破坏线粒体的功能诱导细胞发生凋亡是抗肿瘤药物
设计和筛选的重要依据。
综上所述，荛花对CNE细胞生长有抑制作用，其抗
肿瘤机制与诱导细胞凋亡，线粒体损伤及ROS水平升高有
关。但有关线粒体调控作用，是否直接参与细胞凋亡，荛
花酚直接作用于线粒体的机制以及这种化合物毒性及其体
内抗肿瘤效果还有待于进一步的研究。
第八次全国听力学及嗓音言语医学暨第五次全国助听器验配技术学术会议通知
由中华医学会耳鼻咽喉头颈外科学分会听力学组、嗓音学组与《听力学及言语疾病杂志》编辑委员会、广西医科大学附属
第一医院联合主办的“第八次全国听力学及嗓音言语医学暨第五次全国助听器验配技术学术会议”拟定于2012年6月22～24日
（具体时间和地点以会议通知为准）在广西南宁市召开，同期召开中华医学会耳鼻咽喉头颈外科学分会听力学组、嗓音学组工
作会议及《听力学及言语疾病杂志》第九次编委会。
本次会议将是国内外的耳鼻咽喉科、妇幼保健科、儿科及听力言语康复系统的专业人士的一次盛会，也是与本专业
相关的医疗药品、听力及嗓音检测器械、设备、助听器装置、人工耳蜗、听力及嗓音言语康复器材等充分展示的良好机
会。参会联系方式：武汉市武昌区紫阳路5号《听力学及言语疾病杂志》编辑部；邮编：430060；电话：027-88043958、
88041911-86459；联系人：雷培香、李翠娥；Email: jasptl@126.com或jasp@public.wh.hb.cn。