全 文 ：2( ) 0 3年 1 2月 按树科技 第 2期 J急第 63期
邓恩按芽器官离体诱导培养影响因素的研究
欧阳磊 ` , 林 彦 2 , 刘友全 , , 谢耀坚 2 , 曹月华 3
( 1
. 中南林学院 ,湖南 株州 41 2仪巧
2
. 国家林业局按树研究开发中心 ,广东 湛江 524D 22
3
. 中国林业科学研究院热带林业研究所 ,广东 广州 51 05 27 )
摘 要 :初步研究了以邓恩按优选实生种子苗的带芽茎段作为外植体诱导丛生芽发生和生长的过程 。
对培养过程中丛生芽的发生和生长情况进行了探讨 。 通过正交试验和单因子试验 ,确定 了邓恩按丛生
芽诱导的最适培养条件 : l( )基本培养基 : 12/ M s 十 BOA . s mg · L一 ’ + I AA O . l m g · L一 ’ + 3 %蔗糖 + 1 . 1%卡拉
胶 ; (2) 培养温度 : 24 ℃ 一 28 ℃ ; ( 3) 光照条件 :暗培养 7 一 10 天后转到 自然散射光较强的光照条件下培
养 。
关键词 :邓恩按 ;芽器官 ;诱导 ; 培养条件
按树原产于澳大利亚 ,是世界三大速生树种之一 , 用途很广 ,木材除广泛用于建筑 、矿山 、车船 、
家具和人造板工业外 ,还是重要的优质制浆造纸工业原料 。 树叶还可提制芳香油 、拷胶 、芦丁 、黄
铜 、经济价值很高 。 然而 ,当前中国按树的主要发展区集中在以广东 、 广西和海南为主的华南地区 ,
因为缺少优良的耐寒树种 , 即使是在广东北部和福建等地 ,按树也常常受到冬季低温的威胁 , 其它
地区的发展规模都不大 。 所以 ,要发挥按树的速生优势 、 有效扩大按树的发展规模和种植范围 ,选
择耐寒按树品种是重中之重 。
经过较长时间的研究和测定表明 :邓恩按作为中国北移引种的优良耐寒按树种 ,不仅有良好的
速生性 (是澳大利亚生长速度最快的树种之一 ) ,而且有相当强的耐寒能力 ,是最近筛选一个较优秀
的耐寒树种 。 这为推广扩大按树人工林种植范围 ,北移引种提供了优良种源 。 多处试验也表明邓
恩按幼林有很强的耐高温抗旱能力 。 但目前国内要推广利用邓恩按还有很多问题尚待解决 , 因各
试验点普遍表明 : 邓恩按难于开花结实 ,到目前为止 ( 10 年生左右 )还未见有邓恩按开花结实的报
道 。 而且 ,无性繁殖也很困难 ,无论组织培养还是扦插 ,生根率都很低 。 所以 ,对邓恩按进行组织培
养研究具有重要意义 。
1 试验材料与试验方法
1
.
1 试验材料
湖南资兴市林业局总工程师朱日光提供的 50 株半年生邓恩按优选实生种子苗作为实验材料 。
收稿 日期 : 2X() 3 一毋 一 20
作者简介 : 欧阳磊 ( 年生 ) , 男 ,在读研究生 。
4 5 欧阳磊等 :邓恩按芽器官离体诱导培养影响因素的研究 总第 63期
1
.
2试验方法
1
.
2
.
1 外植体的选择与处理
选取腋芽还未萌发的嫩枝 , 除去叶片 , 剪成 1 一 2 。m 的带芽茎段 ,用洗洁精清洗 l 一 2 分钟 , 流
水冲洗 30 分钟以上 。 在超工作净台上用 70 % 的酒精消毒 5 秒钟 ,无菌水冲洗 3 次 ,然后用 0 . 1% 升
汞消毒 30 一 40 秒钟 ,无菌水冲洗 4 一 6 次 。 滤纸吸干水分 ,切成 0 . 5 一 1 . 0 C m 的节段 。
1
.
2
.
2 培养条件
所有激素的浓度单位 mg · L 一 ’ ,光照为较强的自然散射光 ,室内温度 24 ℃ 一 28 ℃ 。
1
.
2
.
3 培养基配方
( l) 以 M S 培养基为基本培养基 ,采用单因子试验方法寻找最适合的激动素种类及浓度 ,试验
方案 : BA 、 KT 、 zr 各设 4 个浓度 (mg / L )为 0 . 2 、 0 . 5 、 1 . 0 、 1 . 5 ,共 12 个处理 , 重复 3 次 ,每次每处理接
种 15 段 。 ( 2) 以最适合的激动素及浓度为基础分别添加生长素 L气A ( 0 . 05 、 0 . 1 、 0 . 5 ) 、 IB A ( 0 . 05 、 o
1
、
0
.
5 )
、
NA A ( 0
.
05
、
0
,
l
、
.0 5 )
,共 9 个处理 ,重复 3 次 ,每次每处理接种 巧 段 。 寻找最适合的生长素
种类及浓度 。 ( 3) 以最佳激素配比为基础 ,对不同培养基 ( M S 、 B S 、 W ll i et 、凡 、改良 H )进行试验 ,寻找
最适合的基本培养基 。 ( 4 )对基本培养基中大量元素 ( 0 . 5 倍 、 1 . 0 倍 、 1 . 5倍 ) 、有机质 ( 0 . 5 倍 、 1 . 0
倍 、 1 . 5 倍 ) 、蔗糖 ( 20 % 、 so % 、 40 % )进行正交试验 场 ( 34 ) ,组配了 9 个处理 ,试验重复 3 次 , 每次每
处理接种外植体 巧段 ,调整培养基的配方 。
2 结果与分析
表 1 不同位置腋芽的萌动情况
腋芽在茎段上位置 样本
数 /个
萌动
数 /个
萌动
率 /%
褐化
率 / %
顶芽 ( 1 一 2 个芽位 ) 3 0 3 10 9 5
茎段 ( 3 一 6 个芽位 ) 9 2 麟 6 9 . 6 8 1
茎段 ( 7 一 8个芽位 ) 6 5 9 13 . 8 9 8
2
.
1 不同位置腋芽的萌动情况
从表 1可看出邓恩按的萌动规律 :顶芽以下第 3 一 6 位腋芽 、半木质化程度的茎段 ,芽诱导的萌
动率最高 ;顶芽组织幼嫩 ,木质化程度过低 ,消毒很困难 , 接种后大部分褐化死亡 ;第 7 位腋芽以下
的茎段几乎完全木质化 , 消毒困难 , 污染率很高 ,而且腋芽的萌动率很低 。 所以选取第 3 一 6 位节段
的腋芽作为外植体最好 。
2
.
2 不同激动素对丛生芽诱导的影响
从表 2 可 以得出 : 由于外植体年龄很小 ,种子苗种植于实验室旁 ,采集到接种的时间很短 ,腋芽
的萌发率都比较高 ,萌发后芽长得都比较快 。 三种激动素都可以诱导腋芽萌发 ,但不同激动素对腋
芽萌发和新芽生长的影响不同 : ( 1 ) BA 浓度升高 , 腋芽的萌发率降低 , 新芽的生长减慢 ,芽均高降
第 2 期 按树科技 5
低 。 在 A B为 0 .5 时芽的增殖系数最大 ,有效芽的数量最多 , 是丛生芽诱导的适宜浓度 。 ( 2 ) zr 浓
度升高 ,腋芽的萌发率升高 ,新芽的生长加快 , rZ 浓度为 1 . 0 时 ,两者都达到最高水平 ,之后两者都
降低 。 ( 3) 在添加 KT 的培养基中无论萌芽率还是芽均高都无变化规律 , 而且效果都比 B A 和 rZ
差 。 在 KT 为 0 . s grn · L 一 ’ , 萌芽率最低 、 有效芽很少 ,芽的长势也最差 ,具体原因需进一步研究 。
在添加各激动素的培养基中萌芽时间为 5 一 1 天 ,激动素的浓度越高 ,芽启动的时间越长 。 萌
发后的腋芽在添加不同激动素的培养基中长势有较大差别 , 有效芽 (新芽叶大 、 颜色鲜绿 、 叶片舒
展 、长势旺盛 , 茎段粗壮且在继代培养中增殖快 )的数量差别也比较大 。 根据试验结果 : 在添加
zT I
.
0 的培养基中长得快且粗壮 , 叶片伸展 ;添加 BOA . 5 的培养基中丛生芽数量多 、增值系数大且
芽长势较好 ,有效芽也较多 。 考虑到 B A 的价格 比 zT 低得多 ,在工厂化育苗中为降低成本具有优
势 ,选 B AO . 5 更好 。
表 2 激动素对丛生芽诱导的影响
激动素种 样本 出芽时 出芽率 芽增殖 30 天芽 有效芽 继代中
类与浓度 个数 间 (天 ) 系数 长度 比率 芽长势
B A 0
.
2 日4 5 6 5% 1 . 8 8 0 . 6 8 3 1% +
0
.
5 5 7 5 6 3% 3
.
0 2 0
.
5 2 6 5% + + +
1
.
0 4 3 7 4 5% 2
,
5 2 0
.
4 5 4 2% +
1
.
5 56 10 3 7% 2
.
13 0
.
2 1 2 5% +
K DI
.
2 4 6 7 6 1% 1
.
8 1 0
.
6 5 3 6 % + +
0
.
5 4 6 7 1 9% 1
.
5 3 0
.
4 6 12 % +
1
.
0 科 8 5 9% 1 . 6 9 0 . 麟 32 % +
1
.
5 4 0 11 4 8% 1
.
2 1 0
.
2 3 2 1% +
Z ID
.
2 4 4 4 74 % 2
.
1叉) 0 . 6 2 4 5 % + +
0
.
5 4 7 5 6 9% 1
.
8 7 0
.
7 3 5 3% + +
1
.
0 4 8 5 6 2% 1
.
8 1 0
.
7 9 67 % + + +
1
.
5 4 8 7 5 6 % 1
.
7 2 0
.
5 3 5 1% + +
注 : (样本数 二 接种数 一 污染数 , 出芽时间为接种到腋芽萌发的天数 , 有效芽为高 0 . s cm 以上叶片嫩绿伸展的
芽 , “ 十 ”代表程度 ,即越多越好 ,实验数据为三次重复试验所得数据的平均值 , 下同 )
2
.
3 生长素对丛生芽诱导的影响
从表 3 可以得出 :各生长素对芽的萌动时间和出芽率影响不是很大而且它们之间的差异很小 ,
随着各生长素浓度升高出芽率和芽的增值系数降低 。 三种生长素中 L气A 对芽的生长影响最显著 ,
出芽时间相对 N从和 IBA 短 ,而且芽的增值系数 、有效芽和在继代中的芽长势都优于 N从 和 BI A ,
IAA 浓度为 0 . 1呵 L 时芽的生长最快 ,有效芽数量最多 ,在继代培养中芽的生长势最好 ; IBA 抑制
芽的生长 ,在添加 IB A 的培养基中芽生长很慢 ,有效芽数量少 ,在继代培养中芽的生长势也差 ; NAA
对芽的萌动和生长影响不大 , 可以省略 。 所以在丛生芽诱导培养中 , 添加 0 . l mg L/ 的 IAA 有利于
芽的诱导和生长 。
欧阳磊等 :邓恩按芽器官离体诱导培养影响因素的研究 总第 63 期
表 3 生长素对丛生芽诱导的影响
激动素种类与浓度 样本
个数
出芽时 出芽率 芽增殖 30 天 有效芽 继代中
间 (天 )、 系数 芽均高 芽长势
B O A
.
5+N AAO
.
0 59 6 2 5 5% 2
,
3 3 0 5 8 4 1% + +
B AO
.
5 + N A AO
.
1 40 7 5 3 % 2
.
2 5 0
.
6 2 3 8% + +
B AO
,
5 + N AAO
.
5 4 1 7 4 5 % 2
.
3 8 0
.
5 0 2 5 % +
B AO
.
5 + I BA O
.
05 39 5 57 % 2
.
17 0
.
5 0 20 % +
B AO
.
5 + BI AO
.
1 32 6 5 1% 1
.
9 7 0
.
4 17 %
+
B AO
.
5 + I BA 0
.
5 32 6 3 9% 1
.
5 0 0
.
34 1 3% +
BAD
.
5 + U八0 . 0 5 32 5 6 % 2 . 5 6 0 . 85 54 % + +
B AO
.
5 + I AA O
.
1 3 2 5 64 % 2
,
29 0
.
9 5 67 % + + +
BA O
.
5 + 认五 0 , 5 3 2 6 科 % 2 . X() 0 . 6 8 4 9% 十
2
.
4 基本培养基的筛选
从表 4 可 以得出 : 5 种培养基均能诱导腋芽萌动 ,它们的主要不同点是芽萌动后生长势不同。
MS 培养基中腋芽的萌动率最高 , 芽增值系数大 ,有效芽数量最多 , 继代中芽的长势好 ,适合作为丛
生芽诱导的基本培养基 ; B5 和 H 培养基中芽的萌动率比 MS 培养基稍低 ,有效芽数量比较多 ,在继
代培养中芽生长很慢 ,不拟作为丛生芽诱导的基本培养基 ; W ll i t e 培养基芽萌动率最低 ,芽萌动后几
乎不能生长 ,萌动后大约过四五天就死亡 ;凡 培养基中芽的萌动率及增值系数和 B5 培养基差不
多 ,但萌芽后不久也全部死亡 。
表 4 基本培养基对丛生芽诱导和生长的影响
基本培养基 样本 出芽时 出芽率 芽增殖 30 天 有效芽 继代中
个数 间 (天 ) 系数 芽均高 芽长势
M S 5 0 6 5 5% 2
.
3 0
.
7 0 5 6% + + +
B S 4 3 7 3 7% 1
.
9 0
.
5 5 3 1% +
H 46 7 3 5% 1
.
6 0
.
5 1 3 5% +
从七 i比 5 1 8 2 1% l , 3 0 . 1 0 %
N 6 49 9 3 6% 1
.
7 0
.
1 0%
注 : (样本数 二 接种数 一 污染数 ,萌动时间为接种到腋芽萌发的天数 , “ 十 ”代表程度即越多越好 ,实验数据为三
次重复试验所得数据的平均值 )
2
.
5 M S 培养基中无机盐 、有机物及蔗糖对芽诱导的影响
在激动素和生长素不变动的情况下 , 各处理的萌芽率都很高且相差很少 .影响芽的萌动率主要
是外源激素 ,而芽均高在各处理之间相差较大 ,因此数据处理是将芽均高 x s + 出芽率作为综合指
标得出表 5 ,从表 5 的试验结果可 以看出 :
( 1 ) 3 因素中蔗糖的极差最大 ,经方差检验差异 (在 0 . 1 水平上 )达到显著水平 , 表明蔗糖对芽
的生长起主导作用 。 3 因素对芽生长的重要性主次排序是蔗糖 > 大量元素 > 有机物 。
第 2期 按树科技 7 5
( 2)各处理间新芽的平均生长有明显的差异 。 如处理 4 中芽的均高相当于处理 8的 2倍多 。
而且还可以明显的看到 : 减少大量元素 ,苗的生长势有改善趋势 ,但水平间的差异未达到显著水平 ;
有机物对芽生长的影响最少 ,各水平间差异很少 。 鉴于以上试验结果 ,离体芽器官诱导阶段比较好
的培养基配方是 : l/ ZMS + 30 % 蔗糖 + 5 . 5% 卡拉胶 + BAO . smg · L 一 ’ + u 五0 . l grn · L 一 ` 。
表 5 直观因素分析表
处理 因 素 样本数 出芽率 芽均高 综合指标
大量元素 有机物 蔗糖
1 0
.
5 0
.
5 20 % 3 1 60
.
3 % 0
.
4 2 2
.
7 0 3
2 0
.
5 1 3 0% 30 67
.
5 % 0
.
5 7 3
.
5 25
3 0
.
5 l
.
5 4() % 33 5 7
.
8% 0
.
64 3
.
7 7 8
4 1 0
.
5 3 0% 30 56
.
7 % 0
.
6 5 3
.
8 17
5 1 1 4() % 3 1 70
.
0 % 0
.
4 9 3
.
150
6 1 1
.
5 20 % 3 1 6 2
.
5% 0
.
4() 2
.
62 5
7 1
.
5 0
.
5 4 0% 30 6()
.
0 % 0
.
5 1 3
.
15
8 1
.
5 1 20 % 2 8 5 5
.
7% 0
.
3 1 2
.
10 7
9 1
.
5 1
.
5 3 0% 2 8 6 2
.
8% 0
.
56 3
.
4 2 8
k l 3
.
3 35 3
.
2 23 2
.
47 8 T
= 2 8
.
2 83
K 3
.
197 2
.
927 3
.
59()
姚 2 . 8 95 3 . 2 27 3 . 35 9
极差 0 . 科0 0 . 3 50 1 . 1 12
2
.
6 季节和温度对离体芽器官诱导和生长的影响
表 6 不同季节对芽诱导和生长的影响
季节 样本数 出芽率 30 天后的芽均高
春季 5 2 7 3% 0 . 7 8
夏季 4 7 4 6% 0 . 8 4
秋季 4 9 5 8% 0 . 5 1
冬季 5 7 3 2% 0 . 3 4
不同季节不同温度对芽的诱导和生长有很大的影响 , 由表 6 可以得出 : 在春季 (月平均温度大
约 19 ℃ )时芽的诱导率最高 , 比冬季芽的诱导率高 2 倍多 , 生长速度也比较快 ,是芽诱导的最佳季
节 ;在夏季 (月平均温度大约 so ℃ ) , 芽的诱导率比较低 ,但生长速度很快 , 比冬季芽的生长速度快
两倍多 ;冬季芽的诱导率和生长都很差 。 所以 ,最适合的生长温度是 24 一 28 ℃ , 在春末夏初 ;芽的
诱导率则受植株本身生理的影响比较大 , 春秋两季是诱导较好季节 。
5 8 欧阳磊等 :邓恩按芽器官离体诱导培养影响因素的研究 总第 63期
2
.
7光照对芽诱导和生长的影响
表 7光照对芽诱导和生长的影响
不同处理方式 样本数 出芽率 褐化率
暗培养 7一 0 1天 52 5 7 %3 1%
不经过暗培养 5 3 2 3 %6 7 %
由表 7可以得出 :经过 7一 0 1天的暗培养 ,外植体被褐化的比例减少很多 , 出芽率是不经过暗
培养处理的 2倍多 。 原因可能是光照引起外植体切 口处分泌的酚类化合物的氧化而导致外植体严
重褐化 , 以致死亡 。 暗培养有效地抑制了酚类化合物的氧化 ,减少了褐化率 。
把经过暗培养 7 一 10 天后大多数芽已萌动的外植体分为三组 ,分别离窗口远近不同的位置 。
经过 20 天的培养后 ,各组芽的平均高度有显著差异 。 靠近窗 口位置自然散射光较强的芽生长很
快 ,叶片伸展浓绿 ;远离窗 口较暗的位置 ,芽生长缓慢 , 叶片细小 ,部分叶片呈黄色 ,这样的芽在继代
培养中生长缓慢 ,容易枯萎死亡 , 即使增加辅助光照也没有在较强自然光下生长的芽健壮 。 所 以 ,
外植体经过 7 一 10 天的暗培养后 ,选择在 自然散射光较强且阳光直射不到的光照条件下培养比较
好 。
3 讨 论
邓恩按离体芽器官诱导培养过程中 ,发现芽的诱导和生长与外植体的起源 、 生理 、 生殖潜力有
关 。 如外植体的生理年龄越大 ,诱导所需的时间越长 ,诱导出的芽生长越慢 ;不同季节芽的诱导率
和生长速度不同 ;有的芽叶表面出现颗粒状愈伤组织 ;在继代培养中易玻璃化等 。 为了解决实验中
的这些问题 , 通过尝试多种培养条件对 40 多个无性系进行试验 ,发现邓恩按的诱导和生长与外植
体来源有密切关系 , 因此认为材料本身的基因型差异决定了其是否适合离体培养 。 根据不同无性
系在芽启动 、丛生芽发生 、生长和继代培养过程中的差异 ,初步筛选出了 5 个试管无性系 3E 、 1E 3 、
1E 5
、
E 2 4
、
E40
,筛选出来的试管无性系不仅芽的启动快 、 出芽率高 、 生长快 、在继代培养中增殖快 ,
而且不易出现异常现象 。
参 考 文 献
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