全 文 ：中国农学通报 2016,32(22):127-132
Chinese Agricultural Science Bulletin
RNAi介导的百合抗CMV和LMoV的载体构建
冯亚言 1，冯慧颖 1，徐雷锋 1，杨盼盼 2，李雅男 1，袁素霞 1，明 军 1
（1中国农科院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2南京林业大学风景园林学院，南京 210037）
摘 要：为获得高效的RNAi(RNA interference)表达载体，培育百合抗病毒新种质，选取感病百合叶片为
试验材料，同源序列比对后选取CMV 2b基因271 bp和LMoV cp基因428 bp作为靶基因片段。首先采
用RT-PCR方法对感病植株进行病毒检测，确定其带有CMV和LMoV病毒；之后提取感病植株叶片总
RNA，反转录得到cDNA，设计带有不同酶切位点的引物，以反转录得到的cDNA为模板，PCR扩增获得
目的片段，产物回收纯化后，转化大肠杆菌，重组克隆。将各自的反向片段、正向片段顺次连接到载体
pFGC5941上，经多次双酶切、连接、转化后，采用冻融法将构建好的载体转入农杆菌EHA105并进行重
组鉴定。酶切结果表明已成功构建了分别抗 CMV、LMoV的 RNAi植物表达载体 pFGC5941-C2和
pFGC5941-L2，PCR扩增结果表明表达载体已成功转入农杆菌中。所构建的载体及获得的工程菌与预
期的完全一致，获得含载体的农杆菌可以直接应用于百合转基因抗病毒育种工程中。
关键词：CMV；LMoV；RNAi；植物表达载体；农杆菌转化
中图分类号：S682.2，Q782 文献标志码：A 论文编号：casb16010070
Construction of RNAi Expression Vectors Respectively Resistant to CMV and LMoV
Feng Yayan1, Feng Huiying1, Xu Leifeng1, Yang Panpan2, Li Yanan1, Yuan Suxia1, Ming Jun1
(1The Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081;
2College of Landscape Architecture, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037)
Abstract: In order to obtain the efficient expression vectors for new lily antiviral germplasm, CMV 2b gene 271
bp and LMoV cp gene 428 bp fragments were chosen as the target sequence to construct the vectors by
homologous sequence. The required virus was confirmed by RT-PCR method from infected leaves. And then
PCR method was used to obtain the cDNA from the total RNA. Using the cDNA as template, the target
fragments were obtained under specific primers with different restriction enzyme cutting sites. The two
fragments were inserted into both sides of intron of pFGC5941 in forwards and reverse after recombinant clone.
The RNAi vector was introduced into Agrobacterium tumefaciens EHA105. Restriction enzyme digestion
showed that the RNAi vectors were constructed successfully. The results of PCR confirmed that both of the two
vectors pFGC5941-C2 and pFGC5941- L2 were introduced into Agrobacterium tumefaciens EHA105. The
results of PCR and sequencing showed that the constructed vectors and the engineering bacteria were
completely consistent with the expected, the RNAi vectors were constructed successfully, which could be
applied in transgenic breeding engineering for lily viral resistance.
Key words: CMV; LMoV; RNAi; construction of vectors; transformation by Agrobacterium tumefaciens
基金项目：国家自然科学基金“RNAi介导的百合双抗CMV和LMoV病毒研究”(31272205)。
第一作者简介：冯亚言，女，1990年出生，河北保定人，硕士研究生，研究方向为观赏植物资源与遗传育种。通信地址：100081北京市海淀区中关村南
大街12号中国农科院蔬菜花卉研究所，E-mail：fengyayan@foxmail.com。
通讯作者：明军，男，1963年出生，湖北人，研究员，博士生导师，研究方向为观赏植物资源与遗传育种。通信地址：100081中国农业科学院蔬菜花卉
研究所，Tel：010-82105945，E-mail：mingjun@caas.cn。
收稿日期：2016-01-14，修回日期：2016-02-25。
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0 引言
百合 (Lilium L.)是百合科 (Liliaceae)百合属
(Lilium)植物，具有重要的观赏、食用和药用价值，但是
随着切花百合的大量进口及多年的无性繁殖，百合病
毒病日益严重，给百合种植造成极大的经济损失。常
见易感染百合并影响其观赏价值的病毒主要有 3种：
黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus，CMV)、百合斑
驳病毒(lily mottle virus，LMoV)和百合无症病毒(lily
symptomless virus，LSV)，其中，危害百合最为严重的
是LMoV，形成花斑，影响生长，使百合直接丧失观赏
价值，CMV是百合最常感染的一种病毒，而百合无症
病毒单独感染则不表现出症状[1-4]。防治百合病毒病的
方法主要有切断病毒感染途径、利用组织培养培育脱
毒苗、培育抗病毒品种及转基因育种3种，前2种方法
不能从根本上根治病毒，所以培育抗病毒品种及转基
因育种成为病毒防治中较为理想的策略之一。但是除
岷江百合(Lilium regale)等少数野生种具有抗病性外，
绝大多数百合不具有病毒抗性，加之现代百合品种经
多代杂交，高度杂合，与野生种通常存在杂交不亲和
性；而且，当前百合上抗性基因的研究存在资源相对有
限、周期长、效率低且不稳定遗传的现象，因此，利用常
规育种手段进行抗病毒育种的可能性较低 [5]。近年
来，RNA干扰(RNA interference，RNAi)以其高效性、高
特异性、高安全性及抗性持久，在植物抗病毒防治中表
现出了传统育种方法所不具备的优势，逐渐受到育种
家的青睐[6-9]。RNAi即转录后基因沉默，是一种高效
的基因沉默机制，为植物抗病毒育种提供了一种全新
的策略，在茄科、豆科及葫芦科植物抗病毒研究中都得
到了广泛的应用[10-13]。在抗病毒研究中，CMV的2b基
因的 2个高度保守区决定了其是CMV的致病基因之
一[14]，然而对于转基因抗LMoV的研究很少，目前尚处
于病毒分离提取物分析阶段。徐品三等[15-18]进行了百
合抗病毒研究，其利用Gateway技术将LSV cp基因进
行了克隆并构建了抗LSV的RNAi植物表达载体，以
及利用重叠延伸PCR技术获得LSV-LMoV融合基因，
并结合Gateway技术最终获得双价抗LSV和LMoV病
毒的RNAi表达载体用于农杆菌介导的百合转化，并
对百合抗病性研究进展做了概述，这在百合抗病毒研
究中是一个全新的突破。但是当前百合抗病毒研究主
要针对于 LSV和 LMoV，对严重危害百合CMV这种
病毒相关抗病性的研究还未见报道 [19- 22]。虽然已有
LSV和LMoV等的RNAi植物表达载体相关研究，但
是，其转化活性情况以及是否能够获得可用的抗性种
质等未见后续报道 [23- 25]。所以本研究拟对 CMV和
LMoV 2种病毒分别进行不同区域片段的表达载体构
建，以期获得抗性范围较广的新种质，即采取比以往百
合抗病毒研究中活性更高的不同目的片段，结合传统
的酶切、连接及转化，构建RNAi表达载体，以期通过
不同株系、不同长度目的片段的选取，得到抗性不同的
抗病毒植株。本研究针对CMV和LMoV这 2种严重
危害百合的病毒，分别克隆了 CMV的 2b基因和
LMoV的 cp基因的保守区段，构建了分别抗 CMV、
LMoV的RNAi植物表达载体，并将其导入农杆菌中，
旨在为培育出分别抗这2种病毒的百合转基因植株打
下基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料与试剂
1.1.1 植物材料 分别感染病毒LMoV和CMV的东方
百合‘索邦’病叶于2012年取自北京李庄。
1.1.2 菌种和菌株 大肠杆菌Top10购于北京天根生物
有限公司产品；克隆载体 pMD18-T vector购于大连
Takara公司；农杆菌EHA105菌株及RNAi植物表达载
体pFGC5941为本实验室保存。
1.1.3 分子生物学试剂 RNA反转录试剂盒购自
Invitrogen公司，植物RNA提取试剂盒购自北京艾德
莱生物技术有限公司，DNA聚合酶、DNA分子标记物
(DNA marker)、凝胶回收试剂盒质粒提取试剂盒、PCR
扩增试剂等均为北京天根生物有限公司产品，限制性
内切酶购自NEB，T4 DNA连接酶购自Promega公司。
1.2 引物的设计
根据Genbank中收录的CMV 2b基因的CDS序列
(AJ276589，333 bp)和 LMoV cp 基因的 CDS 序列
(EF158108，825 bp)，将其与其他基因进行同源性比
对，最终选取 CMV 2b基因 271 bp和 LMoV cp基因
428 bp的区域作为目的基因片段，利用软件Primer 5.0
与Oligo 6.0设计如表1的引物。
1.3 目的片段的克隆
选取感病百合植株叶片，参照本实验室百合主要
病毒的分子检测方法，用RT-PCR方法检测百合，确定
其带有LMoV、CMV病毒。对确定带有病毒的材料提
取总RNA，经琼脂糖凝胶电泳检测后，进行反转录，得
到cDNA。
以反转录后的cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR
循环条件是：95℃预变性 4 min，30个循环（94℃变性
20 s；合适退火温度 62℃ (CMV)/ 57℃ (LMoV)退火
30 s；72℃延伸 40 s；72℃延伸 5 min；将所得 PCR产物
进行电泳检测，并回收目标条带，将目的片段连入克隆
载体pMD18-T。
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1.4 重组克隆及检测
采用热激法，将上述重组好的质粒载体转化入大
肠杆菌Top10感受态细胞，涂布平板进行蓝白斑筛选，
挑取白色单菌落提取质粒并进行测序鉴定分析。
1.5 RNAi植物表达载体的构建
提取重组质粒载体，以CMV 2b R-F和CMV 2b R-
R为引物，以重组质粒pMD18-T为模板进行PCR扩增，
回收纯化产物。对产物和载体pFGC5941进行双酶切，
连接得到中间重组载体 pFGC5941-C1。以 LMoV cp
R-F和LMoV cp R-R为引物，以重组pMD18-T为模板
进行 PCR 扩增，回收纯化产物。对产物和载体
pFGC5941 进行双酶切，连接得到中间重组载体
pFGC5941-L1，转化大肠杆菌Top10，涂布平板进行蓝
白斑筛选，挑取白色单菌落并于LB液体培养基中37℃
培养，提取重组质粒，以CMV 2b R-F和CMV 2b R-R为
引物对载体 pFGC5941-C1，以LMoV cp R-F和LMoV
cp R-R为引物对载体pFGC5941-L1进行PCR鉴定。
方法同上，以 CMV 2b F-F和 CMV 2b F-R为引
物，以上述得到的重组载体 pFGC5941-C1为模板，进
行PCR扩增，回收纯化产物，将回收的片段反向连接
到重组质粒载体 pFGC5941-C1上；以LMoV cp F-F和
LMoV cp F- R 为引物，以上述得到的重组载体
pFGC5941-L1为模板，进行PCR扩增，回收纯化产物，
将回收的片段反向连接到重组质粒载体 pFGC5941-
L1上，得到最终构建的重组质粒载体pFGC5941-C2或
pFGC5941-L2，提取重组质粒进行菌液 PCR鉴定，采
用 引 物 为 ：5941FJYJC- F(TATCCTTCGCAAGAC
CCT)、5941FJYJC- R(AAGTGAGACATAGAACCCG
T)。综上，分别抗CMV和LMoV的RNAi植物表达载
体构建完成。
1.6 转化农杆菌及鉴定
采用冻融法将质粒 pFGC5941-C2和 pFGC5941-
L2转化农杆菌EHA105感受态细胞，转化产物全部均
匀涂布于含有 50 μg/mL Rif和 50 μg/mL Kan的LB固
体培养基上，28℃倒置培养，待平板上长出白色单菌落
后，挑取单菌落到10 mL含有相同浓度的Rif和Kan的
LB液体培养基中28℃培养过夜，用引物5941FJYJC-F
和5941FJYJC-R进行菌液PCR鉴定，并以未转化农杆
菌和质粒做模板的PCR结果作为对照。
2 结果与分析
2.1 材料检测及总RNA提取
选取感病植株叶片，采用本实验室百合主要病毒
的分子检测方法，用RT-PCR方法确认所取得百合植
株材料确实带有CMV、LMoV，可以用此材料进行后
续试验。采用RNA试剂盒提取植物总RNA，将其反
转录成 cDNA后扩增出 CMV 2b 657 bp、LMoV cp
428 bp的目标片段，用特定引物进行 PCR检测，序列
结果如图1~2，显示条带正确。
2.2 目的片段的克隆
以反转录的 cDNA为模板，进行 PCR扩增，得到
CMV 2b基因和LMoV cp基因的正反向片段，测序结果
表明CMV 2b基因长度正向 289 bp、反向 287 bp（如图
3），LMoV cp基因长度正向446 bp、反向444 bp（如图4）。
名称
CMV 2b F-F
CMV 2b F-R
CMV 2b R-F
CMV 2b R-R
LMoV cp F-F
LMoV cp F-R
LMoV cp R-F
LMoV cp R-R
引物序列(5’-3’)
CATGCCATGGGAACTCCAACTGGCTCGTAT
GGCGCGCCCGGCGAACCAATCTGTAT
GCTCTAGAGAACTCCAACTGGCTCGTAT
CGGGATCCCGGCGAACCAATCTGTAT
CATGCCATGGCACCTCACCAAACATAAATGG
GGCGCGCCTAGAAATTCCAAGTAAGGGGTGC
GCTCTAGACACCTCACCAAACATAAATGG
CGGGATCCTAGAAATTCCAAGTAAGGGGTGC
酶切位点
NcoI
AscI
XbaI
BamHI
NcoI
AscI
XbaI
BamHI
表1 引物序列及相应酶切位点
注：下划线表示的碱基即为酶切位点。
M：Marker；CK：无毒对照；1：目标条带
图1 LMoV cp基因RT-PCR结果
428 bp
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将目的条带回收纯化后与克隆载体 pMD18-T连
接并转化大肠杆菌Top10感受态细胞，进行抗性筛选，
白色菌落即为理论上的转化菌落；摇菌进行 PCR检
测，对菌落进行阳性克隆鉴定。检测产物长度LMoV
cp基因：正向 602 bp；反向 600 bp；CMV 2b基因：正向
445 bp；反向 443 bp（如图 5~6），得到转化子。将含有
重组质粒载体的菌液进行测序，测序结果与预期一致，
可使用此重组质粒与表达载体的连接。
2.3 植物表达载体的构建
载体 pFGC5941与 PCR酶切产物进行双酶切，得
到第 1个重组载体 pFGC5941-C1或 pFGC5941-L1，转
化大肠杆菌，培养筛选重组子，挑取单菌落在含卡那青
霉素的LB液体培养基中37℃培养。使用LMoV cp基
因、CMV 2b基因反向片段引物进行菌液PCR鉴定，鉴
定结果如图 7~8，测序结果表明目的基因片断大小与
预期结果相符，证明载体连接成功。
将目的片段的正向片段双酶切后与上述构建好的
重组载体 pFGC5941-C1、pFGC5941-L1连接回收，得
到第 2个重组质粒载体 pFGC5941-C2或 pFGC5941-
L2。采用与上述相同的检测方法，检测结果如图 9~
10，未连接正向片段的对照 PCR产物长度为 720 bp，
与 CMV 2b正向片段成功连接的 PCR产物长度为
991 bp，与LMoV cp基因正向片段成功连接的PCR产
物长度为 1148 bp，目的基因片断大小与预期结果相
符，证明连接成功。
2.4 农杆菌转化及其鉴定
通过冻融法将上述构建好的表达载体pFGC5941-
C2或pFGC5941-L2导入感受态农杆菌EHA105中，在
1200 bp
500 bp
657 bp
M 1 CK
M：Marker；1：目标条带；CK：无毒对照
图2 CMV 2b基因RT-PCR结果
M 1 2
600 bp
300 bp 目的片段
M：Marker；1：正向片段；2：反向片段
图3 CMV 2b正、反向片段
600 bp
300 bp
目的片段
M 1 2
M：Marker；1：正向片段；2：反向片段
图4 LMoV cp正、反向片段
400 bp
600 bp
M CK 1 2
M：Marker；1：正向检测产物；2：反向检测产物；CK：载体pMD18-T
图5 LMoV cp正反向检测产物
400 bp
600 bp
M 1 2CK
M：Marker；1：正向检测产物；2：反向检测产物；CK：载体pMD18-T
图6 CMV 2b正反向检测产物
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含有50 μg/mL Rif和50 μg/mL Kan的LB固体培养基上
转化菌落，对照平板无菌落。成功导入载体的农杆菌
EHA105会同时具有Kan和Rif抗性，因而与对照相比，
只有转化菌落才能在筛选培养基上生长，据此作为抗
性菌落筛选的标志。挑取单菌落用自行设计的引物对
菌液进行 PCR检测，电泳结果如图 11，成功导入
pFGC5941-C2的农杆菌PCR产物长度为 991 bp，成功
导入pFGC5941-L2的农杆菌PCR产物长度为1148 bp，
其扩增条带大小与表达载体进行的扩增的条带大小相
同，证明表达载体已经成功转入农杆菌EHA105中，可
以使用含有此目标载体的农杆菌进行攻毒试验。
3 结论
有效的RNAi表达载体的构建是RNAi干扰策略
成功的关键。本研究通过RNAi构建了高效的分别抗
CMV和LMoV的表达载体，并将其导入农杆菌中进行
了转化。首先根据NCBI上已登录的CMV 2b基因和
LMoV cp基因序列，通过Blast同源比对，选取CMV 2b
基因 271 bp和LMoV cp基因 428 bp做为目的基因片
段；之后，对该目的片段进行了克隆，以反转录得到的
cDNA为模板，进行 PCR扩增，得到 CMV 2b基因和
600 bp
M 1 2CK
300 bp
M：Marker；1：反向片段；2：反向片段重组子；CK：载体pFGC5941
图7 LMoV cp反向片段重组子检测
600 bp
M 1 2CK
400 bp
M：Marker；1：反向片段；2：反向片段重组子；CK：载体pFGC5941
图8 CMV 2b反向片段重组子检测
M CK L
1200 bp
500 bp
M：Marker；L：已连接正向片段的重组子；CK：pFGC5941-L1
图9 LMoV cp正向片段重组子检测
1200 bp
M CK
500 bp
C
M：Marker；C：已连接正向片段的重组子；CK：pFGC5941-C1
图10 CMV 2b正向片段重组子检测
L：含pFGC5941-L2的重组农杆菌；C：含pFGC5941-C2的重组农杆菌；
CK+(L)：pFGC5941-L2阳性对照；
CK+(C)：pFGC5941-C2阳性对照；CK(-)：阴性对照；M：DNA marker
图11 重组农杆菌的PCR检测
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LMoV cp基因的正反向片段，将目的条带连接并转化
大肠杆菌Top10感受态细胞，得到抗性重组质粒；将载
体经多次酶切、连接、转化，即得到所需表达载体，将其
转入农杆菌中，对百合抗病毒研究和百合新品种培育
具有重大意义。
4 讨论
RNAi策略具有特异性、稳定性和高效性的特点，
自发明以来，已在多种植物上得以应用。要构建有效
的RNAi植物表达载体，不同转化系统、不同应用形式
及不同靶基因长度，都会直接影响基因沉默的效率和
效果。本研究选取了不同于前人的目的片段，在已有
的抗病毒研究中，CMV 2b基因选取了近 300 bp或更
短，LMoV cp基因选取了将近380 bp，但其转基因烟草
均表现出较低的抗性频率，基于此，推测更长的目的基
因片段才能激发更强的转基因抗性[17-20]。因而在本研
究中，CMV 2b基因选取了近 650 bp，LMoV cp基因选
取了近440 bp，以期在侵染靶基因时，表现出更强的抗
性，从而提高侵染成功率及转化效率；另外，在试验中，
在酶切位点的选择上，应确保载体上具有该酶切位点
但目的片段上没有，保证目的片段的完整性。
本研究成功构建了百合分别抗CMV和LMoV的
表达载体，并已成功转入到农杆菌中，获得百合侵染植
株，正在对所获得的植株进行养球及扩繁阶段，待种球
到达一定数量及体量后进行炼苗移栽，成苗之后再分
别进行CMV和LMoV的攻毒试验，看其是否在叶部
及花部形态上表现出抗性。
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