全 文 ：司 :洛乞琅 公 常报 20 0 5, 14 ( 4 ) : 1 7 1一 1 7 3
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百合无症病毒 C P 基因在大肠杆菌中的表达
李 燕 , 李发慧 , 陈毓荃
( 西北农林科技大学生命科学院 ,陕 西杨凌 7 12 1 () ( ) )
摘 要 : 应用 R T 一 (P ’ R 方法从感病百合总 R N A 中扩增 出 l’ 合无症 病毒的外壳蛋自从因片段 , 连接到原核载
体 p U ( ` 1 9 , 转化大肠杆菌 r) H s a 并川 IP ’ TG 诱导表达 。 5 1) S 一 P A G E 及W e s z o r n l) l ( ) z 分析表明 . ( ’ P 摧 I月在大 J汤丰「
菌 ` l,获得 r 特 异性表达 , 融合蛋自分子 吐约为 3 5 k[ ) 。
关键词 : 百合无症病毒 ;外壳 蛋自 ;原核表达
中图分类号 : Q 7 8 5 文献标识码 : A 文章编号 : 1 0 ( ) 4 一 1 3 8 9 ( 2 0 0 5 ) ( ) 2 0 1 7 1一 0 3
T h e E x P r e s s i o n o f L i l y S y m P t o m l e s s C a r l a v i r u s
C P G e n e i n E s c h e r i c h i a C o l i
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t r a n s f o r m e d i n t o E
. `。 11 1) H s a a n d t h e n i n d u e e d b y I P T (分. I t w a s s h o w n t h a t t h e g e n e w : l 、 h l g h l y 。、 n d
。 s p e e i a l l y e x p r e s s e d b y S D S 一 P A (二E a n d W e s t e r n b l o t a n a l y s i s . T h e m o l e e u la r w e i g ll t o f r h e
r e e o m b i n a n t l) r ( ) t e i n w a
s : : b o u r 3 5 k D
.
I` e y w o r d s : I , i l y s y m p t o m l e s s e : l r l。、 v i r u s ; ( 二o a t p r o t e i n ; P r o k a r y o t i e e x )` r e s s io n
百合属植物大约有 1 0 0 多种 , 是世界上 重要
的切花观赏花卉之一 。百合生 长过程中 , 常受到多
种病 毒危 害 , 其 中百 合无 症病 毒 (I 了 il y S y m p ot -
r`i l e s s c a r l a v i r u s
,
I
J
S V )最为常见 。 I矛 S V 在百合上
一 般 不 表 现 明 显 症 状 ; 与 黄 瓜 花 叶 病 毒
( 〔, u e u m b e r m o 、 i e v i r u s . C M V ) 复合 浸染时 , 会
导致植株矮化 , 叶片畸形或产生褪绿斑 ,花期缩短
等 , 严重影响切花品质 ” 一 污 ’ 。 防治此病害的主要方
法是通过组织培养生产脱毒种球 ,而高效 、 灵敏的
检测手段是 首要保证 。 I矛 S V 属香石竹潜隐病毒属
( 〔 、 u ,一 z。 : , , ,一“ 、 )成员 , 是单链正链 R N A 病毒 , 具有此
病毒组的典型特征 。 全基因序列为 8 3 9 4 核昔酸 ,
5 ’ 端 含帽子结构 , 3 ’ 端有 P ol y A 尾巴 , 共有 6 个
开放阅读框 ( 〔)工〕 e n r 。 : : d i n g f r a n g nr e n l , ( ) R F ) ,分
别编码 : R N A 倚赖的 R N A 复制酶 , 三基因连锁结
构 1 ’ (二B l 一 3 , 外壳蛋 自 ( C o : L t p r o l e i n , ( {P ) 和核酸
结合蛋白 ` 一 “ 。 C P 在病毒的传播和保护病毒 R N A
方面起重要作用 。 通过病毒外壳蛋自制备特异性
血清进 行血清学检测 , 灵敏 、 快捷 , 是病 毒检测中
的常用方法 。 本文应用 R T 一 P C R 技术从感病 盯合
中克隆出扩增 出百合无症病毒外壳蛋 白基因 , 并
连接到原核表达载体上 ,在大肠杆菌中得到表达 。
1 材料与方法
1
.
1 材 料
M
一
M I
J
V 反转录酶 , P C R 反应试剂 , D N A 回
收稿日期 : 2 0 0汤一。4 一 。 ! 修回日期
作者简介 : 李 燕 ( 19 8 (〕一 ) . 女 . 硕 十
苦 为通讯作若
:
2 () )石一 0 3 1 7
. 研究 方向为植物病毒学 .通 讯方式 ! 、 a n 2 4色 ! 2 6 . c () n 、 ·
西 北 农 业 学 报 14卷
收 试 剂盒 , 限制 性 内切 酶 艺伪R l 、 B “ m H I 和
I厂r G 、 X 一 G a l 为上海生工公司 , 其余试剂 为国产
分析纯 。 L S V 抗血清为 A g id a 公司产品 。 根据已
发表 的 L S V 核酸 序列设计 引物上 游引物 为 T
匾亘工因 c 八 A T C A (A ; A c c A G c A c , 下 游 引
物为 C 匡丛亘困 A G c c c A A c A A T G T G A , 由
卜海博亚生物工程公司合成并进行质粒测序 。
1
.
2 试验方法
1
.
2
.
1 R T
一
P C R 采 用 异 硫 氰 酸 法 提 取 总
R N A ` 7 `。 取 1 0 0 m g 左右叶片 , 加人 0 . 5 m xJ 变性
溶液研磨成浆 , 分别用水饱酚 \氯仿 ,氯仿抽提 , 等
体积异丙醇沉淀 , 用 70 % 乙 醇洗涤 、 干燥后溶解于
5 0 1, I
J 无 R N A 酶的水中 。
总 反转 录 体系 为 25 川 , : 感 病 百合 总 R N A
9产, I , , 下游 引物 1拌 I才 ( 1 0拼m o l / L ) , 9 4 C 变性 1 0
m in 立刻转 人 冰浴 乌 n 、 in 依次加人 5 丫 反转录
B u f f e r s拜I J , d N T P I拌I廿 ( I Om m o l / I J ) ,加人 R N a s i n
0
.
5拌I J ,反转录酶 l o o U , 4 2 ( ’ 反应 z h 。 取反转录
产物 2川一作为模板 、 引物 P l 、 P Z 各 2拜 I J 、 l o x P e R
B u f f e r ( 含 2 5m m o l / I矛 M g C 12 拜 I J ) 2 . 5 拌I J 、
dN T P O
·
5拌 I矛 、 T a q 酶 3 U 、 1 5产, I J 。 反应程序采取为 :
9 4 C预变性 5 m i n , 9 4 〔 ` 4 5 s e c , 5 7 C 复性 4 5 s e 。 ,
7 2 〔’ 延伸 l m i n ,循环 3 5 次后 7 2 〔 延伸 l o m i n 结
束反应 。 取 5拌L 扩增产物 1%琼脂糖凝胶检测 。
1
,
2
,
2 C P 基因原核表达载体的构建及序列分析
将上述与预期 目的产物大小相 同的条带 , 切胶
回收后用 E co R I 、 B a m H I 双酶切 , 同样双酶切质
粒载体 p U C 1 9 。 将酶切 回收后的 P C R 产物及载体
进行连接 ,转化大肠杆菌 D H S叮图 1 ) 。 微量碱裂解
法提取质粒 , 电泳检测并双酶切验证插人片段 , 阳
性克隆扩大培养送上海博亚生物公司测序 。
升日户帕. 砚派丽叨 8址
L S V CP
图 l 表达载体 p U C I , L s、 ` c l , 构建
F i g
.
1 C o n s t r a e t i o n o f e x P r e s s i o n v e e t o r PU C 1 9
一
L SV C P
1
.
2
.
3 基 因的诱导表达及电泳分析检测 挑取
阳性单菌落于 I J B 液体培养基 ,培养过夜 。 1 , 10
扩大培养至 ( ) D 达到 O , 4一 0 . 6 。 加人 IP T G 至终浓
度为 l m m o l / I J ,继续 3 7 〔` 墙养 3一 4 h 。 离心收集
菌体 , 沉淀用 T r i s 一 H C L ( p H S . o , 10 m m o l / I , ) , 1%
t w e e n
一
2 0
,煮沸 5 m i n ,进行 1 5% S D S 一 P A G E ,然后
W e s t e r n b l o t 检测 。 以 电转仪转印 P V D F 膜 , 5%
脱脂奶粉封闭后依次孵育洗涤 L S V 抗血清 、 碱性
磷 酸酶 标 记羊抗兔抗 体 , 最后 以 N B T / B C IP 显
色 ’吕 ’ 。
2 结果与讨论
2
.
1 C P 基因的 R T 一 P C R 扩增
R T
一
(P 之R 扩增产物经 l %琼脂糖凝胶电泳检
测显示 : 从感病材料中扩增出约 97 7 b p 的条带 , 与
预期片段 大小 一致 ,而健康对照中未扩增 出相应
大小 片段 ,说 明此条带是从病毒基 因组中扩增出
来的 。
2
.
2 重组克隆的筛选及序列测定
对质粒载体进行 E c o R I 、 B u n , H l 酶切分析 ,
可以 见到同 P C R 扩增 片段大小 相似的片段 ( 图
2 )
。 测序结果显示 ,所扩增片段与 N C 一。 。 5 1 3 8 核
酸片断同源性为 98 % , 推测氨基酸序列的同源性
为 9 6% 。
2
.
3 表达产物的检测和分析
菌体沉淀进行 S D S 一 P A G E 后 , 考马斯亮蓝染
色 。结果表明 , 含 目的片段载体的菌株特异地产生
大量表达的条带 , 大约 35 k D , 与预期相符 ( 32 k D
外壳蛋白分子量加上多克隆位点前一小段多肤序
列 ) 。 以 L S V 抗血清对融合蛋 白进行免疫检测 ,
W e s t e r n b l o t 显示 , I J S V 抗血清仅与 目的蛋白反
应 , 与其它条带之间均无反应 ( 图 3 ) ,证明此条带
4期 李 燕等 :百合无症病毒 C P基因在大肠 杆菌中的表达 · 3 1 7.
即所需要的产物 .日 .有良好的抗原性 。
M 23 4
血清 的制 备和病毒 的检测 提供 了很 好 的条件 。
L S VC P基因 3`末段序列与基 因内 0 60 bp左右处
序列高度重复 , 应用其两端序列作为引物很难扩
增 出全长序列 。 本试验用 C P 基因后 I OOb p 左右的
序列作为引物 ,避开此段序列 ,并 且扩增 目的片段
中含有基因本身的终止密码子 , 不表达插人序列
后 L ac Z 多肤片断 ,成功构建了转化了 L S V 外壳
蛋白的大肠杆菌菌株 , 能够提供纯化重组蛋 白用
于抗血清制备 。
M
:
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; 一r k。 }I t ` l一{I v 11 1、 、 V C P 致谢 : 感谢厦 门 出入境检验检疫局的 林石 明
3
.
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m记 , 4 . 2) / E e o R I + l a n 、 H l
图 2 R T 一 P c R 扩增 结果和重组质粒的酶切分析
先生提供感病百合及 L S V 杭血清 。
l了19 2 R T 一 P C R r e s u lt s o f L S V C P a n d e n z y m e d i g e s t e d
P r o d u c t o f r e c o m b i
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1 8 9~ 】9 1.
图 3 表达产物的 S D S 一 P A G E 和 W e s t e r n b l o t 分析
F i g
·
3 T h e SD S
一
P A G E a n d W
e s t e r n b l o t a n a ly s i s o f
t h e e x P r e s s io n P r o t e i n
指示植物法 、 电镜检测 、 血清学检测和分子生
物学方法是植物病毒检测的 4 种基本方法 ,其 中
血清学检测方 法方便 、 快捷 、 准确 , 应用最 为广
泛叫 。 I一 S V 病毒粒体呈线状 ,仅在百合属郁金香
属植物中繁殖 , 寄主范围狭窄 ,不易提取制备 。 利
用分子生物学方法将 L S V 的 C P 基因在大肠杆菌
中进行了原核表达 ,分离纯化出 目的蛋白 , 为其抗
[ l〕 e h o i 5 A . R y L. K H . 1’ h e ( ’ o n l一, le , e N u c l。 〔〕` 、 d e s 。 《王u e n c c o f
T h e ( ; e n (〕m e R N A o f I i l y S y m p l o n l l e s s V i r u s 矛一n d I t s
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( ) n l户a r i s o n W i、 h T h a l o f ( ) l h o r ( Za r l a v i r u s e s [ J ]
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,
2 0 ( ) 3
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] 4 8 ( 10 )
: ] 9 4 3一 5 5 .
[ 5 ] z h e n g H Y
.
( ) e c u r r e n e e a n d S
e t一u e n e o s o f l · i ly M 、 ) t l l e
V i r u s 赶、 n d l i ly S y m p t o m l e s s V i r u s t n P [ a n t s (二r o w t l F r ( ) m
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〕。。 r l e d B u l l ) 5 i n Z h e zi a n g P r o v i n e 。 [ J 」. ( 、 l、 in a A r o h
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,
1 1 8 ( 1 2 )
:
2 4 1 9一 2 4 28 .
[ 6 〕 W o n g s M , I o e K C , Y u H H , 。 t a l . P h y lo g e n e t i ( A n a l y s i、
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s , 1 9 98
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16 ( 3 )
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2 9 5一 3 0 2二〔7习 李永明 . 赵玉琪 , 等 . 实用分子生物学方法手册仁M 』. 北京 :科学出版社 , 1 9 9&仁8 〕 :1- 关林 , 方宏揭 . 植物基因工程原理与技术〔M 〕. 北京 : 科学出版社 , 19 .8[ 9口 袁小环 .李 青 . 血清学方法和分子生物学方法检测植物病
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