全 文 ：中国农学通报 2011,27(04):144-147
Chinese Agricultural Science Bulletin
0 引言
百合（Lilium spp.）是百合科百合属重要的观赏植
物[1]。近年来，中国百合种植业发展迅速，已成为一些
地区主要的经济支柱产业[2]。但随着百合种球大量进
口以及多年无性繁殖，百合病毒病也日趋严重，已成为
制约中国百合产业化发展的最大瓶颈。目前国内外报
道的对百合危害最为严重的病毒有 2种，百合无症病
毒（Lily symptomless virus，LSV）和百合斑驳病毒
（Lily mottle virus，LMoV）[3]，这 2种病毒复合感染后，
会加重百合的病症，造成产量和质量的严重下降[4-5]。
目前百合病毒病的防治主要以组培脱毒为主[6]，该方法
治标不治本，不能从根本上根治病毒，已成为亟待解决
的难题。近年利用RNAi沉默技术培育抗病毒转基因
植物已有报道[7]，用该方法培育抗病毒百合的研究也刚
刚起步，百合无症病毒的基因克隆以及载体构建已经
成功[8]。但百合一般是多种病毒复合感染，必须构建抗
多种病毒沉默载体才能培育出广谱抗病性植株。
本研究首先用重叠延伸 PCR 技术将 LSV 和
LMoV外壳蛋白（CP）基因的反向重复序列融合，利用
Gateway技术构建抗LSV和LMoV的双抗RNAi表达
载体，转染百合最终获得抗LSV和LMoV植株，为百
合抗病性分子育种的深入研究奠定了理论基础。
1 材料和方法
1.1 材料与试剂
本实验材料东方百合‘索邦’来源于大连理工大学
植物基因工程研究室。Gateway pDONRTM 201 Vector、
基金项目：国家自然科学基金“siRNA抑制百合无症病毒(LSV)表达的研究”（30771760）。
第一作者简介：徐品三，男，1968年出生，副教授，博士，主要从事球根类花卉病毒防治及抗病性分子育种的研究。通信地址：116023大连市凌工路2
号大连理工大学生命科学与技术学院，Tel：0411-84706356-606，E-mail：xupinsan@sina.com。
收稿日期：2010-09-03，修回日期：2010-11-11。
Gateway技术快速构建百合双价抗病毒RNAi表达载体
徐品三，白建芳，刘纪文，李焕改
（大连理工大学生命科学与技术学院，辽宁大连 116023）
摘 要：为获得适合转化百合的双价RNAi表达载体，以感病百合叶片的总RNA为模板，分别扩增400 bp
左右的LSV和LMoV CP基因。通过重叠延伸PCR技术获得长约800 bp的LSV-LMoV融合基因。利用
Gateway技术，通过BP反应及LR反应将LSV-LMoV融合基因克隆到双元载体pH7GWIWG2(Ⅱ)，成功
构建了含 2种病毒基因的RNAi表达载体 pH7GWIWG2(Ⅱ)-LSV-LMoV。将构建好的双价表达载体导
入农杆菌EHA105，PCR和测序表明所构建的载体及获得的工程菌与预期的完全一致。
关键字：百合无症病毒；百合斑驳病毒；RNAi载体；重叠延伸PCR；Gateway技术
中图分类号：Q782 文献标志码：A 论文编号：2010-2605
Construction of LSV and LMoV Binary Virus Resistant RNAi Vector Using Gateway Technology
Xu Pinsan, Bai Jianfang, Liu Jiwen, Li Huangai
(School of Life Science and Biotechnology, Dalian University of Technology, Dalian Liaoning 116023)
Abstract: In order to gain the RNA interference (RNAi) transformation vector of lily, two fragment genes about
400 bp of LSV and LMoV were obtained from the total RNA of lily leaves infected. LSV-LMoV fusion gene was
constructed by recombinant PCR technique. Using Gateway cloning technology, the RNAi transformation
vector pH7GWIWG2 (Ⅱ) was constructed by BP and LR recombination reactions. PCR and sequencing
analysis confirmed that the pH7GWIWG2 (Ⅱ)-LSV-LMoV vector, a binary vector containing two different
virus genes, was obtained successfully. Virus susceptible lily was transformed with pH7GWIWG2
(Ⅱ)-LSV-LMoV by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation.
Key words: lily symptomless virus; lily mottle virus; RNAi vector; recombinant PCR; gateway technology
徐品三等：Gateway技术快速构建百合双价抗病毒RNAi表达载体
BP ClonaseTM Ⅱ Enzyme Mix、LR ClonaseTM Enzyme
Mix等购自美国 Invitrogen公司，pH7GWIWG2（II）双
元载体购自VIB公司；E.coli DH5α、EHA105、RNA提
取试剂TRIzol、RNA反转录试剂、Taq DNA聚合酶、质
粒小量制备试剂盒、切胶回收试剂盒、克隆载体
pMD18-T vector 以及各种限制性内切酶为大连
TaKaRa公司产品；PCR引物由大连 TaKara公司合
成。实验中用到的其他药品均为分析纯级。
1.2 LSV、LMoV CP基因的克隆
采用Trizol法提取感病百合叶片总RNA，根据已报
道的LSV以及LMoV序列，利用primer5.0软件分别设
计合成特异性引物（表 1），利用 RT-PCR方法合成
cDNA。以反转录后的 cDNA为模板，进行PCR反应：
94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延
伸1 min，35个循环；72℃后延伸10 min。将PCR产物回
收、测序并分析。
图1 重组表达载体pH7GWIWG2(Ⅱ)-LSV-LMoV的结构示意图
名称
LSV-F
LSV-R
LMoV-F
LMoV-R
LSV-LMoV-F
LSV-LMoV-R
attB-LSV-F
attB-LMoV-R
attB-adapter-F
attB-adapter-R
引物序列
5-gctctagagcatgaaggttggcgtcgta-3
5-cgcggatcccctcagcagaagtgggtc-3
5-cgcggatccggcacctcaccaaatgta-3
5-ccggaattctctccgtgtcctcatctt-3
5-atcaggcgacccacttctgctgaggggcacctcaccaaatgtaaatggcg-3
5-cgccatttacatttggtgaggtgcccctcagcagaagtgggtcgcctgat-3
5-caaaaaagcaggctatgaaggttgg-3
5-caagaaagctgggttctccgtgtcct-3
5-ggggacaagtttgtacaaaaaagcag-3
5-ggggaccactttgtacaagaaagct-3
表1 PCR扩增用引物序列
1.3 LSV-LMoV融合基因的获得
以LSV和LMoV目标片段基因，分别设计特异性
引物，采用重叠PCR技术进行拼接。第一步，分别以
LSV-F和LSV-LMoV-R，LSV-LMoV-F和LMoV-R为引
物，以纯化的LSV，LMoV CP基因片段为模板，分别进
行PCR扩增。反应参数为：94℃预变性 5 min；94℃变
性30 s；57℃退火60 s；72℃延伸1 min；35个循环；72℃
延伸 10 min。扩增后分别命名为 LSV-2和 LMoV-2。
第二步，以 LSV-F，LMoV-R 为引物，以纯化的
LMoV-2，LSV-2作为模板进行PCR反应，反应参数为：
94℃预变性5 min；94℃变性30 s，56.5℃退火60 s，72℃
延伸 1 min，35个循环；72℃后延伸 10 min。获得的目
标片段大约800 bp，命名为LSV-LMoV融合基因。
1.4 Gateway技术构建RNAi载体
根据Gateway克隆技术的要求设计B序列引物，用
于扩增带有B序列接头LSV-LMoV融合基因。鉴于B序
列较长（29 bp），故采用2次PCR的方法将B序列分别加
到融合基因的上下游。将PCR产物纯化，回收并测序。
利用此PCR体系与pDONRTM 201 Vector进行BP反应，
获得 pDONR201-LSV-LMoV，将反应后的溶液转化E.
coli DH5α，37℃培养16 h后，用PCR方法筛选出阳性克
隆，并测序鉴定。将获得的线性重组入门克隆与表达载
体 pH7GWIWG2（II）进行LR反应，获得 pH7GWIWG2
(Ⅱ)-LSV-LMoV表达载体（图1）。将获得的表达载体转
化E.coil DH5α。该表达载体转染百合后，将会形成发卡
式RNA结构（图2），从而达到RNA干扰效应。
1.5 工程菌的获得
将表达载体用电击转化法转化EHA105[9]，28℃培
养16 h，进行菌液PCR检测。
2 结果与分析
2.1 LSV，LMoV CP基因的克隆
以LSV，LMoV总RNA为模板进行特异性PCR反
应，可分别获得439 bp和376 bp的2个片段（图3）。将
片段分别克隆至pMD18-T vector，并测序。
2.2 LSV-LMoV融合基因的获得
2.2.1 初次 PCR反应 以LSV部分CP基因为模板，以
LSV-F，LSV-LMoV-R为引物；以 LMoV部分 CP基因
为模板，以 LSV-LMoV-F，LMoV-R为引物，进行 PCR
扩增，经 1.5%的琼脂糖凝胶检测，可获得带有互补重
叠序列的LSV-2和LMoV-2两个片段。
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2.2.2 重叠延伸 PCR 反应 以初次 PCR 反应产物
LSV-2，LMoV-2为模板，以LSV-F、LMoV-R为引物，进
行PCR扩增、拼接，经1.5%的琼脂糖凝胶检测，获得了
LSV-LMoV融合基因片段（图4）。将LSV-LMoV融合
基因转入 PMD18-T vector测序，经双酶切检测（图 5）
及测序表明融合基因已经克隆成功（表2）。
2.3 入门载体 pDONR201-LSV-LMoV 与表达载体
pH7GWIWG2(Ⅱ)-LSV-LMoV的构建
在目的基因上下游加入特定的B接头序列，这样
才可保证融合基因产生Entry克隆。利用设计的 2组
引物，分别进行2次PCR反应后，获得带有 attB重组位
点的融合基因的 PCR产物。测序表明融合基因
LSV-LMoV两端已经加入 attB接头序列，且阅读框正
确，未发生移码。
将BP反应产物转化E.coil DH5α后，挑单克隆菌
利用特异性引物LSV-F和LMoV-R进行PCR扩增，得
到约 800 bp 的目标产物（图 6）。表明融合基因
LSV-LMoV已经插入到pDONR201TM vector中，即为入
门载体。对插入到RNAi载体PH7GWIW2 (Ⅱ)上融合
基因LSV-LMoV用特异性引物进行PCR扩增，获得一
条 873 bp的特异性DNA片段（图 7），与预期结果一
致，表明RNAi表达载体构建成功。
2.4 表达载体 pH7GWIWG2(Ⅱ)-LSV-LMoV的农杆菌
转化
将LR反应所得载体转入农杆菌EHA105，用引物
图2 hpRNA发卡式结构
1000 bp
500 bp
439 bp
M LSV
750 bp
M LMoV
1000 bp
750 bp
500 bp
376 bp
M: DL2000；LSV: LSV CP基因；LMoV: LMoV CP基因
图3 LSV与LMoV PCR鉴定
A B
2000 bp
750 bp
500 bp
815 bp
M LSV-LMoV
1000 bp
2000 bp
750 bp 目的片段
M 1
M: DL2000；LSV-LMoV: LSV-LMoV融合基因PCR产物
图4 融合基因LSV-LMoV PCR鉴定 图5 融合基因LSV-LMoV酶切鉴定
M: DL2000；1: LSV-LMoV经EcoRⅠ和HindⅢ酶切
attB-R 和 attB– F 进行 PCR 鉴定，证明表达载体
pH7GWIWG2(Ⅱ)-LSV-LMoV成功转入农杆菌（图8）。
3 结论与讨论
利用RNAi原理进行植物抗病毒研究一般只对某
一特定病毒进行，但病毒对寄主植物的侵染经常是多
种病毒复合侵染，因此抗单一病毒的沉默载体远远不
能满足实际需要。本研究将LSV和LMoV两种百合
病毒的部分外壳蛋白基因的保守区融合在一起，利用
Gateway重组技术构建了适合百合转化的双元表达载
体 pH7GWIWG2(Ⅱ)-LSV-LMoV，对百合抗病毒的深
入研究以及多基因的转化可行性探讨具有重要意义。
传统的多基因重组通常需要构建多个中间载体，
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徐品三等：Gateway技术快速构建百合双价抗病毒RNAi表达载体
还要经过多次的酶切、连接和转化。在利用酶切位点
进行连接时经常会受到DNA限制性内切酶以及基因
内部本身酶切位点的限制。本研究利用重叠延伸
PCR技术将LSV和LMoV外壳蛋白基因通过末端互
补、重叠延伸进行体外重组连接，突破了传统的连接方
法，大大减少了连接、转化次数，同时减小了碱基突变
的概率，摆脱了DNA限制性内切酶以及基因内部本身
酶切位点的制约，大大提高了工作效率。
Gateway技术是根据λ噬菌体的位点特异性重组
系统开发的一种新的DNA体外重组克隆技术，它突破
传统的质粒构建模式，只通过BP反应和LR反应就可
将目的基因高效和快速地构建到表达载体中，大大精
1 atgaaggttg gcgtcgtatc taacaacacg gcaaccactg aacaaatggc caagatagcg
61 tcagacatcg cagggcttgg ggtaccaacg gagcacgtcg catcagtaat attgcaaatg
121 gtcatcatgt gtgcttgcgt gagcagttcg gcgttccttg accctgaggg cagcattgag
181 tttgagaatg gagcggtgcc cgtcgactcc atcgctgcga tcatgaagaa gcacgctgga
241 ctgcggaaag tctgccggct ctatgcccca atcgtgtgga acagcatgct tgtgcgaaat
301 caaccaccag ctgattggca agctatgggc ttccaataca acacgcggtt cgcagctttt
361 gacaccttcg actacgtgac taaccaggcg gctatccaac ctgtcgaggg gatcatcagg
421 cgacccactt ctgctgaggg gcacctcacc aaatgtaaat ggcgcgtggc tcatgatgga
481 cggagatcag caagttgaat ttccattacg tcccataatt gaacacgcaa aaccgacgct
541 gcgccagatc atggcgcatt tctcgcatct cgctgaagca tatattgaga aacaaaatgc
601 agagaaaccg tacatgccta ggtacggcct tcagcgaaat ctcaccgatt tcacgctagc
661 acgattcgct ttcgatttct atgaggtgac ttcacgcacg cccgcgcgag cgaaggaagc
721 acacttccag atgaaaacag ccgccttgcg cggaaaacaa tcgaagctat ttgggttaga
781 tggaaaggtg accacccaag atgaggacac ggaga
表2 融合基因LSV-LMoV序列
1000 bp
750 bp 目的片段
M 1 2
M: DL2000；1,2: BP反应质粒PCR产物
1000 bp
750 bp 目的片段
M 1 2 3 4 5
M: DL2000；1~5: LR反应质粒PCR产物
图6 BP反应质粒PCR鉴定
图7 LR反应质粒PCR鉴定
1000 bp
750 bp
目的片段
M 1 2 3 4 5 6
M: DL2000；1~6: PCR产物
图8 农杆菌pH7GWIWG2(Ⅱ)-LSV-LMoV/EHA105PCR鉴定
简了克隆的步骤，从目的片段的PCR扩增到表达载体
的获得，只需要很短的时间就能达到预期结果；保持了
基因定位和阅读框架的正确性[10]，保证了构建的双抗
载体可以有效的表达 dsRNA。利用该技术构建的是
双元载体，可以直接用于农杆菌的转化，获得双抗转基
因植株，同时也为高通量研究百合的基因功能提供更
有效的方法。
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