全 文 ：分子植物育种，2013年，第11卷，第1期，第139-144页
MolecularPlantBreeding,2013,Vol.11,No.1,139-144
研究报告
ResearchReport
风信子ISSR-PCR体系的优化及引物筛选
胡凤荣 1,2*王斐 2 王志强 1 任翠 2 鲍仁蕾 2
1北京林业大学,北京,100083;2南京林业大学,南京,210037
*通讯作者,hufengrong2003@sina.com
摘 要 以风信子基因组DNA为ISSR-PCR扩增模板，采用单因素试验方法，对影响PCR扩增体系中Mg2+
浓度、dNTPs、模板DNA及引物浓度、Taq酶的用量5个因素进行研究，建立了风信子ISSR-PCR扩增最佳反应
体系，即：20μL反应体系中分别加入2μL10×Buffer、1.4μLMg2+(25mmol/L)、1.5μLdNTPs(2.5mmol/L)、
1.5μL引物(10pmol/μL)，0.2μLTaq酶(5U/μL)，1.2μL模板(30ng/μL)，ddH2O补足体积。并以此体系对110
条引物进行筛选，最终获得了多态性高，重复性好的引物12条。
关键词 风信子,ISSR-PCR,引物筛选
Opti mization of ISSR-PCR Reaction System and Primer Selection for
Hyacinth
HuFengrong1,2*WangFei2 WangZhiqiang1 RenCui2 BaoRenlei2
1BeijingForestryUniversity,Beijing,100083;2NanjingForestryUniversity,Nanjing,210037
*Correspondingauthor,hufengrong2003@sina.com
DOI:10.3969/mpb.011.000139
Abstract Genomic DNA extracted from Hyacinth was used as template for ISSR-PCR, the impact factors in
PCR system, Mg2+concentration, dNTPs, template DNA, primer concentration andTaq polyme as , were studied
using a single factor experiment method by setting up different volume gradient to establish the hyacinth
ISSR-PCR reaction system. The experiment results showed that the best reaction system was adding in turn with
2μL10×Buffer,1.4μLMg2+(25mmol/L),1.5μLdNTPs(2.5mmol/L),1.5μLprimer(10pmol/μL),0.2μLTaq
polymerase(5U/μL,1.2μLtemplate(30ng/μL),andddH2Oto20μLatlast.AccordingtothisPCRsystem,110
primerswereselected,eventuallythirteenprimersshowedhighpolymorphismandrepeatability.
Keywords Hyacinth,ISSR-PCR,Primerselection
收稿日期：2012-09-29 接受日期：2012-10-20 网络出版日期：2012-11-16
URL:http://5th.sophiapublisher.com/abstract-1297-mp opa
基金项目：本研究由中国博士后科学基金面上项目(20100470217)和江苏省高校优势学科建设工程项目共同资助
风信子是百合科(Liliaceae)风信子属(Hyacinth)
的球根花卉，原产于地中海和南非(义鸣放,2001,中
国农业大学出版社,pp.104)。花期早、花序端庄，花色
丰富，具有浓郁的芳香气味，可以片植于花坛、花境、
花丛及疏林边和草地，具有浓厚的春天气息，鳞茎水
养，放置书桌、案头，新奇别致，是春季重要的观赏植
物。国内目前对风信子的研究多集中在组织培养(吕
燕波等,1998;刘勇刚和徐子勤,2001;车生泉和王彩
波, 2003)、繁殖(熊瑜和史益敏, 2007;罗凤霞等,
2008;孙莉莉等,2008)、栽培(韩鹰等,2005;杜方和丁
永强,2006;熊瑜,2007;刘建敏等,2007,北方园艺,3:
124-126)、花粉及病毒检测(周秀涛等,1996;胥婧等,
2007)等方面，关于风信子分子标记的研究报导还
未见报道。
ISSR分子标记技术是基于PCR技术发展起来
的，其反应结果主要受到 TaqDNA聚合酶、引物、模
板、Mg2+、dNTPs等五种因素的影响。本研究以风信
子基因组 DNA为模板对 ISSR-PCR反应体系进行
优化，旨在获得适合风信子ISSR-PCR反应的最优体
系，并以此体系对110条引物进行筛选，为进一步开
分子植物育种
MolecularPlantBreeding
展风信子分子标记研究提供技术支撑。
1结果与分析
1.1风信子 ISSR-PCR扩增反应体系的建立与优化
1.1.1Mg2+浓度对ISSR-PCR反应的影响
Mg2+浓度对反应的特异性和PCR的效率影响都
较大(刘维全等,2009,化学工业出版社,pp.104-106)，
它不仅影响 TaqDNA聚合酶的活性，还会与dNTP、
模板、引物结合，影响模板与引物的结合效率、模板
与PCR产物的解链温度、产物的特异性以及引物二
聚体的形成(曹冬梅等, 2011;林万明, 1993,人民军
医出版社, pp.7-14)。本研究设置8个体积梯度，从
图1中可以看出当Mg2+体积在2.0~1.2μL时均能获
得较多的条带，但体积为1.4μL时，条带清晰，亮度
也较高，且重复性较好；当Mg2+体积小于1.2μL时，
扩增谱带缺失，由此可知，风信子ISSR-PCR反应的
最佳Mg2+浓度为1.4μL。
DNA模板浓度要求范围较为宽泛，这与庞赫等
(2010)、潘丽梅等(2009)等人的研究结果一致。当模
板体积在2~0.6μL的范围内时扩增条带基本一致，
当体积为0.4μL时，扩增条带较少，背景相对也较模
糊，从节约实验材料考虑，选择模板体积为1.0μL。
1.1.4引物浓度对ISSR-PCR反应的影响
引物是PCR特异性反应的关键，浓度太低，扩
增产量少，浓度过高会引起错配和非特异性扩增，
且可增加引物之间形成二聚体的机率(曹冬梅等,
2011;姜荣波,2011;林万明,1993,人民军医出版社,
pp.7-14)。本研究中(图4)引物体积为1.8~1.0μL时，
扩增条带清晰，并且体积为1.5μL时，条带最亮；当
体积在2.4~2.0μL时，扩增不完全，当体积为0.8μL
时主带缺失，条带较为模糊，因此，本实验选择1.5μL
作为最优体积。
1.1.5TaqDNA聚合酶对ISSR-PCR反应的影响
TaqDNA聚合酶对PCR反应有直接影响，其使
用量过低时，可能会导致扩增条带缺失甚至扩增失
1.1.2dNTPs浓度对ISSR-PCR反应的影响
dNTPs的质量和浓度与PCR的扩增效率有着密
切的关系。dNTPs是PCR反应的原始材料。dNTPs
浓度过高，会导致聚合酶错误掺入，产生非特异性扩
增产物，过低则会造成扩增产物量少。如图2所示，
本研究所设置的dNTPs体积梯度范围内均能扩增出
条带，当体积为3.0~2.2μL范围内时条带较清晰，当
体积为1.5μL时扩增条带最多，且经重复实验确定
较为稳定，体积为1.0μL时由于浓度过低，扩增条带
缺失且背景比较模糊，故最佳dNTPs体积为1.5μL。
1.1.3DNA模板浓度对ISSR-PCR反应的影响
从图 3中可以看出风信子 ISSR-PCR反应对
图1Mg2+浓度对ISSR-PCR反应的影响
注:M:DL2000DNAmarker;1~8:2μL,1.8μL, .6μL,1.4μL,
1.2μL,1.0μL,0.8μL和0.4μL的25mmol/LMg2+
Figure1EffectofMg2+c n rationonISSR-PCRreaction
Note:M:DL2000DNAmarker;1~8:2μL,1.8μL,1.6μL,1.4μL,
1.2μL,1.0μL,0.8μL,0.4μL25mmol/LMg2+
图2dNTPs浓度对ISSR-PCR反应的影响
注:M:DL2000DNAmarker;1~8:3μL,2.5μL,2.2μL,2.0μL,
1.8μL,1.5μL,1.2μL和1.0μL的2.5mmol/LdNTPs
Figure2EffectofdNTPsconcentrationsonISSR-PCRreaction
Note:M:DL2000DNAmarker;1~8:3μL,2.5μL,2.2μL,2.0μL,
1.8μL,1.5μL,1.2μL,1.0μL2.5mmol/LdNTPs
图3DNA模板浓度对ISSR-PCR反应的影响
注:M:DL2000DNAmarker;1~9:2.0μL,1.8μL,1.6μL,1.4μL,
1.2μL,1.0μL,0.8μL,0.6μL和0.4μL的30ng/μLDNA
Figure 3 Effect of DNA template concentrations on ISSR-PCR
reaction
Note:DL2000DNAmarker;1~9:2.0μL,1.8μL,1.6μL,1.4μL,
1.2μL,1.0μL,0.8μL,0.6μL,0.4μL30ng/μLDNA
140
表1筛选出的风信子ISSR引物
Table1SelectionofISSRPrimerinHyacinthus
引物编号
PrimerNo.
3A01
3A39
3A56
3A62
UBC814
UBC815
UBC824
UBC807
UBC811
UBC834
UBC845
UBC873
引物序列(5→3)
Primersequence(5→3)
(GA)8TC
(AG)7CTT
(TG)7ACG
(TG)7ACT
(CT)8A
(CT)8G
(TC)8G
(AG)8T
(GA)8C
(AG)8YT
(CT)8RG
(GACA)4
图4引物浓度对ISSR-PCR反应的影响
注:DL2000DNAmarker;1~8:2.4μL,2.2μL,2.0μL,1.8μL,
1.5μL,1.2μL,1.0μL和0.8μL的10pmol/μLprimer(UBC834)
Figure4EffectofPrimerconcentrationsonISSR-PCRreactio
Note:DL2000DNAmarker;1~8:2.4μL,2.2μL,2.0μL,1.8μL,
1.5μL,1.2μL,1.0μL,0.8μL10pmol/μLprimer(UBC834)
败，但其使用量过高时，不仅造成经济上的浪费，还
有可能导致非靶序列的扩增。根据图5的扩增结果
可以看出，0.1~0.5μL的 U/μLTaqDNA聚合酶均可
以扩增出条带，但0.4μL和0.5μL扩增的条带相对
较弱一些，经重复试验确定，0.2μL的5U/μLTaqDNA
聚合酶扩增产物最为稳定，因此选择0.2μL的5U/μL
TaqDNA聚合酶作为风信子ISSR-PCR最优体积。
图6部分引物初筛结果
Figure6ISSRprofileofprescreeningagainstsample
12条扩增条带清晰，重复性好，多态性高的风信子
ISSR引物(表1)。
2讨论
实验结果表明：Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度
及 Taq酶的量对扩增影响较大，浓度过高或过低时
常导致背景弥散或条带缺失；DNA模板浓度对扩增
影响较小，在设置的浓度范围内条带变化不大。在试
验设计中DNA模板没有去除降解的RNA，但对IS-
SR-PCR扩增并没有影响，说明 ISSR-PCR扩增对
DNA模板质量要求并不是太高。
风信子ISSR-PCR体系的优化及引物筛选
OptimizationofISSR-PCRReactionSystemandPrimerSelectionforHyacinth
1.2 ISSR引物的筛选与扩增
根据以上优化条件反复试验，最终确立适合风
信子ISSR-PCR扩增的反应体系，即20μL的总反应
体积，包括2.0μL10×Buffer、1.4μL25mmol/LMg2+、
1.5μL2.5 mmol/LdNTPs、1.5μL10 pmol/μL引物、
0.2μL5U/μLTaq聚合酶、1.0μL30ng/μLDNA模
板，最后用双蒸水补足体积。并用此体系筛选加拿大
哥伦比亚大学公布的引物序列及日本MasumiYam-
gaihsi等人在百合研究中所采用的3AISSR引物序
列，共110条引物。经过初筛和复筛(图6;图7)获得
图5Taq酶浓度对ISSR-PCR反应的影响
注: M: DL2000 DNA marker; 1~5: 0.1μL, 0.2μL, 0.3μL和
0.4μL5U/μLTaqpolymerase
Figure5 Effect ofTaq polymerase concentrations on ISSR-PCR
reaction
Note:M:DL2000DNAmarker:1~5:0.1μL,0.2μL,0.3μL,0.4μL
5U/μLTaqpolymerase
图74份模板对部分引物复筛的结果
注:M:DL2000marker
Figure 7 ISSR profile of several primers against four samples
DNAtemplates
Note:M:DL2000marker
141
分子植物育种
MolecularPlantBreeding
反应成分
Reactioncomponents
25mmol/LMg2+
2.5mmol/LdNTP
30ng/μLDNA
10pmol/μL引物
10pmol/μLprimer
5U/μLTaq聚合酶
5U/μLTaqpolymerase
2.0
3.0
2.0
2.4
0.1
1.8
2.5
1.8
2.2
0.2
1.6
2.2
1.6
.0
0.3
1.4
.0
1.4
1.8
0.4
1.2
1.8
1.2
1.5
0.5
1.0
1.5
1.0
1.2
.8
1.2
.8
1.0
0.4
1.0
0.6
.8
0.4
梯度设计(μL)
Gradientdesign(μL)
表2ISSR-PCR反应体系各成分优化试验设计(20μL)
Table 2 Optimum design of components for ISSR-PCR reaction
(20μL)
参照胡凤荣等(2011)、姜荣波(2011)、曹冬梅等
(2011)等人相关研究，本研究扩增程序采用TD-PCR，
结果表明TD-PCR可以很好的应用于风信子扩增程
序。最终得到风信子ISSR-PCR扩增体系为：即20μL
的总反应体积，包括2μL10×Buffer、1.4μL25mmol/L
Mg2+、1.5μL2.5mmol/LdNTP、1.5μL10pmol/μL引
物、0.2μL 5 U/μLTaq 聚合酶、1μL 30 ng/μL模板
DNA，最后用双蒸水补足体积。扩增程序为：94℃预
变性5min；94℃变性40s，54℃退火45s，72℃延伸
90s，3个循环；94℃变性40s，52℃退火45s，72℃延
伸 90 s，10个循环；94℃变性 40 s，51℃退火 45 s，
72℃延伸 90 s，20个循环；94℃变性 40 s，50℃退火
45s，72℃延伸90s，20个循环；72℃延伸8min，最后
4℃保存。
ISSR是一种基于PCR的分子标记技术，其原理
与RAPD相似，但可以检测到更高的种间遗传差异，
稳定性亦较高(邢志兵, 2009;潘丽梅等, 2009;高山
等,2010)，其反应体系也受反应条件、扩增程序及物
种的影响，本研究采用与风信子同科的岷江百合
PCR扩增的最优反应体系作为该实验的原初扩增体
系，避免了一定的盲目性。在原初扩增体系的基础上
对各个因素进行优化，筛选出最优反应体系和引物，
用以进行30个风信子品种的ISSR分子标记研究及
其杂种后代鉴定。
3材料与方法
3.1实验材料与试剂
本研究供试的风信子种球购自荷兰，先取其嫩
叶，用70%酒精对叶片表面消毒，用纯净水冲洗干
净，然后置于-70℃冰箱中保存备用。dNTPs、Mg2+、
10×Buffer(Mg2+Free)、TaqDNA聚合酶、ISSR引物、
DNAMarker (DL100)，均于上海赛百盛生物工程有
限公司购买。
3.2实验方法
3.2.1基因组DNA的提取
DNA的提取采取简易CTAB法(胡凤荣等,2011)，
DNA质量检测采用0.8%琼脂糖电泳，DNA纯度和
浓度测定使用 U-008OD核酸测定仪，DNA浓度稀
释至最终30ng/μL。
3.2.2ISSR-PCR反应条件优化设计
参考相关文献(周凌瑜等,2008;邓明文等,2007;
胡凤荣等, 2011)，将该实验的原初扩增反应体系定
为20μL，包括10×PCRBuffer2μL、25mmol/LMg2+
1μL、2.5mmol/LdNTP2μL、10pmol/μL引物1μL、
5U/μLTaq聚合酶0.1μL、30ng/μL模板2μL，最后
用双蒸水补足体积。在此基础上，对DNA扩增中5
个参数进行体积梯度设置(余艳等, 2003;罗欣等,
2010) (表 2)，并用引物 UBC807和 UBC834进行最
优条件的筛选，每个梯度实验至少重复3次，直至实
验结果稳定。用最优体系，一个模板对110条ISSR
引物进行初步筛选，再用3~4个模板进行复筛，将
扩增条带清晰，多态性好，重复性好的引物用于风信
子的扩增。
3.2.3ISSR-PCR扩增
参照胡凤荣等(2011)、姜荣波(2011)、曹冬梅等
(2011)等人的相关研究，在杭州朗基MG96+PCR仪
上扩增，扩增程序采用Touch-Down-PCR(降落PCR)，
即94℃预变性5min；94℃变性40s，54℃退火45s，
72℃延伸 90 s，3个循环；94℃变性 40 s，52℃退火
45 s，72℃延伸90s，10个循环；94℃变性 40 s，51℃
退火45s，72℃延伸90s，20个循环；94℃变性40s，
50℃退火45s，72℃延伸90s，20个循环，最后72℃
延伸8min，最后4℃保存。
3.2.4反应产物的电泳与检测
使用2%琼脂糖胶goldview染色，在电压不超过
5V/cm的电场强度下，1×TAE缓冲液中，电泳90min，
黑马凝胶成像系统上观察成像。
3.3引物的筛选
利用上述的PCR优化条件，随机选择一种样品
作为DNA模板，按照多态性高、条带清晰、重复性好
的原则对110条引物进行初筛，再用3~4个样品对
筛选好的引物进行复筛，选出最终适用引物。
142
作者贡献
任翠、鲍仁蕾是本研究的实验设计和实验研究
的主要执行人；王斐、王志强完成数据分析，论文初
稿的写作；王斐、王志强参与实验设计及实验研究；
胡凤荣是项目的构思者及负责人，指导实验设计、数
据分析、论文写作，确定修改及定稿。全体作者都阅
读并同意最终的文本。
致谢
本研究由中国博士后科学基金面上项目(2010-
0470217)和江苏省高校优势学科建设工程项目共同
资助。
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