全 文 ：西北农业学报　2007 , 16(4):142～ 147
Acta Ag riculturae Boreali-occidentalis S inica
农杆菌介导的普利安娜百合鳞茎
直接分化受体系统的建立*
赵欢蕊 ,刘雅莉* ,王跃进
(西北农林科技大学园艺学院 ,陕西杨凌　712100)
摘　要:以亚洲百合“普利安娜”为材料 , 通过不定芽诱导 、植株再生及抗生素敏感性试验 ,建立了百合直接分
化受体系统。结果表明:鳞片和试管苗鳞片叶不定芽分化培养基均以 MS+BA2. 0 mg / L+NAA0. 2 mg /L 为
最佳;试管苗小叶柄分化不定芽培养基以 MS+BA1. 0 mg /L+NAA0. 3 mg / L 为宜;1 /2MS+IBA0. 5 mg /L
+90 g Sucrose+暗培养 1 个月后再光照培养可诱导形成试管苗鳞茎;生根的适宜培养基为 1 /2MS +IBA0. 5
mg /L+0. 1%活性炭;卡那霉素筛选浓度鳞片为 150 mg / L ,鳞片叶为 100 mg /L 。
关键词:亚洲百合;农杆菌介导;遗传转化;直接分化受体系统
中图分类号:Q813. 12 　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1004-1389(2007)04-0142-06
Construction of the Bulblet Direct Differentiation Acceptor System of
Lilium Pollyanna by Agrobacterium-mediated
ZHAO Huan-rui , LIU Ya-li* and WANG Yue-jin
(College of Ho rticulture , Northw est A &F University , Yangling Shaanxi　712100 , China)
Abstract:With the Asiatic hybrids , Li l ium Po llyanna as the research material , a direct differentiation
accepto r sy stem w as developed by adventit ious buds induction , plant reproduction and antibiot ics sen-
sitive experiments. The results show ed that the optimum cul ture medium fo r the scales and the scale
leaves of the test-tube plant le ts to dif ferentiate adventit ious buds w ere M S+BA2. 0 mg /L+NAA0. 2
mg /L;The sui table culture medium for the petioles of the test-tube plant lets to different iate advent i-
tious buds w as MS+BA1. 0 mg /L +NAA0. 3 mg /L;The culture medium fo r bulblet fo rmation of the
test-tube plant lets w as 1 /2M S +IBA0. 5 mg /L +90 g Sucrose+light culture af ter dark culture one
month;The appropriate medium fo r ro oting w as 1 /2M S+IBA0. 5 mg /L +0. 1%AC;The concentra-
tion o f kannamycin w as 150 mg /L fo r the scales , and 100 mg /L for the scale leaves.
Key words:Li lium Po llyanna;Agrobacterium-mediated;Genetic t ransfo rmation;Direct dif ferentia-
tion accepto r sy stem
　　百合(Lil ium spp. )是百合科百合属的多年
生草本球根花卉[ 1] 。百合花朵硕大 ,花色各异 ,姿
态优雅 ,芳香浓郁 ,具有很高的观赏价值 。亚洲系
杂种百合(Asiatic hybrid lily)具有花朵直立朝
上 、花色丰富 、花枝坚挺 、生长期短等优点 ,是世界
最主要的切花品种之一。但是与所有的鲜切花一
样 ,百合的衰老严重影响了其观赏价值和瓶插寿
命。因此 ,培育出抗衰老的百合新品种具有广阔
的市场前景和良好的经济效益 。
杂交育种一直是百合育种的主要手段。目
前 ,推出的百合新品种大部分是通过远缘杂交育
成的 。百合杂交育种常因杂交障碍而受到限
* 收稿日期:2007-02-24　　修回日期:2007-03-13
基金项目:国家自然基金资助项目(30371013)。
作者简介:赵欢蕊(1982 -),女 ,陕西杨凌人 ,硕士 ,主要从事园林植物应用和育种研究。 E-m ail:zhaohuanrui@126. com
*通讯作者:刘雅莉。 E-mail:lyl6151@126. com
制[ 2] 。近年来 ,随着现代生物技术的发展 ,百合的
组织培养和遗传转化研究取得了一些进展。植物
遗传转化是基于基因水平上改造植物的遗传物
质 ,该研究起始于 20世纪 70年代末期 ,该技术的
建立和发展 ,使特定的基因能够根据人们的意愿 ,
在不同种属之间进行转化 ,打破了传统常规育种
的界限 ,为植物改良提供了一条新的重要途径[ 3] 。
良好的受体系统是百合基因转化的一个关键技术
环节 ,直接决定了转化方法的简易 、转化再生频率
的高低。由于东方百合是切花市场上的主流产
品 ,因此目前对百合遗传转化受体系统的研究主
要集中在东方百合[ 4 ～ 7] 上 ,而对亚洲百合遗传转
化受体系统的研究尚未见报道 。本研究以亚洲百
合“普利安娜”为材料 ,建立了良好的遗传转化直
接分化受体系统 ,为基因转化获得抗衰老的百合
新品种奠定了基础。
1　材料与方法
1. 1　材料
以亚洲百合“普利安娜”种球为试材 。
1. 2　外植体灭菌处理
剥除百合鳞茎外层有机械损伤和病斑的鳞
片 ,选取健康洁白的中层和内层鳞片 ,用自来水冲
洗干净泥渍 ,然后用 1 g /L 的洗衣粉液浸泡 15
min ,再用自来水冲洗干净后 ,用 1 000倍多菌灵
液泡 15 min ,置自来水管下流水冲洗过夜 ,在超
净工作台上用无菌水冲洗 3次 , 70%酒精消毒 1
min ,无菌水冲洗 3次 ,更换消毒容器后用0. 1%
升汞液(含 3‰Tween-20 )处理 15 min ,中间更换
一次升汞液 ,最后用无菌水冲洗 6次 ,无菌滤纸吸
干后备用。
1. 3　鳞片离体再生
将表面消毒好的鳞片切成 0. 8 cm ×0. 8 cm
大小的鳞块 ,背面朝下接种在附加不同浓度的 6-
BA 和 NAA 的固体培养基上 , 30 g /L 蔗糖 , 7 g /
L 琼脂 ,pH5. 8 ,光照 12 h /d ,室温 25℃, 2个月后
统计不定芽诱导结果 。
1. 4　鳞片不同部位切块不定芽诱导
将消毒好的鳞片切除鳞片上端后 ,把鳞片切
割为中层中部 、中层下部 、内层中部 、内层下部 4
个部位 , 然后接种在附加不同浓度的 6-BA 和
NAA的固体培养基上 ,培养条件同上 ,2 个月后
统计不同部位的出苗率(不同部位出苗率=不同
部位的出苗数 /总出苗数)。
1. 5　小叶离体再生
选取试管苗上的小鳞片叶和小叶柄为材料 ,
接种在附加不同浓度的 6-BA 和 NAA 的固体培
养基上进行不定芽诱导 , 30 g /L 蔗糖 , 7 g /L 琼
脂 ,pH5. 8 ,光照 12 h /d ,室温 25℃,1个月后统计
不定芽诱导结果 。
1. 6　试管苗鳞茎诱导
将未形成小鳞茎的试管苗剪掉叶片后接种在
附加不同激素的固体培养基上 ,90 g /L 蔗糖 ,7 g /
L 琼脂 , pH5. 8 ,室温 25℃,完全暗培养约 1个月
后再光照培养 , 2个月后观察试管苗鳞茎诱导结
果。
1. 7　卡那霉素(Km)抗性筛选
1. 7. 1　试管苗鳞片叶卡那霉素抗性筛选　根据
鳞片叶离体诱导不定芽结果 ,选择最佳再生培养
基附加不同浓度的卡那霉素进行敏感性试验 。将
鳞片叶接种于附加不同浓度的卡那霉素(0 、25 、
50 、75 、100 、125 、150 mg /L)的培养基上 ,1个月后
统计结果 。
1. 7. 2　鳞片卡那霉素抗性筛选　根据鳞片离体
再生结果 ,选择最佳再生培养基附加不同浓度的
卡那霉素进行敏感性试验 。将表面消毒好的鳞片
直接接种在附加不同浓度的卡那霉素(0 、25 、50 、
75 、100 、125 、150 mg /L)培养基上 ,1 个月后统计
结果 。
1. 8　生根培养
用扩繁后的无根苗进行生根诱导 ,30 g /L 蔗
糖 ,7 g /L 琼脂 ,0. 1%活性炭 ,pH5. 8 ,光照 12 h /
d ,室温 25℃,1个月后观察记录生根情况。
2　结果与分析
2. 1　影响鳞片不定芽分化的因素
2. 1. 1　不同激素组合对鳞片不定芽诱导的影响
　将百合鳞片接种在不定芽诱导培养基上 , 3 d
后部分鳞片颜色由白开始转变成绿色 , 7 d 后大
部分鳞片膨大转绿 ,10 d后部分鳞片靠近切口处
的凹面出现淡黄绿色的芽点 ,15 d后大部分鳞片
都已分化出芽点 , 1个月后由芽点分化成不定芽
芽丛 。由表 1可见 ,在不同的激素组合下鳞片不
定芽分化差异较明显 ,当 6-BA 浓度在 2. 0 mg /
L 、NAA在 0. 2 mg /L 时最有利于鳞片分化不定
芽(图 1)。在该试验基础上 ,在含 6-BA2. 0 mg /L
+NAA0. 2 mg /L 的培养基上附加不同浓度的卡
那霉素进行鳞片抗生素敏感性试验 。
143 4 期　　　　　　　　　　赵欢蕊等:农杆菌介导的普利安娜百合鳞茎直接分化受体系统的建立
图 1　鳞片分化不定芽
Fig. 1　Adventitious buds of scales
图 2　鳞片叶分化不定芽
Fig. 2　Adventitious buds of scale leaves
图 3　小叶柄分化不定芽
Fig. 3　Adventitious buds of petioles
图 4　鳞茎诱导
Fig. 4　Bulblet formation
2. 1. 2　鳞片不同部位对不定芽分化的影响　从
表 2可以看出 ,鳞片的不同部位对不定芽的分化
有明显的影响。不同部位的出苗率为内层下部>
内层中部>中层下部>中层中部。内层鳞片平均
出苗率为 67. 13%, 而中层鳞片平均出苗率仅
35. 62%,其中又以内层鳞片的下部出苗率最高 ,
平均出苗率占总出苗数的49. 23%,这是因为内层
下部的组织与鳞茎盘相连而且较嫩所以较易诱导
分化 。
2. 2　小叶不定芽的分化
将小叶由鳞片离体再生得到的无菌苗上切
下 ,分成鳞片叶和小叶柄(鳞片叶上方 1 cm 左右
长度)接种到附加不同浓度 6-BA 和 NAA 的固体
培养基上 ,一个月后统计不定芽分化情况 ,结果见
表 3。不同激素组合对百合小叶不定芽分化的影
响较为明显 ,6-BA 1. 0 mg /L +NAA0. 3 mg /L 的
组合最有利于小叶柄分化不定芽(图 2),而鳞片
叶在 6-BA2. 0 mg /L +NAA0. 2 mg /L 的激素组
合下不定芽分化率最高 ,达到 92%(图 3)。结果
还表明 ,小叶不同部位再生能力存在明显差异 ,鳞
片叶的不定芽分化率显著高于小叶柄 ,而且鳞片
叶分化不定芽也较快 , 20 d 左右即可直接分化出
小芽 ,一个月后即可长成小苗 ,小叶柄则先要经过
愈伤组织分化阶段 ,然后再分化不定芽 ,而且小叶
柄在诱导过程中有叶化的现象 ,因此在以小叶作
为百合转基因的材料时 ,应选取鳞片叶作为转化
受体 。以此试验为基础 ,进行鳞片叶卡那霉素敏
感性试验 。
表 1　不同激素组合对百合鳞片不定芽分化的影响
Table 1　The effect of different hormone combinations on the
differentiation of adventitious buds from the scales of lily
激素组合
H ormone com bination s
6-BA
/(m g /L) NAA/(mg /L)
接 种数
No. of
inoculated
scales
分化数
No. of
dif ferentiated
scales
分化率
/%
Dif ferent iation
rate
1. 0 0. 1 37 6 16. 21
1. 0 0. 2 44 12 27. 27
1. 0 0. 3 42 14 33. 33
1. 0 0. 4 40 16 40. 00
1. 5 0. 1 34 17 50. 00
1. 5 0. 2 28 15 53. 57
1. 5 0. 3 37 14 37. 84
1. 5 0. 4 25 12 48. 00
2. 0 0. 1 43 17 39. 53
2. 0 0. 2 44 25 56. 81
2. 0 0. 3 44 9 20. 45
2. 0 0. 4 45 9 20. 00
2. 3　试管苗鳞茎诱导
试验发现 ,百合鳞片叶不定芽分化率较高 ,但
是百合试管苗鳞茎形式较难而且需要较长时间 ,
因此要以鳞片叶作为转基因受体 ,就需要进行试
管苗鳞茎的诱导 。许多因素影响百合试管鳞茎诱
导及试管鳞茎质量 ,包括品种 、外植体材料部位及
处理方式 、激素种类及用量 、培养基无机盐成分 、
蔗糖浓度等[ 8] 。根据前人研究结果 ,本试验设计
了以下几个处理 ,处理Ⅰ :1 /2M S +IBA0. 5 mg /
L+90 g 蔗糖+暗培养 1个月后光照培养;处理
144 西　北　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　16 卷
Ⅱ:2MS+NAA0. 2 mg /L+90 g 蔗糖+暗培养
1个月后光照培养;处理 Ⅲ:MS + IAA0. 5 mg /L
+90 g 蔗糖+暗培养1个月后光照培养 。结果表
明:处理Ⅰ鳞茎膨大明显(图 4),暗培养 1 个月后
可产生明显膨大的白色鳞茎 ,再转至光下培养 ,1
周后白色鳞茎逐渐转绿 , 10 d 后完全变绿 ,在光
下鳞茎也有明显膨大 ,可能是由于在光下植物可
以进行光合作用储存养分供鳞茎形成及膨大 ,因
此暗培养后的光照培养对于百合试管苗鳞茎诱导
也是必须的。
表 2　鳞片不同部位对不定芽分化的影响
Table 2　The effect of dif ferent parts of the scales on the differentiation of adventitious buds
中层鳞片 Middle-level scales
中层下部
Middle-level
u nderside part s
分化数
No. of
dif feren tiated
scales
分化率 /%
Differen-
t iati on
rate
中层中部
Middle-level
middle part s
分化数
No. of
di ff erent iated
scales
分化率 /%
Dif feren-
ti at ion
rate
总分化率
Total
rate
/%
内层鳞片 Inner-l evel scales
内层下部
Inner-level
u nderside parts
分化数
No. of
dif feren tiated
scales
分化率 /%
Dif feren-
t iation
rate
内层中部
In ner-level
middle part s
分化数
No. of
dif f erent iated
scales
分化率 /%
Dif feren-
tiat ion
rate
总分化率
T otal
rate
/%
总分化数
Total
No. of
diff eren-
tiated
s cales
3 50 0 0 50 2 33. 3 1 16. 7 50 6
0 0 2 50 50 4 33. 3 6 50 83. 3 12
1 7. 1 3 21. 4 28. 5 5 35. 7 5 35. 7 71. 4 14
3 18. 8 1 6. 3 25. 1 11 68. 6 1 6. 3 74. 9 16
4 23. 5 4 23. 5 47 8 47. 1 1 5. 9 53 17
5 33. 3 0 0 33. 3 8 53. 3 2 13. 3 66. 6 15
2 14. 3 0 0 14. 3 7 50 5 35. 7 85. 7 14
1 8. 3 0 0 8. 3 11 91. 7 0 0 91. 7 12
2 11. 8 5 29. 4 41. 2 9 52. 9 1 5. 9 58. 8 17
9 36 4 16 52 9 36 3 12 48 25
7 77. 8 0 0 77. 8 1 11. 1 1 11. 1 22. 2 9
0 0 0 0 0 7 77. 8 2 22. 2 100 9
表 3　不同激素组合对小叶柄和鳞片叶不定芽分化的影响
Table 3　The effect of different hormone combinations on the differentiation of adventitious
buds from the petioles and the scale leaves of the test-tube plantlets
激素组合 H ormone combination s
6-BA
/( mg /L) NAA/( mg /L)
小叶柄 Petioles
接种数
No. of inoculated
petioles
分化数 No. of
dif ferentiat iaed
pet ioles
分化率 /%
Dif ferentiat ion
rate
鳞片 叶 Scale leaves
接种数
No. of inoculated
petioles
分化数 No. of
dif f erentiat iaed
pet ioles
分化率 /%
Dif ferentiat ion
rate
1. 0 0. 1 35 13 37 30 25 83
1. 0 0. 2 30 4 13 31 28 90
1. 0 0. 3 30 12 40 29 21 72
2. 0 0. 1 30 4 13 34 26 76
2. 0 0. 2 30 6 20 25 23 92
2. 0 0. 3 30 5 17 30 21 70
3. 0 0. 1 30 3 10 31 24 77
3. 0 0. 2 25 6 24 26 18 65
3. 0 0. 3 30 9 30 26 21 81
图 5　 0 mg /L卡那霉素
Fig. 5　0 mg/L kanamycin
图 6　25 mg /L卡那霉素
Fig. 6　25 mg /L kanamycin
145 4 期　　　　　　　　　　赵欢蕊等:农杆菌介导的普利安娜百合鳞茎直接分化受体系统的建立
图 7　50 mg /L卡那霉素
Fig. 7　50 mg /L kanamycin
图 8　75 mg /L卡那霉素
Fig. 8　75 mg /L kanamycin
图 9　100 mg /L卡那霉素
Fig. 9　100 mg /L kanamycin
图 10　125 mg/L卡那霉素
Fig. 10　125 mg/L kanamycin
2. 4　卡那霉素抗性筛选
将百合外植体接种在不同卡那霉素的选择培
养基上 ,一个月后的结果见表 4。鳞片叶随着卡
那霉素浓度的升高 ,分化率逐渐显著降低 。当卡
那霉素浓度达到 100 mg /L 时 ,鳞片叶的分化率
仅为 3. 3%。鳞片随着卡那霉素浓度的升高出芽
率明显降低 ,每块鳞片上分化出的不定芽个数明
显减少 ,不定芽白化率显著升高(图 6 ～ 11),当卡
那霉素浓度升高到 150 mg /L 时 ,鳞片已经不能
分化出健康的不定芽。因此 ,以鳞片叶作为转基
因受体时 ,卡那霉素以 100 mg /L 为宜;鳞片作为
转基因受体时 ,卡那霉素以 150 mg /L 为宜。
2. 5　生根培养
不定根形成的关键是其原基的形成 ,是一个
受激素调控的复杂过程 ,生长素起关键的调节作
用[ 9] ,因此本试验主要对生长素进行了研究。将
扩繁后的无根苗转接到附加不同生长素种类和浓
度的生根培养基上 ,共设计了 4 组处理 ,处理 Ⅰ:
1 /2M S+NAA0. 5 mg /L+0. 1%AC ;处理 Ⅱ:1 /
2MS +IBA0. 2 mg /L +0. 1%AC;处理 Ⅲ:1 /
2MS +IBA0. 5 mg /L +0. 1%AC;处理 Ⅳ:1 /
2MS+IBA1. 0 mg /L +0. 1%AC , 1 个月后观察
生根情况 。结果表明 ,处理 Ⅲ生根率高 ,根系长 ,
侧根多 ,根白 、壮 ,苗也较壮(图 12)。
图 11　150 mg/L卡那霉素
Fig. 11　150 mg/L kanamycin
图 12　生根培养
Fig. 12　Rooting culture
表 4　百合鳞片叶 、鳞片对卡那霉素的抗性
Table 4　The resistance of the scale leaves and scales of lily to Kanamycin
卡那霉素浓度
/(m g /L)
Concent ration
of Kanam ycin
鳞片叶 Scale leaves
接种数 No. of
inocu lated
scale leaves
分化率 /%
Different iation
rate
未分化率 /%
Non-dif ferent
iation rate
鳞片 S cales
接种数 No. of
inocu lated
scale leaves
分化率%
Differen tiation
rate
未分化率 /%
Non-dif ferent
iation rate
白化率 /%
Rate of w hi te
pieces
0 30 33. 3 66. 7 48 93. 75 6. 25 0
25 30 63. 25 36. 75 40 70 27. 50 2. 5
50 30 76. 7 23. 3 44 63. 64 29. 54 6. 82
75 30 83. 3 16. 7 36 58. 33 33. 3 8. 33
100 30 96. 7 3. 3 36 33. 3 41. 67 25. 03
125 30 100 0 44 8. 57 51. 43 40
150 30 100 0 22 0 55. 46 44. 54
146 西　北　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　16 卷
3　讨论
目前 ,利用植物组织培养技术进行百合转基
因操作的途径主要有 3条:①愈伤组织诱导及再
分化途径;②胚状体发生途径;③器官发生途径。
这 3条途径在百合组织培养过程中都存在。第 1
条途径在愈伤组织分化过程中容易产生变异 ,第
2条途径的胚状体难以诱导获得 ,第 3 条途径可
以避免再生过程中变异的发生 ,并且百合不定芽
的诱导较容易 ,因此采用器官发生途径进行百合
转化是一条较好的途径。在百合鳞片离体分化系
统中 ,将亚洲百合的鳞片按中层下部 、中层中部 、
内层下部 、内层中部接种到相同的培养基上 , 2个
月后观察结果发现 ,内层下部最容易分化 ,说明与
鳞茎盘相连的基部组织分化能力最强 ,是最适的
外植体部位 。目前 ,采用室外生长的鳞茎的鳞片
进行表面消毒 ,然后与农杆菌共培养转化百合已
经取得了成功[ 10 , 11] ,该方法虽然污染率较高 ,但
通过选择合适的消毒处理方法和合适的预培养时
间 ,可以明显减少污染造成的影响 ,这样可以缩短
转化的周期 。
百合易于离体培养 ,再生能力强 ,以鳞片和小
叶作为外植体 ,直接分化率都较高 ,而且有稳定的
外植体来源 ,可以作为百合基因转化的受体系统 ,
其中以小鳞片叶较好 ,由于分化率高 、无污染 、取
材方便 ,并且可以避免再生过程中变异的发生 ,因
此小鳞片叶是百合基因转化理想的受体材料 。
百合卡那霉素敏感性试验表明 ,不同基因型
品种 、相同的取材部位其卡那霉素的抗性不同;相
同基因型品种 、不同部位的取材其卡那霉素的抗
性也不同 。本试验发现 ,鳞片作为转基因受体时
卡那霉素浓度以 150 mg /L 为宜 ,而鳞片叶的卡
那霉素浓度要低于鳞片 ,以 100 mg /L 为宜。因
此 ,在选择不同的材料作为转基因受体时 ,应分别
进行合适的卡那霉素浓度的筛选。
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147 4 期　　　　　　　　　　赵欢蕊等:农杆菌介导的普利安娜百合鳞茎直接分化受体系统的建立