全 文 ：32 卷 06 期
Vol． 32，No． 06
草 业 科 学
PＲATACULTUＲAL SCIENCE
895 － 901
06 /2015
DOI:10． 11829 \ j． issn． 1001-0629． 2014-0556
徐博，任伟，王英哲，孙启忠，郭玮，娄玉杰． 农杆菌介导的朝鲜碱茅 PuP5CS 基因转化紫花苜蓿的研究［J］． 草业科学，2015，
32(6) :895-901．
XU Bo，ＲEN Wei，WANG Ying-zhe，SUN Qi-zhong，GUO Wei，LOU Yu-jie． Transformation of Puccinellia chinampoensis PuP5CS gene
into alfalfa with Agrobacterium-mediated method［J］． Pratacultural Science，2015，32(6) :
櫧櫧櫧櫧
櫧
櫧櫧櫧櫧
櫧
毥
毥毥
毥
895-901．
植物
生产层
农杆菌介导的朝鲜碱茅 PuP5CS基因
转化紫花苜蓿的研究
徐 博1，任 伟2，王英哲3，孙启忠3，郭 玮4，娄玉杰1
(1．吉林农业大学动物科学技术学院，吉林 长春 130118;2．吉林省农业科学院，吉林 公主岭 136100;
3．中国农业科学院草原研究所，内蒙古 呼和浩特 010010;4．吉林省畜牧总站，吉林 长春 130062)
摘要:为提高紫花苜蓿(Medicago sativa)的抗逆性，利用在朝鲜碱茅(Puccinellia chinampoensis)已克隆的 PuP5CS
基因成功构建了 pCAMBIA3300-PuP5CS表达载体，以子叶为外植体，通过农杆菌介导共培养法转化紫花苜蓿“公
农 5 号”(M． sativa cv． Gongnong No． 5) ，并以 2． 0 mg·L －1的草铵膦进行筛选，抗性愈伤组织诱导率为 22． 4%，经
草铵膦筛选的植株进行 PCＲ 检测和 ＲT-PCＲ 检测。结果显示，共获得 11 株转化植株，表明 PuP5CS 基因已转入
T0 紫花苜蓿植株，且能够在 ＲNA水平上正常表达。
关键词:PuP5CS;紫花苜蓿;遗传转化;农杆菌介导法
中图分类号:S816;Q943． 2 文献标识码:A 文章编号:1001-0629(2015)06-0895-06*
Transformation of Puccinellia chinampoensis PuP5CS gene into
alfalfa with Agrobacterium-mediated method
XU Bo1，ＲEN Wei2，WANG Ying-zhe3，SUN Qi-zhong3，GUO Wei4，LOU Yu-jie1
(1． College of animal science and technology，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China;
2． Jilin Academy of Agricultural Sciences，Gongzhuling 136100，China;
3． Grassland Ｒesearch Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Huhhot 010010，China;
4． Jilin province animal husbandry，Changchun 130062，China)
Abstract:In order to cultivate resistance alfalfa (Medicago sativa) ，the plant expression vector pCAMBIA3300-
PuP5CS was constructed and transformed into alfalfa from cotyledon via agrobacterium mediated． The transformed
plants were selected with 2． 0 mg·L －1 glufosinate ammonium and the ratio of transformation callus differentiation
was 22． 4% ． Eleven transformed plants were identified as positive in the gene expression by PCＲ and ＲT-PCＲ
which suggested that the PuP5CS gene had been integrated into the genome of the regenerated plants．
Key words:PuP5CS gene;alfalfa;genetic transformation;Agrobacterium-mediated
Corresponding author:LOU Yu-jie E-mail:lyjjlau@ 163． com
* 收稿日期:2014-12-08 接受日期:2015-03-03
基金项目:吉林省科技厅青年科研基金(20140520177JH) ;吉教科合字［2015］第 197 号
第一作者:徐博(1983-) ，男，吉林公主岭人，讲师，博士，研究方向为牧草种质资源开发与利用、牧草育种。E-mail:xubo0308@ 126． com
通信作者:娄玉杰(1956-) ，女，吉林省吉林市人，教授，博导，博士，研究方向为牧草饲料资源开发与利用。E-mail:lyjjlau@ 163． com
PＲATACULTUＲAL SCIENCE(Vol． 32，No． 06) 06 /2015
目前，土壤的盐渍化已经成为制约牧草生产的
环境因子之一，在一定程度上限制了优良牧草品种
在我国北方牧草主产区的应用［1］。作为世界上最
重要的牧草之一，紫花苜蓿(Medicago sativa)享有
“牧草之王”的美誉，具有分布广泛、营养丰富等优
点，目前我国也选育出了多个耐盐型紫花苜蓿品
种［2-3］。作为我国东北地区的当家苜蓿品种之一，
“公农 5 号”具产量高、抗旱性好等优势，是我国东
北地区近年来大量推广种植的苜蓿品种之一。而利
用生物技术手段获得转基因育种材料也是育种家在
除传统育种方式以外，在新品种选育方面经常利用
的一项技术［4］。
△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)是植物脯氨
酸合成的关键酶和限速酶，在受到外界胁迫条件下，
P5CS基因能够增加细胞质中脯氨酸的合成，从而提
高植物的抗逆性，但其合成也受到脯氨酸的反馈抑
制［5-7］。近年来，许多学者克隆了 P5CS 的同源基因
并进行了其表达分析研究［8-10］。在 NaCl 处理条件
下，P5CS 基因在叶片里的相对表达量都高于对
照［11-12］。李志亮等［10］将 P5CS 基因导入高羊茅
(Festuca elata)后，转基因植株的脯氨酸含量比正常
植株提高了31% ～ 83%，其抗旱性也高于对照。转
P5CS基因的蒙农冰草(Agropyron cristatum)在盐胁
迫的条件下，其游离脯氨酸的含量增加较快，耐盐性
明显增加［13］。
目前对于紫花苜蓿遗传转化的研究较多，方法
上倾向于利用农杆菌介导法进行遗传转化［14］。而
为了达到最佳的转化效率，针对不同的受体基因型、
不同的植物受体的研究显得尤为重要。本研究的目
的基因 PuP5CS 基因是从朝鲜碱茅(Puccinellia chi-
nampoensis)中克隆得到的，通过构建含目的基因及
带 bar 筛选基因的植物表达载体，以农杆菌介导的
方法，将 PuP5CS基因整合到紫花苜蓿的基因组中，
以期得到转基因植株，为未来检验 PuP5CS 基因能
提高苜蓿抗逆性、进而得到具有更强抗逆性的转基
因材料，以及紫花苜蓿的抗逆育种研究提供一定的
基础。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
1． 1． 1 植物材料 紫花苜蓿所用材料为公农 5 号
(M． sativa cv． Gongnong No． 5) ，由吉林省农业科学
院草地研究所提供。
1． 1． 2 菌株和质粒 质粒选用含 bar 基因的
pCAMBIA3300，由吉林省农科院转基因中心提供。
大肠杆菌 DH5α 和农杆菌 LBA4404 均由吉林农业
大学动物科学技术学院实验室保存。
1． 1． 3 试剂 产品由 Takara 公司提供，限制性内
切酶、ＲNaseA、Taq 酶、dNTP、T4 连接酶等由 Takara
公司提供;反转录酶、琼脂糖凝胶回收试剂盒由 O-
MEGA公司提供，DNA的提取选用 OMEGA的 E． Z．
N． A．  Plant DNA Kit，头孢霉素(Cef)、利福平
(Ｒif)、链霉素(Str)卡那霉素(Km)、草铵膦(glufosi-
nate-ammonium)购自 Sigma 公司提供，其他试剂为
国产分析纯。
1． 2 方法
1． 2． 1 引物的设计 根据朝鲜碱茅 PuP5CS 基因
的 DNA序列，利用 DNAMAN软件进行引物设计，引
物均由上海生工生物技术有限责任公司合成。
1． 2． 2 植物表达载体 pCAMBIA3300-PuP5CS 的构
建 根据 PuP5CS 基因的序列和选取的酶切位点设
计引物，由于选用的酶切位点为 Xba I 和Sac I，引物
序列为:PF(5-TCTAGAATGGCCACCGCGGACC-3);
PＲ (5-GAGCTCTCATTG CAAAGGAAGGTTCTTATG-
3)。采用 Xba I 和 Sac I 双酶切 pMD18-T-PuP5CS
和 pCAMBIA3300 载体，分别回收载体片段，将
PuP5CS基因和 pCAMBIA3300 载体片段用 T4 DNA
连接酶进行连接，并转化 DH5α 大肠杆菌感受态细
胞，在 LB培养基(含 Kan抗性)平板上进行筛选，挑
取阳性单菌落进行菌液 PCＲ，经酶切和 PCＲ 鉴定，
构建植物表达载体。
1． 2． 3 表达载体 pCAMBIA3300-PuP5CS 农杆菌转
化子的获得 利用冻融法制备农杆菌感受态，并将
表达 载 体 pCAMBIA3300-PuP5CS 转 化 农 杆 菌
LBA4404 在培养基［YEP +25 mg·L －1 Ｒif + 100 mg
·L －1 Kan］上进行筛选，利用 PCＲ 法进行菌落鉴
定。
1． 2． 4 紫花苜蓿的遗传转化和草铵膦抗性筛选
将紫花苜蓿种子先用 70%酒精处理 2 min，20%次氯
酸钠灭菌 30 min，无菌水冲洗 5 次后 4 ℃保存一夜，
再用 20%次氯酸钠灭菌 30 min，无菌水冲洗 5次后接
种到 MS培养基上培养无菌苗。以培养 7 d无菌苗的
698
06 /2015 草 业 科 学 (第 32 卷 06 期)
子叶为外植体，在活化后的农杆菌(含 PuP5CS)菌液
中侵染 30 min，在愈伤诱导共培养基［UM + 2
mg·L －1 2，4-D(2，4-dichlorophenoxyacetic acid)+
0． 25 mg·L －1 KT(kinetin) ］上共培养 3 d，移入含草
铵膦浓度为 0、1、2、3 mg·L －1四个梯度愈伤诱导筛选
培养基［UM +2 mg·L －1 2，4-D +0． 25 mg·L －1 KT +
350 mg·L －1 Cef(cefotaxime) ］上，每个培养基中摆放
20 个外植体，共设置5个重复。在培养7 d和20 d时
观察愈伤组织生长状态以确定草铵膦的最佳筛选浓
度。愈伤诱导 20 d后移入含草铵膦的分化筛选培养
基［UM +1． 2 mg·L －1 KT + 350 mg·L －1 Cef］中，分
化培养 40 d后移入减半后的含草铵膦生根筛选培养
基［1 /2 MS +350 mg·L －1 Cef］中培养至得到紫花苜
蓿抗性转化植株。
1． 2． 5 抗性转化的分子检测 紫花苜蓿叶片的
DNA提取按照 OMEGA 的 Plant DNA Mini Kit 说明
书进行，ＲNA提取采用 Trizol法，反转录为 cDNA后
备用。以未经转化的植株作为阴性对照进行 PCＲ
检测，体系为 25 μL，反应条件同上。根据 bar 基因
的序 列 设 计 引 物 BF (5-GGTCTAGAATGAGC-
CCAGAACGACGCC-3)和 BＲ (5-CTCGGATCCT-
CAGATCTCG GTGAC-3)进行 bar 基因的 PCＲ 检
测。ＲT-PCＲ检测根据 PuP5CS 序列用设计好的引
物 (PF5-TCTAGAATGGCCACCGCGGACC-3) 和
(PＲ5-GAGCTCTCATTGCAAAGGAAGGTTCTTATG-
3)进行检测。
2 结果与分析
2． 1 植物表达载体 pCAMBIA3300-PuP5CS的鉴定
所构建的 pCAMBIA3300-PuP5CS 载体的图谱
见图 1，选择了 Xba I位点和 Sac I位点，根据这两个
酶切位点的特点，进行双酶切鉴定，得到两个片段，
其中 2 100 bp左右的片段为 PuP5CS，依照电泳的结
果(图 2) ，验证了所构建的 pCAMBIA3300-PuP5CS
载体是正确的，能够用于后续的紫花苜蓿的遗传转
化。
2． 2 农杆菌的转化
通过利用冻融法将构建好的植物表达载体
pCAMBIA3300-PuP5CS转化农杆菌 LBA4404，28 ℃
培养 48 h 后挑取 5 个单菌落，摇菌后进行 PCＲ 鉴
定，结果表明，5 个单菌落都能够扩增出 PuP5CS 的
特异性片段，约 2 100 bp(图 3) ，说明表达载体
pCAMBIA3300-PuP5CS 已 经 成 功 转 化 农 杆 菌
LBA4404。
图 1 植物表达载体 pCAMBIA3300-PuP5CS的酶切位点和图谱
Fig． 1 Sketch map and restriction sites of pCAMBIA3300-PuP5CS
798
PＲATACULTUＲAL SCIENCE(Vol． 32，No． 06) 06 /2015
图 2 pCAMBIA3300-PuP5CS重组载体的酶切鉴定
Fig． 2 Identification of pCAMBIA3300-PuP5CS
with Xba I and Sac I
注:Maker 为 DNA Marker DL15000 plus;1 为质粒 pCAMBIA3300-
PuP5CS;2 为 Xba I和 Sac I双酶切质粒。
Note:M，DNA Marker DL15000 plus;1，pCAMBIA3300-PuP5CS;2，
Double-enzyme cleavage with Xba I and Sac I．
图 3 pCAMBIA3300-PuP5CS农杆菌转化子的 PCＲ鉴定
Fig． 3 PCＲ identification of pCAMBIA3300-PuP5CS
agrobacterium independent
2． 3 草铵膦选择压的确定
不同草铵膦浓度对愈伤诱导的影响见表 1。随
着培养时间从 7 d 增加到 20 d，愈伤组织受草铵膦
的影响逐渐显现，因此培养 20 d 的愈伤组织诱导率
低于培养 7 d的愈伤组织诱导率。在草铵膦浓度达
到 1． 0 mg·L －1时，对于愈伤组织的诱导有一定的
影响，在培养 20 d后，部分愈伤褐化并最终死亡，最
终诱导率为 65%。而在草铵膦浓度达到 2． 0
mg·L －1时，培养 7 d时愈伤组织褐化现象就较为明
显，且愈伤诱导率显著下降(31%) ，而在培养 20 d
后，只有 10 个外植体诱导出愈伤而没有褐化。而当
草铵膦的浓度增加到 3． 0 mg·L －1时，培养 7 d所有
愈伤组织均出现褐化现象，所有的外植体都没能够
表 1 不同草铵膦浓度对愈伤诱导的影响
Table 1 Effect of different concentration of
glufosinate on the callus induction
草铵膦浓度
Concentration of
glufosinate ammonium /
mg·L －1
愈伤组织诱导率
Callus induction rate /%
培养 7 d
After 7 days
培养 20 d
After 20 days
0 97a 96a
1． 0 75b 65b
2． 0 31c 10c
3． 0 0d 0c
注:同列不同小写字母表示不同浓度间差异显著(P ＜ 0． 05)。
Note:Different lower case letters within the same column indicate signifi-
cant difference among different concentration of glufosinate ammonium at
0． 05 level．
诱导出愈伤组织就已经死亡。因此选择 2． 0
mg·L －1草铵膦作为筛选压。
2． 4 农杆菌转化后抗性愈伤的分化及幼苗的获得
子叶在经农杆菌侵染 30 min 后，经过 3 d 的共
培养(图 4A) ，转移至愈伤诱导筛选培养基［UM +
2． 0 mg·L －1 2，4-D(2，4-dichlorophenoxyacetic acid)
+0． 25 mg·L －1 KT(kinetin)+ 2． 0 mg·L －1草铵膦
+ 350 mg·L －1 Cef(cefotaxime) ］上培养 20 d，后移
入分化筛选培养基［UM +1． 2 mg·L －1KT + 2． 0 g·
L －1草铵膦 + 350 mg·L －1 Cef］培养 40 d，非抗性愈
伤逐渐褐化并且没有愈伤组织产生，而抗性愈伤组
织表面分生出绿色点状组织(图 4B) ，参试的 250 个
外植体共获得 56 个抗性愈伤组织，抗性愈伤组织获
得率为 22． 4%，抗性愈伤组织逐渐分化成苗(图
4C) ，成苗后再转入生根筛选培养基［1 /2 MS + 1． 0
mg·L －1草铵膦 + 350 mg·L －1 Cef ］后生根(图
4D) ，待根系足够发达后移栽至小盆中，共获得 13
株抗性苗。
2． 5 抗性转化植株的 PCＲ鉴定
将获得的草铵膦抗性植株移栽至花盆中后，共
获得的 13 株存活植株，在其中选取 8 株，提取
DNA，以质粒 pCAMBIA3300-PuP5CS 为阳性对照，
以非转基因植株作为阴性对照，进行 PCＲ扩增。结
果显示，部分抗性转化植株能够扩增出 2 100 bp 左
右的特异性条带，在阴性对照泳道上则没有该特异
性条带，通过引物 BF和 BＲ 进行 bar 基因的检测结
果(图 6) ，可以认为目的基因 PuP5CS 已经整合到
公农 5 号紫花苜蓿的基因组中(图 5)。
898
06 /2015 草 业 科 学 (第 32 卷 06 期)
图 4 公农 2 号紫花苜蓿的遗传转化
Fig． 4 Genetic transformation system of Madicago sativa cv． Gongnong No． 5
注:A，共培养;B，胚性愈伤;C，分化;D，诱导生根。
Note:A，coculture;B，callus induction;C，regeneration;D，rooting．
图 5 转 PuP5CS苜蓿的 PCＲ检测
Fig． 5 The PCＲ analysis of transgenic plant
注:Maker为 DL15000;CK +为质粒 DNA;CK －为野生型阴性对照;1，2，3，4，5，6，7，8 分别为检测 DNA样品。
Note:M，DNA Marker DL15000;CK +，plasmid DNA;CK －，wild type plant;1，2，3，4，5，6，7，8，DNA samples．
998
PＲATACULTUＲAL SCIENCE(Vol． 32，No． 06) 06 /2015
图 6 转 PuP5CS苜蓿的 bar基因 PCＲ检测
Fig． 6 The PCＲ analysis of transgenic plant
注:Maker为 DL2000;CK +为质粒 DNA，CK －为野生型阴性对照，1，
2，3，4，5，6，7，8 分别为检测 DNA样品。
Note:M，DNA Marker DL2000;CK +，plasmid DNA;CK －，wild type
plant;1，2，3，4，5，6，7，8，DNA samples．
2． 6 抗性转化植株
为了在 mＲNA水平上检测转 PuP5CS抗性转化
植株的表达情况，选取 PCＲ 鉴定为阳性的再生植
株，进行 ＲNA 的提取，反转录 cDNA 第一链。以引
物 BF，BＲ进行 ＲT-PCＲ扩增，选择 PCＲ鉴定阳性的
植株进行检测，在 2 100 bp左右检测到了条带，且与
目的片段的大小一致，该基因可以在抗性转化紫花
苜蓿植株中转录为 mＲNA，在 ＲNA水平能够被检测
到(图 7) ，最终共获得 11 株抗性植株。
图 7 转 PuP5CS苜蓿的 ＲT-PCＲ检测
Fig． 7 The ＲT-PCＲ testing of PuP5CS transgenic plant
注:Maker为 DL15000;CK + 为质粒 DNA，CK － 为 PCＲ 检测阴性植
株，1，4，5 分别为 PCＲ鉴定阳性植株。
Note:M，DNA Marker DL15000;CK +，plasmid DNA;CK，non-trans-
genic plant;2，4，5，cDNA of transgenic plants．
3 讨论和结论
3． 1 pCAMBIA3300-PuP5CS表达载体的构建
是否能够构建一个含目的基因的高效植物表达
载体，是成功进行植物遗传转化的重要前提之一。
本研究成功构建了由 CaMV35s 强启动子调控的脯
氨酸合成酶 PuP5CS 的植物表达载体 pCAM-
BIA3300-PuP5CS，并转入 LBA4404 农杆菌中，能够
为进一步进行紫花苜蓿农杆菌遗传转化打下基础。
目前在植物表达载体的构建中，多使用 CaMV35s 强
启动子［15-16］，使外源基因能够在植物的各个部位都
能表达，但相对特异性较差，外源基因可能会在植物
体内表达出无功能的蛋白质，从而影响正常生理代
谢。在下一步的工作中，希望能够构建用于
PuP5CS的特异性启动子来替换 CaMV35s启动子的
植物表达载体，以更有利于获得抗逆性强的紫花苜
蓿的遗传转化。
3． 2 侵染材料的选择
对于农杆菌侵染的受体，一般选择由外植体诱
导产生的愈伤组织，愈伤组织的细胞分裂旺盛，对于
外源 DNA 的转入效果好［17-18］。但在紫花苜蓿的遗
传转化中，由于紫花苜蓿外植体诱导出的愈伤组织
质地松软，在农杆菌侵染过程中极易碎裂成小块，在
后续试验中带来很多困扰的因素，因此大部分学者
虽然选择了不同外植体作为侵染材料，而较少使用
愈伤组织［19-20］，验证了以外植体为农杆菌侵染的受
体也是可行的。而本研究中通过之前研究中得出的
结果，选用子叶作为侵染材料，并最终获得了抗性转
化植株，因此在以“公农 5 号”为材料的遗传转化体
系中，使用子叶作为外植体是可行的。
3． 3 草铵膦对转化效率的影响
由于选用了 pCAMBIA3300 载体进行双元表
达载体的构建，其筛选基因为 bar 基因。相对于其
他载体的筛选基因，其筛选效果较好，在本研究中
紫花苜蓿对于草铵膦的敏感程度也很高。在进行
的草铵膦选择压的确定时，选择了愈伤诱导阶段
能够诱导出愈伤的数量作为判断紫花苜蓿选择压
的标准。而在进行农杆菌转化苜蓿的试验中，选
择了分化期才加入草铵膦进行筛选，这主要是为
了能够得到更多的分化植株，也是为了避免草铵
膦对愈伤诱导和生长状态的影响。而在生根期，
由于考虑到生根对于筛选压的承受能力较差，过
009
06 /2015 草 业 科 学 (第 32 卷 06 期)
于敏感，适当降低了选择压，使用了 1． 0 mg·L － 1
的草铵膦在这一步骤进行筛选。草铵膦在分化初
期就能够筛选掉大量的愈伤组织，尽管在试验的
过程中，大量侵染后的外植体在诱导分化为植株
的过程中被筛选掉，最终得到的植株数量也非常
少，但经筛选得到的阳性植株基本都能确定为转
基因植株，大大节省了组培过程中的培养基配制
等工作，以及植株移栽后的 DNA 提取、PCＲ 检测
等工作所用的时间。在未来大量进行苜蓿遗传转
化的过程中，是一种非常有效的筛选基因。
为提高紫花苜蓿的抗逆性，本研究利用已克隆
的朝鲜碱茅 PuP5CS 成功构建了 pCAMBIA3300-
PuP5CS表达载体，利用农杆菌介导法对紫花苜蓿
进行了遗传转化，得到了经草铵膦筛选的抗性植株，
目的基因和 bar基因的 PCＲ检测和 ＲT-PCＲ检测结
果表明 PuP5CS 已经成功转入紫花苜蓿的基因组当
中，且能够正常表达，共获得 11 个转基因植株，为紫
花苜蓿耐盐新品种的选育奠定了基础。
致谢:该论文是第二届全国草业生物技术大会
评选出的优秀论文，并得到中国草业生物技术专业
委员会提供的版面费支持。
参考文献
［1］ 李志亮，杨清，叶嘉，邢浩春，黄丛林，吴忠义．利用 P5CS基因转化白三叶的研究［J］．生物技术通报，2012(5) :61-65．
［2］ 范霞，那顺．紫花苜蓿栽培技术及应用［J］．内蒙古农业科技，2001(5) :47．
［3］ 齐广，王云，陈申宽，刘玉良． 农牧交错地带紫花苜蓿生产问题及对策［J］． 内蒙古民族大学学报(自然科学版) ，2008，
23(6) :657-660．
［4］ 张振霞，符义坤，储成才．豆科牧草基因工程研究进展［J］．遗传，2002，28(5) :607-612．
［5］ 杨成民，王宏芝，孙振元，魏建华．利用基因枪共转化法获得转 bar与 P5CS基因黑麦草［J］．草地学报，2005，13(1) :34-38．
［6］ Chen J B，Wang S M，Jing Ｒ L，Mao X G． Cloning the PvP5CS gene from common bean(Phaseolus vulgaris)and its expression
patterns under abiotic stresses［J］． Journal of Plant Physiology，2009，166(1) :12-19．
［7］ Aida H S，Ｒadhia G B，Amira B． Over expression of Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase increases proline productionand con-
fers salt tolerance in transgenic potatoplants［J］． Plant Science，2005，169(4) :74-752．
［8］ 冯远航，王罡，季静，关春峰，金超．枸杞 LmP5CS基因的克隆及表达分析［J］．中国生物工程杂志，2013，33(1) :33-40．
［9］ 张乐新，苏蔓，马甜，马兴勇，闫学青，彭献军，陈双燕，程丽琴，刘公社．羊草 Δ1-吡咯琳-5-羧酸合成酶(LcP5CS1)基因的
克隆与分析［J］．草业学报，2013，22(4) :197-204．
［10］ 李志亮，黄丛林，张秀海，曹鸣庆，李征，王刚，吴忠义．利用基因枪法向高羊茅导入 P5CS 基因的研究［J］．园艺学报，
2005，32(4) :653-657．
［11］ 张兆元，陈吉宝，宋佳璘，曹苑楠，冉小芹，党虹．野生大豆 P5CS 基因的克隆及对盐胁迫反应［J］．植物遗传资源学报，
2014，15(4) :844-849．
［12］ 徐博，任伟，徐安凯，王志锋，孙启忠．朝鲜碱茅 Δ-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)基因的克隆及表达分析［J］．华北农学
报，2011，26(6) :20-26．
［13］ 王桂花，米福贵，刘娟，董淑君，霍秀文，杨宏雁． P5CS基因在蒙农杂种冰草植株中的表达及耐盐性研究［J］．华北农学
报，2007，22(4) :33-36．
［14］ 张桦，张富春，曾光，张博，陈全家．新牧一号苜蓿 MvP5CS基因的克隆和功能分析［J］．草业科学，2012，29(1) :51-58．
［15］ 王肖红，曾爱松，高兵，宋立晓，严继勇． StP5CS基因转化结球甘蓝的研究［J］．西北植物学报，2013，33(5) :885-891．
［16］ 徐博，任伟，徐安凯，王志锋，孙启忠．转 PuP5CS烟草对低温胁迫的生理响应［J］．华北农学报，2012，27(3) :186-190．
［17］ 黄诚梅，江文，杨丽涛，李杨瑞，杨翠芳． 转入反义 ScP5CS 基因烟草植株对 PEG 和 NaCl 处理的反应［J］． 作物杂志，
2013(3) :42-45．
［18］ 李鸿雁，李大红．转拟南芥 P5CS1 基因增强羽衣甘蓝的耐旱性［J］．植物生理学报，2014，50(7) :1009-1013．
［19］ 徐春波，王勇，赵海霞，米福贵．冷诱导转录因子 AtCBF1 转化紫花苜蓿的研究［J］．草业学报，2012，21(4) :168-174．
［20］ 李晶，任卫波，郭慧琴，王茅雁，刘雅学． 农杆菌介导的 smt1 富硒基因转化紫花苜蓿研究［J］． 草业科学，2012，29(8) :
1224-1228．
(责任编辑 王芳)
109