全 文 ：分子植物育种，2015年，第 13卷，第 2期，第 379-385页
Molecular Plant Breeding, 2015, Vol.13, No.2, 379-385
研究报告
Research Report
利用 ISSR分子标记分析 29个风信子品种的遗传多样性
胡凤荣 * 胡月苗 王斐 任翠
南京林业大学风景园林学院,南京, 210037
*通讯作者, hufengrong2003@sina.com
摘 要 现代栽培的所有园艺风信子都是由原种风信子(Hyacinth orientalis)培育驯化而来，其遗传基础相对较
窄，但经过几个世纪栽培选育，已经发生很大变化。为研究风信子品种之间的遗传关系，本研究利用 12条引物
对 29个风信子品种进行 ISSR分子标记研究，扩增获得 109条谱带，多态性条带有 103条，占条带总数的
94.5%，表明风信子具有较高的遗传多样性。29个风信子品种的遗传距离范围为 0.018 5~0.820 1，平均遗传距离
为 0.449 8。其中‘Atlantic’与‘GipsyQueen’遗传距离最大为 0.820 1，亲缘关系最远；‘Blue star’与‘Delf Blue’遗
传距离最小，两品种之间相似度较大，亲缘关系最近。使用软件 NTSYS-pc (2.10e版)获得 UPGMA聚类树形图，
以相似系数 0.635为阈值，29个风信子品种可聚为两大类。聚类分析发现相同色系的品种几乎聚为一类，说明
同色系风信子品种亲缘关系较近。因此，在杂交育种时可选择不同花色的品种作亲本，进行新品种的选育。
关键词 风信子, ISSR,遗传多样性,亲缘关系
Genetic Diversity of 29 Hyacinth Germplasm Resources Revealed by Using
ISSRMarkers
Hu Fengrong * Hu Yuemiao Wang Fei Ren Cui
Nanjing Forestry University, Nanjing, 210037
* Corresponding author, hufengrong2003@sina.com
DOI: 10.13271/j.mpb.013.000379
Abstract All modern horticultural hyacinths are domesticated by the protospecies-Hyacinth orientalis. Though
the protospecies have relatively narrow genetic basis, they have had great changes due to cultivation and breeding
for centuries. In order to study the genetic relationship between varieties of hyacinth, 12 primers of ISSR molecular
markers were used to analyze 29 species of Hyacinth which generated 109 bands, including 103 polymorphism
bands account for 94.5% of the total. Each pair of primers can amplify nine bands in average. The genetic
distances among 29 Hyacinths orientalis were from 0.018 5 to 0.820 1 with the average of 0.449 8. There is the
longest genetic distance of 0.820 1 between‘Atlantic’and‘Gipsy Queen’. Whereas between‘Blue star’and‘Delf
Blue’being the shortest genetic distance. NTSYS-PC (Version 2.10e) was applied to UPGMA clustering analysis to
construct the phylogenetic tree. By fixing the value of 0.635 as the threshold of similarity coefficient, 29 species of
hyacinths can be divided into two broad categories. The results showed that the varieties with the same color almost
were divided into the same category, which indicated that the Hyacinth group has certain relevance with its color.
Keywords Hyacinth orientalis, ISSR, Genetic diversity, Genetic relationship
收稿日期：2014-06-17 接受日期：2014-09-09 网络出版日期：2014-10-22
URL: http://www.biopublisher.cn/index.php/mpbopa/article/view/2353
基金项目：本研究由江苏省高校优势学科建设工程资助项目(PAPD)资助
风信子(Hyacinth orientalis)，又名五色水仙、洋水
仙，为百合科(Liliaceae)风信子属(Hyacinth)多年生草
本植物(费砚良和张金政, 1999;沈强等, 2004,中国林
业出版社, pp.63-64)。风信子是一种优秀的园艺植物，
既可以用作盆栽，也可以用作切花，气味芬芳，花姿优
美。风信子原产地中海东部沿岸及小亚细亚一带，自
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
1562年从土耳其引入东欧，育种专家就不断地对其进
行改良，1596年英国已将风信子用于庭院栽培，目前
在世界各地广泛栽培，种植已有几个世纪(Hu et al.,
2011)。风信子是春季重要的观赏花卉，花序端庄，花色
丰富，且香味独特，适宜盆栽或水养，也可作切花，布置
花坛、草坪、林缘草地别有风情，具有较高的美学价值。
ISSR (inter-simple sequence repeat)，即简单重复
间隔序列标记方法，是 1994年由加拿大蒙特利尔大
学的 Zietkiewicz等(1994)提出的分子标记方法，根据
谱带的有无及相对位置来分析不同样品间 ISSR标记
的多态性(王建波, 2002;王际振等, 2008;雒新艳和戴
思兰, 2009)。相比于其它分子标记技术，ISSR标记具
有操作简单、快速、高效、可重复等优点(柴胜丰等,
2014)。因此该技术一经问世就在植物遗传分析方面
得到了广泛应用，目前已逐步拓展到观赏植物领域。
本研究在获得适宜的 DNA提取方法和建立了
ISSR-PCR优化扩增体系并筛选了适宜引物的基础
上(胡凤荣等, 2011; 2013)，对 29个风信子品种的基
因组 DNA进行 PCR扩增，旨在研究 29个风信子品
种资源的遗传多样性和亲缘关系，为风信子品种资
源种质创新选择亲本奠定基础。
1结果与分析
1.1风信子种质资源多态性分析
多态性位点百分比是衡量物种群体内遗传变异
水平高低的重要指标之一，一个种群多态性位点百
分比较高，说明种群遗传多样性较丰富，适应环境的
能力较强；反之，如果一个种群多态性位点百分比较
低，它适应环境的能力较弱，在长期进化中被淘汰的
可能性就大。
使用多态性高、背景清晰、重复性好的 12条引
物对 29个风信子品种进行 ISSR-PCR扩增(表 1)。扩
增获得 109条谱带，每条引物平均扩增出 9条谱带，
得到 103条多态性条带，占条带总数的 94.5%，多态
引物编号
Primer No.
3A01
3A39
3A56
3A62
UBC814
UBC815
UBC824
UBC807
UBC811
UBC834
UBC845
UBC873
总数
Total
平均
Average
引物序列
(5-3)
Primer
sequence
(5-3)
(GA)8TC
(AG)7CTT
(TG)7ACG
(TG)7ACT
(CT)8A
(CT)8G
(TC)8G
(AG)8T
(GA)8C
(AG)8YT
(CT)8RG
(GACA)4
12
扩增条
带数
No. of total
fragments
9
11
5
11
8
9
8
13
10
7
11
7
109
9
多态性条
带数
No. of po-
lymorphic
fragments
8
11
5
11
8
9
8
13
10
7
11
6
103
8.9
多态性条带
率(%)
Percentage of
polymorphic
fragments (%)
89
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
86
94.5
表 1风信子 ISSR扩增
Table 1 The amplification of ISSR markers in Hyacinth orientalis
性较为丰富。每条引物扩增出 5~13条谱带，其中引
物 UBC807扩增的条带数最多为 13条，引物 3A56扩
增条带数最少为 5 条，在 12 条引物扩增中只有
UBC873的多态百分比低于 90%，其余均高于 90%。
在对 29个风信子种质资源的扩增中，3A62、UBC807
两条引物分别获得品种‘Pink surprise’与‘City of
Hearlem’的特异性条带(图 1;图 2)。
1.2风信子种质资源的聚类分析
根据 ISSR电泳扩增结果，利用 POPGEN32软
件计算处理 29个风信子种质资源的遗传距离与相
似系数矩阵(表 2)。结果显示，29个风信子品种的遗
传距离范围为 0.018 5~0.820 1，平均遗传距离为
图 1引物 3A62对不同风信子 ISSR扩增图谱
Figure 1 ISSR banding patterns of Hyacinth orientalis amplified by primer 3A62
380
L1
1
0.
59
6
3
0.
52
2
9
0.
59
6
3
0.
52
3
9
0.
46
7
9
0.
56
8
8
0.
56
8
8
0.
58
7
2
0.
56
8
8
0.
45
8
7
0.
48
6
2
0.
55
9
6
0.
56
8
8
0.
55
9
6
0.
56
8
8
0.
63
3
0
0.
64
2
2
**
*
0.
01
8
5
0.
06
6
4
0.
14
8
1
0.
24
8
7
0.
32
1
9
0.
32
1
9
0.
30
9
3
0.
33
4
6
0.
24
8
7
0.
33
4
6
0.
32
1
9
L1
2
0.
59
6
3
0.
52
2
9
0.
59
6
3
0.
60
5
5
0.
46
7
9
0.
58
7
2
0.
58
7
2
0.
60
5
5
0.
58
7
2
0.
45
8
7
0.
50
4
6
0.
57
8
0
0.
56
8
8
0.
55
9
6
0.
56
8
8
0.
63
3
0
0.
62
3
9
0.
98
1
7
**
*
0.
06
6
4
0.
14
8
1
0.
22
5
4
0.
29
6
9
0.
32
1
9
0.
28
4
6
0.
30
9
3
0.
27
2
5
0.
30
9
3
0.
32
1
9
L1
3
0.
58
7
2
0.
44
7
1
0.
56
8
8
0.
57
8
0
0.
44
0
4
0.
55
9
6
0.
55
9
6
0.
59
6
3
0.
54
1
3
0.
43
1
2
0.
47
7
1
0.
58
7
2
0.
54
1
3
0.
53
2
1
0.
54
1
3
0.
60
5
5
0.
63
3
0
0.
93
5
8
0.
93
5
8
**
*
0.
09
6
2
0.
16
9
6
0.
26
0
5
0.
28
4
6
0.
24
8
7
0.
27
2
5
0.
21
4
0
0.
29
6
9
0.
30
9
3
L1
4
0.
58
7
2
0.
44
7
1
0.
60
5
5
0.
57
8
0
0.
49
5
4
0.
55
9
6
0.
57
8
0
0.
63
3
0
0.
55
9
6
0.
50
4
6
0.
51
3
8
0.
62
3
9
0.
61
4
7
0.
60
5
5
0.
61
4
7
0.
67
8
9
0.
66
9
7
0.
86
4
2
0.
86
2
4
0.
90
8
3
**
*
0.
19
1
5
0.
23
7
0
0.
23
7
0
0.
24
8
7
0.
27
2
5
0.
21
4
0
0.
29
6
9
0.
30
9
3
L1
5
0.
59
6
3
0.
48
6
2
0.
57
8
0
0.
56
8
8
0.
46
7
9
0.
55
0
5
0.
53
2
1
0.
58
7
2
0.
56
8
8
0.
47
7
1
0.
50
4
6
0.
57
8
0
0.
58
7
2
0.
57
8
0
0.
55
0
5
0.
63
3
0
0.
67
8
9
0.
77
9
8
0.
79
8
2
0.
84
4
0
0.
82
5
7
**
*
0.
15
8
7
0.
18
0
5
0.
23
7
0
0.
23
7
0
0.
22
5
4
0.
26
0
5
0.
32
1
9
L2
3
0.
55
9
6
0.
48
6
2
0.
55
9
6
0.
55
0
5
0.
52
2
9
0.
53
2
1
0.
56
8
8
0.
58
7
2
0.
55
0
5
0.
47
7
1
0.
52
2
9
0.
57
8
0
0.
55
0
5
0.
57
8
0
0.
55
0
5
0.
68
8
1
0.
64
2
2
0.
72
4
8
0.
74
3
1
0.
77
0
6
0.
78
9
0
0.
85
3
2
**
*
0.
22
5
4
0.
23
7
0
0.
26
0
5
0.
22
5
4
0.
21
4
0
0.
34
7
5
B9 B1
0
B1
9
B2
2
C4 F5 F7 F8 F2
1
F2
4
F2
5
F2
8
H
1
H
2
H
3
H
26
H
29
L1
1
L1
2
L1
3
L1
4
L1
5
L2
3
L2
7
Z1
6
Z1
7
Z1
8
Z2
0
Z3
0
B9 **
*
0.
15
8
7
0.
18
0
5
0.
30
9
3
0.
42
8
7
0.
38
7
3
0.
41
4
7
0.
47
1
8
0.
44
2
9
0.
53
2
5
0.
54
8
2
0.
42
8
7
0.
50
1
7
0.
58
0
5
0.
44
2
9
0.
42
8
7
0.
59
7
0
0.
51
7
0
0.
51
7
0
0.
53
2
5
0.
53
2
5
0.
51
7
0
0.
58
0
5
0.
51
7
0
0.
59
7
0
0.
63
0
9
0.
58
0
5
0.
63
0
9
0.
51
7
0
B1
0
0.
85
3
2
**
*
0.
20
2
7
0.
26
0
5
0.
34
7
5
0.
33
4
6
0.
33
4
6
0.
47
1
8
0.
38
7
3
0.
44
2
9
0.
45
7
2
0.
42
8
7
0.
63
0
9
0.
61
3
8
0.
44
2
9
0.
51
7
0
0.
70
2
4
0.
64
8
3
0.
64
8
3
0.
74
0
1
0.
74
0
1
0.
72
1
1
0.
72
1
1
0.
68
4
0
0.
74
0
1
0.
70
2
4
0.
79
9
5
0.
70
2
4
0.
54
8
2
B1
9
0.
83
4
9
0.
81
6
5
**
*
0.
28
4
6
0.
34
7
5
0.
36
0
6
0.
38
7
3
0.
41
4
7
0.
41
4
7
0.
47
1
8
0.
48
6
7
0.
48
6
7
0.
50
1
7
0.
51
7
0
0.
33
4
6
0.
37
3
9
0.
59
7
0
0.
51
7
0
0.
51
7
0
0.
56
4
2
0.
50
1
7
0.
54
8
2
0.
58
0
5
0.
54
8
2
0.
59
7
0
0.
56
4
2
0.
64
8
3
0.
53
2
5
0.
48
6
7
B2
2
0.
73
3
9
0.
77
0
6
0.
75
2
3
**
*
0.
38
7
3
0.
18
0
5
0.
32
1
9
0.
34
7
5
0.
27
2
5
0.
40
0
9
0.
38
7
3
0.
41
4
7
0.
45
7
2
0.
53
2
5
0.
40
0
9
0.
38
3
7
0.
54
8
2
0.
47
1
8
0.
50
1
7
0.
54
8
2
0.
54
8
2
0.
56
4
2
0.
59
7
0
0.
53
2
5
0.
58
0
5
0.
54
8
2
0.
59
7
0
0.
58
0
5
0.
54
8
2
C4 0.
65
1
4
0.
70
6
4
0.
70
6
4
0.
67
8
9
**
*
0.
36
0
6
0.
33
4
6
0.
38
7
3
0.
44
2
9
0.
41
4
7
0.
45
7
2
0.
51
7
0
0.
53
2
5
0.
51
7
0
0.
50
1
7
0.
34
7
5
0.
53
2
5
0.
75
9
5
0.
75
9
5
0.
82
0
1
0.
70
2
4
0.
75
9
5
0.
64
8
3
0.
68
4
0
0.
70
2
4
0.
70
2
4
0.
68
4
0
0.
70
2
4
0.
64
8
3
F5 0.
67
8
9
0.
71
5
6
0.
69
7
2
0.
83
4
9
0.
69
7
2
**
*
0.
15
8
7
0.
22
5
4
0.
15
8
7
0.
29
6
9
0.
30
9
3
0.
33
4
6
0.
40
0
9
0.
44
2
9
0.
37
3
9
0.
41
4
7
0.
58
0
5
0.
56
4
2
0.
53
2
5
0.
58
0
5
0.
58
0
5
0.
59
7
0
0.
93
0
9
0.
50
1
7
0.
54
8
2
0.
51
7
0
0.
63
0
9
0.
58
0
5
0.
50
1
7
F7 0.
66
0
6
0.
71
5
6
0.
67
8
9
0.
72
4
8
0.
71
5
6
0.
85
3
2
**
*
0.
11
6
6
0.
20
2
7
0.
32
1
9
0.
26
0
5
0.
38
7
3
0.
40
0
9
0.
36
0
3
0.
34
7
5
0.
41
4
7
0.
61
3
8
0.
56
4
2
0.
53
2
5
0.
58
0
5
0.
54
8
2
0.
63
0
9
0.
56
4
2
0.
53
2
5
0.
54
8
2
0.
61
3
8
0.
63
0
9
0.
58
0
5
0.
53
2
5
F8 0.
62
3
9
0.
62
3
9
0.
66
0
6
0.
70
6
4
0.
67
8
9
0.
79
8
2
0.
88
9
9
**
*
0.
18
0
5
0.
32
1
9
0.
28
4
6
0.
36
0
6
0.
37
3
9
0.
36
0
3
0.
37
3
9
0.
36
0
6
0.
51
7
0
0.
53
2
5
0.
50
1
7
0.
51
7
0
0.
45
7
2
0.
53
2
5
0.
53
2
5
0.
47
1
8
0.
42
8
7
0.
45
7
2
0.
53
2
5
0.
48
6
7
0.
47
1
8
F2
1
0.
64
2
2
0.
67
8
9
0.
66
0
6
0.
76
1
5
0.
64
2
2
0.
85
3
2
0.
81
5
6
0.
83
4
9
**
*
0.
24
8
7
0.
21
4
0
0.
33
4
6
0.
40
0
9
0.
38
7
3
0.
37
3
9
0.
36
0
6
0.
48
6
7
0.
56
4
2
0.
53
2
5
0.
61
3
8
0.
58
0
5
0.
56
4
2
0.
53
2
5
0.
61
3
8
0.
58
0
5
0.
56
4
2
0.
59
7
0
0.
50
1
7
0.
42
8
7
F2
4
0.
58
7
2
0.
64
2
2
0.
62
3
9
0.
66
9
7
0.
66
0
6
0.
74
3
1
0.
72
4
8
0.
72
4
8
0.
77
9
8
**
*
0.
23
7
0
0.
30
9
3
0.
32
1
9
0.
30
9
3
0.
42
8
7
0.
41
4
7
0.
48
6
7
0.
77
9
3
0.
77
9
3
0.
84
1
2
0.
68
4
0
0.
74
0
1
0.
74
0
1
0.
63
0
9
0.
54
8
2
0.
51
7
0
0.
63
0
9
0.
64
8
3
0.
56
4
2
F2
5
0.
57
8
0
0.
63
3
0
0.
61
4
7
0.
67
8
9
0.
63
3
0
0.
73
3
9
0.
77
0
6
0.
75
2
3
0.
80
7
3
0.
78
9
0
**
*
0.
27
2
5
0.
28
4
6
0.
27
2
5
0.
36
0
6
0.
40
0
9
0.
50
1
7
0.
72
1
1
0.
68
4
0
0.
74
0
1
0.
66
6
0
0.
68
4
0
0.
64
8
3
0.
51
7
0
0.
53
2
5
0.
47
1
8
0.
61
3
8
0.
53
2
5
0.
51
7
0
F2
8
0.
65
1
4
0.
65
1
4
0.
61
4
7
0.
66
0
6
0.
59
6
3
0.
71
5
6
0.
67
8
9
0.
69
7
2
0.
71
5
6
0.
73
3
9
0.
76
1
5
**
*
0.
30
9
3
0.
37
3
9
0.
38
7
3
0.
40
0
9
0.
50
1
7
0.
58
0
5
0.
54
8
2
0.
53
2
5
0.
47
1
8
0.
54
8
2
0.
54
8
2
0.
48
6
7
0.
44
2
9
0.
41
4
7
0.
48
6
7
0.
50
1
7
0.
48
6
7
H
1
0.
60
5
5
1.
53
2
1
0.
60
5
5
0.
63
3
0
0.
58
7
2
0.
66
9
7
0.
66
9
7
0.
68
8
1
0.
66
9
7
0.
72
4
8
0.
75
2
3
0.
73
3
9
**
*
0.
08
6
2
0.
28
6
9
0.
36
0
6
0.
48
6
7
0.
56
4
2
0.
56
4
2
0.
61
3
8
0.
48
6
7
0.
53
2
5
0.
59
7
0
0.
50
1
7
0.
48
6
7
0.
51
7
0
0.
50
1
7
0.
61
3
8
0.
56
4
2
H
2
0.
55
9
6
0.
54
1
3
0.
59
6
3
0.
58
7
2
0.
59
6
3
0.
64
2
2
0.
69
7
2
0.
69
7
2
0.
67
8
9
0.
73
3
9
0.
76
1
5
0.
68
8
1
0.
91
7
4
**
*
0.
23
7
0
0.
37
3
9
0.
47
1
8
0.
58
0
5
0.
58
0
5
0.
63
0
9
0.
50
1
7
0.
54
8
2
0.
54
8
2
0.
48
6
7
0.
50
1
7
0.
50
1
7
0.
48
6
7
0.
56
4
2
0.
51
7
0
H
3
0.
64
2
2
0.
64
2
2
0.
71
5
6
0.
66
9
7
0.
60
5
5
0.
68
8
1
0.
70
6
4
0.
68
8
1
0.
68
8
1
0.
65
1
4
0.
69
7
2
0.
67
8
9
0.
74
3
1
0.
78
9
0
**
*
0.
36
0
6
0.
54
8
2
0.
56
4
2
0.
56
4
2
0.
61
3
8
0.
48
6
7
0.
59
7
0
0.
59
7
0
0.
50
1
7
0.
54
8
2
0.
48
6
7
0.
66
6
0
0.
51
7
0
0.
50
1
7
H
26
0.
65
1
4
0.
59
6
3
0.
68
8
1
0.
67
8
9
0.
70
6
4
0.
66
0
6
0.
66
0
6
0.
69
7
2
0.
69
7
2
0.
66
0
6
0.
66
9
7
0.
66
9
7
0.
69
7
2
0.
68
8
1
0.
69
7
2
**
*
0.
21
4
0
0.
45
7
2
0.
45
7
2
0.
50
1
7
0.
38
7
3
0.
45
7
2
0.
37
3
9
0.
40
0
9
0.
41
4
7
0.
41
4
7
0.
37
3
9
0.
41
4
7
0.
45
7
2
H
29
0.
55
0
5
0.
49
5
4
0.
55
0
5
0.
57
8
0
0.
58
7
2
0.
55
9
6
0.
54
1
3
0.
59
6
3
0.
61
4
7
0.
61
47
0.
60
55
0.
60
55
0.
61
47
0.
62
39
0.
57
80
0.
80
73
**
*
0.
44
2
9
0.
47
1
8
0.
45
7
2
0.
40
0
9
0.
38
7
3
0.
44
2
9
0.
33
4
6
0.
40
0
9
0.
34
7
5
0.
30
9
3
0.
42
8
7
0.
47
1
8
L2
7
0.
59
6
3
0.
50
4
6
0.
57
8
0
0.
58
7
2
0.
50
4
6
0.
60
5
5
0.
58
7
2
0.
62
3
9
0.
60
5
5
0.
53
2
1
0.
59
6
3
0.
61
4
7
0.
60
5
5
0.
61
4
7
0.
60
5
5
0.
66
9
7
0.
71
5
6
0.
72
4
8
0.
72
4
8
0.
75
2
3
0.
78
9
0
0.
83
4
9
0.
79
8
2
**
*
0.
19
1
5
0.
23
7
0
0.
20
2
7
0.
26
0
5
0.
24
8
7
Z1
6
0.
55
0
5
0.
47
7
1
0.
55
0
5
0.
55
9
6
0.
49
5
4
0.
57
8
0
0.
57
8
0
0.
65
1
4
0.
61
4
7
0.
57
8
0
0.
58
7
2
0.
64
2
2
0.
61
4
7
0.
60
5
5
0.
57
8
0
0.
66
0
6
0.
66
9
7
0.
73
3
9
0.
75
2
3
0.
77
9
8
0.
77
8
9
0.
78
9
0
0.
78
9
0
0.
82
5
7
**
*
0.
20
2
7
0.
14
8
1
0.
22
5
4
0.
19
1
5
Z1
7
0.
53
2
1
0.
49
5
4
0.
56
8
8
0.
57
8
0
0.
49
5
4
0.
59
6
3
0.
54
1
3
0.
63
3
0
0.
63
3
0
0.
59
6
3
0.
62
3
9
0.
66
0
6
0.
59
6
3
0.
60
5
5
0.
61
4
7
0.
66
0
6
0.
70
6
4
0.
71
5
6
0.
73
3
9
0.
76
1
5
0.
76
1
5
0.
78
9
0
0.
77
0
6
0.
78
9
0
0.
81
6
5
**
*
0.
23
7
0
0.
18
0
5
0.
19
1
5
Z1
8
0.
55
9
6
0.
44
9
5
0.
52
2
9
0.
55
0
5
0.
50
4
6
0.
53
2
1
0.
53
2
1
0.
58
7
2
0.
56
8
8
0.
53
2
1
0.
54
1
3
0.
61
4
7
0.
60
5
5
0.
61
4
7
0.
51
3
8
0.
68
8
1
0.
73
3
9
0.
77
9
8
0.
76
1
5
0.
80
3
7
0.
80
3
7
0.
79
8
2
0.
79
8
2
0.
81
6
5
0.
86
2
4
0.
78
9
0
**
*
0.
23
7
0
0.
24
8
7
Z2
0
0.
53
2
1
0.
49
5
4
0.
58
7
2
0.
55
9
6
0.
49
5
4
0.
55
9
6
0.
55
9
6
0.
61
4
7
0.
61
4
7
0.
52
2
9
0.
58
7
2
0.
60
5
5
0.
54
1
3
0.
56
8
8
0.
59
6
3
0.
66
0
6
0.
65
1
4
0.
71
5
6
0.
73
3
9
0.
74
3
1
0.
74
3
1
0.
77
0
6
0.
80
7
3
0.
77
0
6
0.
79
8
2
0.
83
4
9
0.
78
9
0
**
*
0.
19
1
5
Z3
0
0.
59
6
3
0.
57
8
0
0.
61
4
7
0.
62
3
9
0.
52
2
9
0.
60
5
5
0.
58
7
2
0.
62
3
9
0.
67
8
9
0.
56
8
8
0.
59
6
3
0.
61
4
7
0.
56
8
8
0.
59
6
3
0.
60
5
5
0.
63
3
0
0.
62
3
9
0.
72
4
8
0.
72
4
8
0.
73
3
9
0.
73
3
9
0.
72
4
8
0.
70
6
4
0.
77
9
8
0.
82
5
7
0.
82
5
7
0.
77
9
8
0.
82
5
7
**
*
表
2
29
个
风
信
子
种
质
资
源
的
遗
传
相
似
系
数
(右
上
方
)与
遗
传
距
离
(左
下
方
)
Ta
bl
e
2
G
en
et
ic
sim
ila
rit
y
(a
bo
vc
di
ag
on
al
)a
nd
ge
ne
tic
di
sta
nc
e
(b
el
ow
di
ag
on
al
)a
m
on
g
29
ge
no
ty
pe
so
fH
ya
ci
nt
h
O
rie
nt
al
is
ba
se
d
on
IS
SR
m
ak
er
s
利用 ISSR分子标记分析 29个风信子品种的遗传多样性
Genetic Diversity of 29 Hyacinth Germplasm Resources Revealed by Using ISSR Markers
381
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
图 2引物 UBC807对不同风信子 ISSR扩增图谱
Figure 2 ISSR banding patterns of Hyacinth orientalis amplified by primer UBC807
0.449 8，各基因型间相似系数分布在 0.440 4~0.981 7，
平均值为 0.645 9，并与遗传距离变化呈相反趋势。其
中‘Atlantic’与‘GipsyQueen’遗传距离最大为 0.820 1，
形态上‘Atlantic’花色为蓝色，‘Gipsy Queen’花色为
橙色，亲缘关系最远，可以考虑作为杂交育种的材
料；其次为‘Carnegie’与‘Wood stock’遗传距离为
0.799 5；‘Blue star’与‘Delf Blue’遗传距离最小，两
品种间相似度较大，亲缘关系最近，外部形态上两者
花色相同。
应用 Ntsys2.10软件依据 UPGMA法聚类分析，
获得 29个风信子品种亲缘关系树状图(图 3)。从图 3
可以看出，以相似系数为 0.635作切割线，可将 29个
风信子品种聚为 A和 B两大类。A类包括 4个品种，
又可分为两类，一类包括白色花系的‘White Pears’、
‘Carnegie’和‘Aiolos’三个品系，另一类为橙色花系
‘Gipsy Queen’；其余 25个品种则归为 B类。
B类群中在 GS值 0.648可以划分为 C、D两个亚
类。第一亚类包括 13个品种，在 GS值 0.720处，又可
分为 2个组群，第一个组群包括‘Antarctica’、‘Anna
Marie’、‘Anna Liza’、‘Fondant’、‘Lady Derby’、‘Pink
Pearl’、‘China Pink’、‘Pink surprise’8 个品种，除
‘Antarctica’花色为白色系和‘Anna Liza’为浅紫色系
外，其它均为粉色系，‘Pink surprise’与其它品种相似
系数最低。第二个组群包括‘Amsterdan’、‘Jan Bos’、
‘City of Hearlem’、‘Gipsy Princess’、‘Red Magic’5
个品种，这几个品种中‘Amsterdan’、‘Jan Bos’、‘Red
Magic’为红色系，‘City of Hearlem’、‘Gipsy Princess’
为黄色系，其中‘Amsterdan’与‘Jan Bos’遗传相似系
数最大，其亲缘关系较近。第二亚类在 GS值为 0.774
处可划分为 2个组群，第一组群包括‘Blue Star’、
‘Delf Blue’、‘Atlantic’和‘Blue Jacket’4个品种，这
一组的相似系数均在 0.882以上，说明这 4个品种亲
缘关系最近，遗传差异性最小，并且‘Blue Star’和
‘Delf Blue’的遗传相似系数高达 0.981 7，从花色上
看，这一组均为蓝色系，因此认为，’Blue Star’与‘Delf
Blue’的亲缘关系最近，其中一个可能是另一个的变
种。第二组群包括‘Ostara’、‘Blue Magic’、‘Minos’、
‘Purple sensation’、‘Sky Jacket’、‘Wood stock’、
‘Amethyst’、‘Splendid Cornedia’8 个品种，‘Purple
sensation’与‘Wood stock’花色为紫色系，与花色为蓝
色系的‘Ostara’、‘BlueMagic’、‘Minos’的 3个品种聚
在一起，而没有与同为紫色系的‘Amethyst’和‘Splen-
did Cornedia’聚在一起，蓝色系的‘Sky Jacket’没有与
蓝色系其它品种聚在一起而与紫色系的‘Amethyst’
和‘Splendid Cornedia’聚在一起。
从遗传聚类图中可以看出，同一色系的品种之
间的亲缘关系较近，基本可以聚为一类，其中白色系
品种与蓝色系品种遗传差异较大，亲缘关系较远；蓝
色系品种与紫色系品种遗传相似系数较大，说明这
两个色系的风信子品种亲缘关系较近。
2讨论
2.1风信子品种资源的遗传多样性
遗传多样性是物种适应和进化的基础，种内遗
传多样性的丰富程度与物种对环境变化的适应能力
呈正相关(马静等, 2010,陕西农业科学, (1): 126-130;
严华等, 2010)。ISSR技术具有多态性高，重复性好，
操作简单，成本低，引物具有通用性等特点，对于遗
传背景研究较少的风信子较为适宜。
ISSR-PCR扩增共获得 109条谱带，多态性条带
103条，多态性条带率 94.5%，平均每条引物扩增出
的条带数是 9条，多态性条带为 8.9条；29个风信子
品种的 Neis基因多样度(h*)分布在 0.066 6~0.499 4
范围内，平均 Neis基因多样度为 0.314 8，shannon
多样性指数(I*)在 0.150 0~0.692 6 之间，平均值为
0.507 7，相比于同是球根花卉的岷江百合(邓明文,
2008) (Neis基因多样度为 0.202 9, Shannon多样性指
数为 0.339 8)、长筒石蒜(邓传良, 2005) (Neis基因多样
度为 0.189 7, Shannon多样性指数为 0.294 5)遗传多样
382
图 3 29个风信子品种分子标记聚类树状图
Figure 3 The phylogenetic dendrogram of 29 varieties of Hyacinth orientalis based on genetic distances
性都要高，表明风信子有较高的遗传多样性。
2.2风信子品种资源的亲缘关系分析
从聚类图中可以看出，29个风信子品种首先可
以划分为两大类。第一类包括 3个花色为白色系的品
种和一个为橙色花系品种，第二类包括粉色系、黄色
系、蓝色系、紫色系 4种花色 25个品种。相同色系的
品种几乎聚为一类，说明风信子类群的划分与其花色
有一定的相关性。但紫色系品种‘Purple sensation’与
‘Wood stock’和‘Amethyst’与‘Splendid Cornedia’却
没有聚在一起而是分别与蓝色系品种聚在一起，白色
系‘Antarctica’与粉色系品种聚为一类。
聚类结果显示虽然风信子品种间有一定的遗传
差异，但由于风信子起源于同一个原种和三个变种，
导致品种间遗传相似系数较大，亲缘关系相对较近。
为提高物种的遗传多样性，一般采用三种方法：一是
通过物种进化过程中发生基因突变；二是利用生物
技术培育新品种；三是通过杂交育种。实践中多采用
第三种方法。杂交亲本的亲缘关系越远，获得杂种优
势的可能性越大(魏丽华等, 2010)。根据聚类结果，理
论上推测不同花色的两品种间杂交获得优势植株的
潜力较大。本研究的结果将为风信子优良品种的性
状选择、杂交育种中杂交组合的确定以及良种的繁
育，提供分子水平上理论依据。
3材料与方法
3.1材料
供试的 29个风信子品种购自北京碧溪花卉，均
为荷兰进口优质种球，编号详见表 3。
利用 ISSR分子标记分析 29个风信子品种的遗传多样性
Genetic Diversity of 29 Hyacinth Germplasm Resources Revealed by Using ISSR Markers
383
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
3.2仪器与试剂
PCR扩增仪(朗基MG96+)，DYY-Ⅲ型恒压恒流
电泳仪(北京六一仪器公司)，黑马凝胶成像系统(珠
海黑马医学仪器有限公司)。
琼脂糖、Taq DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+、10× Buf-
fer (Mg2+ Free)、ISSR引物、DNA Marker (DL100)均购
于上海赛百盛生物公司。
3.3方法
3.3.1基因组 DNA提取方法
采用简易 CTAB法提取风信子叶片基因组 DNA
(胡凤荣等, 2011)。
3.3.2风信子 ISSR-PCR分析
风信子 ISSR-PCR扩增程序采用 TD-PCR，扩增
体系为：20 μL的总反应体积，包括 10× Buffer 2 μL、
25 mmol/L Mg2+ 1.4 μL、2.5 mmol/L dNTPs 1.5 μL、
10 pmol/μL引物 1.5 μL，5 U/μL Taq聚合酶 0.2 μL，
30 ng/μL模板 1 μL，最后用双蒸水补足体积。扩增程
序为：94℃预变性 5 min；梯度降温扩增 Touch-down-
PCR，94℃变性 40 s，54℃退火 45 s，72℃延伸 90 s，3
个循环；94℃变性 40 s，52℃退火 45 s，72℃延伸 90 s，
10 个循环；94℃变性 40 s，51℃退火 45 s，72℃延伸
90 s，20个循环；94℃变性 40 s，50℃退火 45 s，72℃
延伸 90 s，20个循环，72℃延伸 8 min，4℃保存(胡凤
荣等, 2013)。
3.3.3 ISSR-PCR引物
选用 12 条引物进行 29 个风信子品种资源的
ISSR扩增，详见表 4 (胡凤荣等, 2013)。
3.3.4数据处理与分析
ISSR是显性标记，每条电泳带(DNA片段)代表
编号
No.
B9
B10
B19
B22
C4
F5
F7
F8
F21
F24
名称
Name
White pearl
Carnegie
Aiolos
Antarctica
Gipsy queen
Anna marie
Fondant
Lady derby
Anna liza
Pink pearl
编号
No.
F25
F28
H1
H2
H3
H26
H29
L11
L12
L13
名称
Name
China pink
Pink surprise
Amsterdan
Jan bos
City of hearlem
Gipsy princess
Red magic
Blue star
Delt blue
Atlantic
编号
No.
L14
L15
L23
L27
Z16
Z17
Z18
Z20
Z30
名称
Name
Blue jacket
Ostara
Blue magic
Minos
Purple sensation
Sky jacket
Wood stock
Amethyst
Splendid cornelia
表 3风信子供试材料的编号和名称
Table 3 The numbers and names of tested cultivars of Hyacinth
一个分子标记(Marker)，即一个引物结合位点。电泳
迁移率一致的相同引物扩增产物的条带具有同源
性，是同一位点的产物。所扩增片段的大小用Maker
DL100参照对比，将同一位置清晰出现的电泳条带
记为“1”，其余记为“0”，将获得数据输入 Excel 2003
以此建立原始表征数据矩阵。在表征矩阵中统计扩
增产物的总条带数和多态性条带的数量，并计算多
态性条带比例及单条引物多态性条带数。
利用计算机软件 POPGEN32计算品种间多态性
谱带的比例和总基因的多样性 shannon多样性指数
(I)，多态性位点百分率(ppL)，Neis基因多样度(h)，各
品种间的 Neis 遗传距离和遗传一致度，并用
NTSYS-pc (2.10e版)对原始表征数据进行分析，获得
标准数据后，用 SimQual (Similarity, Qualitalivedata)
方法计算相似系数矩阵，再使用 SHAN (Sequential,
Agglomerative, Hierarchical和 Nested Clustering)的功
能，依据 UPGMA (unweighted pairgroup method and
arithetic average)法聚类分析，聚类分析树状图使用
Tree Plot功能绘出。
作者贡献
任翠是本实验研究的主要完成人之一；胡月苗、王
斐和任翠完成了数据分析和论文初稿的写作；胡凤荣
既是项目的构思者及负责人，也是本实验研究的主要
完成人之一，指导实验设计、数据分析、论文写作、确定
修改及定稿。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由江苏省高校优势学科建设工程资助项
表 4风信子 ISSR引物
Table 4 ISSR primer for Hyacinth used in this research
引物编号
Primer No.
3A01
3A39
3A56
3A62
UBC814
UBC815
UBC824
UBC807
UBC811
UBC834
UBC845
UBC873
引物序列(5-3)
Primer sequence (5-3)
(GA)8TC
(AG)7CTT
(TG)7ACG
(TG)7ACT
(CT)8A
(CT)8G
(TC)8G
(AG)8T
(GA)8C
(AG)8YT
(CT)8RG
(GACA)4
384
目(PAPD)资助。
参考文献
Chai S.F., Zhuang X.Y., Zou R., Chen Z.Y., Jiang Y.S., and Wei X.,
2014, Genetic diversity analysis of endangered plant Camel－
lia pubipetala detected by ISSR, Xibei Zhiwu Xuebao (Acta
Botanica Boreali-Occidentalia Sinica), 34(1): 93-98 (柴胜丰,
庄雪影,邹蓉,陈宗游,蒋运生,韦霄, 2014,濒危植物毛瓣金
花茶遗传多样性的 ISSR分析,西北植物学报, 34(1): 93-98)
Deng C.L., 2005, Studies on the systematics of lycoris and genetic
diversity of Lycoris longituba, Dissertation for Ph.D., Nanjing
Forestry University CAAS, Supervisor: Zhou J., pp.53 (邓
传良, 2005, 石蒜属植物系统学及长筒石蒜遗传多样性
研究, 博士学位论文, 南京林业大学研究生院, 导师: 周
坚, pp.53)
Deng M.W., 2008, Genetic diversity among populations of Lilium
regale, Dissertation for Master, Nanjing Forestry University
CAAS, Supervisor: Shi J.S., pp.29 (邓明文, 2008,岷江百
合种质资源遗传多样性研究,硕士学位论文,南京林业大
学研究生院,导师:施季森, pp.29)
Fei Y.L., and Zhang J.Z., eds., 1999, Perennial plant, China Forestry
Press, Beijing, China, pp.178-179 (费砚良, 张金政, 编著,
1999,宿根花卉,中国林业出版社,中国,北京, pp.178-179)
Hu F.R., Ren C., Bao R.L., and Liu G.X., 2011, Chromosome anal-
ysis of five diploid garden Hyacinth species, Sci. Hortic., 131:
82-87)
Hu F.R., Ren C., Bao R.L., and Luo F.X., 2011, Comparison of
genomic DNA extraction methods from Hyacinth, Shenyang
Nongye Kexue (Journal of Shenyang Agricultural University
(Social and Edition)), 42(5): 570-573 (胡凤荣, 任翠, 鲍仁
蕾,罗凤霞, 2011, 风信子 DNA不同提取方法的效果比
较,沈阳农业大学学报(自然科学版), 42(5): 570-573)
Hu F.R., Wang F., Wang Z.Q., Ren C., and Bao R.L., 2013, Opti-
mization of ISSR-PCR reaction system and primer selection
for Hyacinth, Fenzi Zhiwu Yuzhong (Molecular Plant Breed-
ing), 11(1): 139-144 (胡凤荣,王斐,王志强,任翠,鲍仁蕾,
2013,风信子 ISSR-PCR体系的优化及引物筛选,分子植
物育种, 11(1): 139-144)
Luo X.Y., and Dai S.L., 2009, The application of ISSR technique
in ornamental plants research, Hubei Nongye Kexue (Hubei
Agricultural Sciences), 48(7): 1760-1764 (雒新艳,戴思兰,
2009, ISSR分子标记在观赏植物研究中的应用, 湖北农
业科学, 48(7): 1760-1764)
Wang J.B., 2002, ISSR markers and their applications in plant ge-
netics, Yichuan (Hereditas (Beijing)), 24(5): 613-616 (王建
波, 2002, ISSR分子标记及其在植物遗传学研究中的应
用,遗传, 24(5): 613-616)
Wang J.Z, Liu Y.Q., Yang B., and Wang X., 2008, ISSR molecular
marker and its application in garden plant genetics and breed-
ing, Shandong Nongye Kexue (Shandong Agricultural Sci-
ences), 8: 17-20 (王际振,刘亚琼,杨兵,王献, 2008, ISSR分
子标记及其在园林植物遗传育种中的应用,山东农业科学,
8: 17-20)
Wei L.H., Li X.S., Li X.L., Wang Y.J., Wang B., Wu J.S., and
Long H., 2010, Obtaining F1 hybrid and hybrid identification
between Raphanus sativus L. and Brassica alboglabra bailey,
Wuhan Zhiwuxue Yanjiu (Journal of Wuhan Botanical Re-
search), 28(2): 243-245 (魏丽华,李象松,李炫丽,汪艳杰,
王冰,吴江生,龙鸿, 2010,萝卜-芥蓝杂种F1代创制及
杂种鉴定,武汉植物学研究, 28(2): 243-245)
Yan H., Zhang D.M., Luo Y.L., and Lu L., 2010, ISSR analysis of
genetic relationship among 38 China orchid cultivars, Fenzi
Zhiwu Yuzhong (Molecular Plant Breeding), 8(4): 736-741
(严华,张冬梅,罗玉兰,鲁琳, 2010, 38种国兰亲缘关系的
ISSR分析,分子植物育种, 8(4): 736-741)
Zietkiewicz E., Rafalski A., and Labuda D., 1994, Genome fin-
gerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored
polymerase chain reaction amplification, Genomics, 20(2):
176-183
利用 ISSR分子标记分析 29个风信子品种的遗传多样性
Genetic Diversity of 29 Hyacinth Germplasm Resources Revealed by Using ISSR Markers
385