全 文 ：收稿日期：2011-06-23
基金项目：国家林业局“948”项目（2009-4-12）；中国博士后科学基金面上项目（20100470217）；江苏省高校优势学科建设工程资助项目
作者简介：胡凤荣（1969-），女，南京林业大学副教授，北京林业大学博士后，从事园林植物遗传育种研究。 * 通讯作者 Corresponding author：罗凤霞
（1958-），女，金陵科技学院教授，硕士，从事园林植物遗传育种研究。
沈阳农业大学学报，2011－10，42(5)：570-573
Journal of Shenyang Agricultural University，2011－10，42(5)：570-573
风信子 DNA不同提取方法的效果比较
胡凤荣 1,2，任 翠 2，鲍仁蕾 2，罗凤霞 3*
（1.北京林业大学，北京 100083；2.南京林业大学，南京 210037；3.金陵科技学院，南京 210038）
摘要：采用简易 CTAB 法、改良 CTAB 法、SDS-CTAB 法、高盐法和 CTAB-硅珠法等 5 种方法对风信子花蕾、叶片和鳞片基因组
DNA 进行提取。 比较 DNA 纯度、电泳、得率等指标，结果表明：CTAB-硅珠法没有获得 DNA，其他方法均可提出 DNA；在纯度方
面，简易 CTAB 法＞SDS-CTAB 法＞改良 CTAB 法＞高盐法；在得率方面，简易 CTAB 法＞改良 CTAB 法＞高盐法＞SDS-CTAB 法。简易
CTAB 法提取的 DNA 纯度较高，OD260/OD280为 2.01，OD260/OD230为 2.33，浓度为 406.8ng·μL-1，得率为 175.95ng·μL-1。 花蕾、叶片适
合风信子基因组 DNA 的提取。
关键词：风信子；基因组 DNA；提取方法
中图分类号：S682.2 文献标识码： A 文章编号： 1000-1700（2011）05-0570-04
Comparison of Genomic DNA Extraction Methods From Hyacinth
HU Feng-rong1,2， REN Cui2， BAO Ren-lei2， LUO Feng-xia3*
(1.Beijing Forestry University, Beijing 100083, China; 2.Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China; 3. Jinling Institute of Technology,
Nanjing 210038, China)
Abstract： Five methods including simple CTAB, CTAB improved method, SDS-CTAB method, high salt precipitation method and
silica-purification method were used to extract genomic DNA from different parts of Hyacinth such as bud, leaves, scale. The
results were compared by three parts, purity, the electrophoreses results and yield of the extracted DNA. The results showed that
all of these DNA extraction methods except for CTAB-silica-purification method could obtain DNA. The purity of extracted DNA
was as following : simple CTAB method ＞SDS-CTAB method ＞CTAB improved method＞high salt precipitation method, and yield
as following : simple CTAB method＞CTAB improved method＞high salt precipitation method＞SDS-CTAB method. Simple CTAB
method could obtain more purity DNA than the other methods and OD260/OD280 was 2.01,OD260/OD230 was 2.33. The concentration
was 406.8ng·L-1 and the yield was 175.95ng·g-1.The extraction results from different parts showed that flower buds and leaves
were both suit for Hyacinth obtain DNA.
Key words： Hyacinthus; genomic DNA; extraction methods
风信子是世界五大球根花卉之一，属百合科（Liliaceae）风信子属（Hyacinthus），原产于地中海和南非 [1]。 虽
然风信子起源简单，但历经几个世纪的变迁，其遗传多样性与亲缘关系也发生了很大变化，但至今尚未有风信
子品种亲缘关系和遗传多样性的报道。 随着生物技术的迅速发展，可以从分子水平上揭示植物的遗传多样性
以及属种间的亲缘关系， 而获得高质量的 DNA 是进行分子生物学研究的基础和关键。 不同研究目的对 DNA
纯度和质量的要求不同。 提取材料的来源、部位、形态等外在性质和化学成分、组织结构等内在特点的差异，严
重影响提取 DNA 的质量和数量 [2]。 因此，选择适宜的 DNA 提取材料和提取方法是进行分子生物学研究的前
提。 本研究以风信子鳞片、花蕾和叶片为 DNA 提取材料，采用简易 CTAB 法、改良 CTAB 法、SDS-CTAB 法、高
盐沉淀法和 CTAB-硅珠法提取风信子不同部位总 DNA， 并对 3种组织和 5种方法所提取的 DNA纯度和含量
进行对比，以确定风信子基因组 DNA提取的较优组织和方法。
1 材料与方法
1.1 材料
供试的 3个风信子 （Hyacinthus orientalis） 品种选自本课题组 2009～2010年从荷兰引进的 34个园艺风信
子，分别是 Fondant（粉色）、White Pearl（白色）和 Sky Jacket（蓝色）。
第 5期
表 1 不同部位提取 DNA结果
Table 1 Different parts of the extract DNA results
部位
Parts
叶片 Leaves
花蕾 Buds
OD260/OD280
2.02
2.00
OD260/OD230
1.82
1.75
浓度/ng·L-1
Concentration
239.68
261.40
得率/ng·g-1
Yield
72.38
95.64
试验采用的试剂有：PVP（聚乙烯吡咯烷酮）、SDS（十二烷基磺酸钠）、CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）、Tris
（三羟基氨基甲烷）、Tris 平衡酚、EDTA-Na2（乙二胺四乙酸二钠）、GusCN（硫氰酸胍）、β-巯基乙醇、琼脂糖等为
进口分析纯试剂，购于南京生物技术有限公司；氯化钠、盐酸、冰乙酸、乙酸钠、乙酸钾、氢氧化钠、三氯甲烷、异
戊醇、goldview、硅珠粉、无水乙醇、异丙醇等为国产分析纯试剂，购于上海生物工程技术服务有限公司；DL100
DNA Ladder 购于上海捷瑞生物公司；液氮购自南京燕子矶氧气厂。 试剂参照邓文明等方法[3]进行配制。
1.2 方法
分别取风信子幼叶、花蕾和鳞片，用超纯水洗净，用吸水纸吸干，按 1.0g 分成小份包装，立即放入-80℃冰
箱备用。 试验设 3次重复，试验所得数据为 3次重复的平均值。
1.2.1 风信子基因组 DNA提取方法 简易 CTAB 法参照田勇明等[4-6]的方法，并稍做修改。 具体步骤为：①称
取 1.0 g 样品放入研钵中，加入液氮，迅速研磨成细粉末，并迅速转移至 10mL 离心管。 ②加入 4mL65℃预热的
提取缓冲液，涡旋混匀，然后置于 65℃水浴中保温 1h，期间颠倒混匀 2~3次。③水浴后取出离心管，每管加入等
体积氯仿/异戊醇（24∶1）混合液，轻轻来回颠倒混匀。 ④4℃10000 r·min-1离心 10min 后，将上清液转入另一个
10mL离心管中，重复 2～3次。 ⑤加入 2/3体积冰冻无水乙醇，轻轻颠倒，放置-20℃冰箱 1h。 12000r·min-1离心
5min。 ⑥将所得沉淀用 70%乙醇洗涤 2次，风干后溶于 100μLTE缓冲液，置-20℃备用。
改良 CTAB法是在简易 CTAB法基础上，增加 CTAB提取液中 CTAB浓度至 3%，EDTA浓度至 30mmol·L-1，
巯基乙醇浓度增至 4%，并在研样前将研钵提前预冷。
SDS-CTAB结合法是参照孙鑫等[7]提取棉花总 DNA的方法。
高盐法是向简易 CTAB法获得的 DNA中加 3mol·L-1NaCl 至 NaCl 终浓度为 2.5mol·L-1，重复简易 CTAB 法
的⑤~⑥步骤。
CTAB-硅珠法是参照邓明文[3]岷江百合提取总 DNA的方法。
1.2.2 DNA质量与浓度、 纯度检测 采用美国 BECKMAN公司生产的型号为 DU640 的核酸蛋白分析仪测定
OD230、OD260 和 OD280 的值，并计算 OD260/OD280、OD260/OD230、DNA 浓度（ng·μL-1）和 DNA 得率（ng·g-1）。 DNA 浓
度= OD260×测定样品体积×稀释倍数，DNA得率=DNA浓度×总样品体积/样品鲜重。
取 5μL TE 溶解的 DNA 进行 0.8%琼脂糖凝胶电泳，放入珠海黑马凝胶成像系统观察拍照 [8]，检测提取所
得 DNA的质量。
1.2.3 ISSR—PCR 扩增 ISSR-PCR 反应体系 （20μL） 为 ：10×PCR Buffer 2μL、25mmol·L -1 Mg2+ 1.4μL、
2.5mmol·L-1 dNTP 1.5μL、10pmol·μL-1引物 1.5μL，5U·μL-1 Taq 聚合酶 0.2μL，30ng·μL-1模板 1.2μL， 最后用
ddH2O 补足体积。 扩增程序在杭州朗基 MG96+PCR仪上进行，扩增程序采用 Touch-down-PCR（降落 PCR）。 即
94℃预变性 5min；94℃变性 40s，54℃退火 45s，72℃延伸 1min30s，3 个循环；94℃变性 40s，52℃退火 45s，72℃延
伸 1min30s，10 个循环；94℃变性 40s，51℃退火 45s，72℃延伸 1min30s，20 个循环；94℃变性 40s，50℃退火 45s，
72℃延伸 1min30s，20个循环； 72℃延伸 8min；最后 4℃保存。
1.2.4 反应产物的电泳与检测 扩增产物采用 2%琼脂糖，goldview 染色，在 1×TAE 缓冲液中，以电压不超过
5V·cm-1的电场强度电泳 1.5h，电泳结束后在黑马凝胶成像系统上成像。
2 结果与分析
2.1 5种方法提取风信子总 DNA的比较
在试验初期对不同部位材料提取的 DNA 进行电泳检测，发现鳞片提取 DNA 带较弱且研磨时不易磨成粉
末状，故在后期试验中舍弃鳞片材料。 由表 1可知，风信子不同部位所提的基因组 DNA差异较小，花蕾所提取
的 DNA浓度稍高于叶片。由表 2可知，不同方法提取
风信子总 DNA 在得率和质量上存在一定的差异。 从
浓度和得率上看，简易 CTAB 法＞改良 CTAB 法＞高盐
法＞SDS-CTAB 法＞CTAB-硅珠法，并且 CTAB-硅珠法
与其他 3 种方法相比提取总 DNA 的浓度相对偏小，
可视为提取失败。 OD260/OD280的数值在 1.8~2.0 范围
胡凤荣等：风信子 DNA不同提取方法的效果比较 571· ·
第 42卷沈 阳 农 业 大 学 学 报
图 1 DNA的琼脂糖凝胶电泳图谱
1~6.简易 CTAB法；7~12.SDS-CTAB法；13~18.高盐法，19~24.硅珠法；1~3,7~9,13~15,19~
21.叶片提取；4~6,10~12,16~18,22~24为花蕾提取
Figure 1 Agarose gel electrophoresis of the genomic DNA
1-6：Simple CTAB; 7-12.SDS-CTAB; 13-18.High salt precipitation; 19-24.Silica-
purification；1-3,7-9,13-15,19-21.Leaves；4-6,10-12,16-18,22-24.Buds
图 2 改良 CTAB法 DNA的琼脂糖凝胶电泳
图谱
1~3 叶片提取；4~6 花蕾提取
Figure 2 Agarose gel electrophoresis of the
genomic DNA by CTAB improved method
1-3.Leaves；4-6.buds
图 3 风信子 DNA琼脂糖凝胶电泳图谱
Figure 3 The result of agarose gelelectrophoresis
from Hyacinth
1.Amsterdan;2.Jan Bos;3.City of Hearlem; 4.Gipsy Queen;5.Anna
Marie;6.Lady Derby; 7.White Pearl;8.Carnegie; 9.Blue Star;10.Delt
Blue;11.Atlantic; 12.Blue Jacket; 13.Purple sensation;14.Sky Jacket;
15.Wood Stock;16.Aiolos
表 2 5种方法提取风信子基因组 DNA结果
Table 2 The results of extracting DNA from Hyacinthus orientalis by five methods
方法 Method
简易 CTAB Simple CTAB
改良 CTAB CTAB improved method
SDS-CTAB
高盐法 High salt precipitation
CTAB-硅珠法 Silica-purification
OD260/OD280
2.01
2.04
2.05
1.96
-
OD260/OD230
2.33
1.75
1.23
1.59
-
浓度 Concentration/ng·L-1
406.8
229.25
169.5
196.9
-
得率 Yield/ng·g-1
175.95
61.75
33.36
65.06
0.025
内最好， 表示基本没有蛋白质、RNA 的污染 [9]。 简易 CTAB 法、 改良 CTAB 法、SDS-CTAB 法和高盐法提取的
DNA 纯度都比较高，OD260/OD280均值都在 2.0 左右。 OD260/OD230的数值在 2.0 左右表明色素、小分子、盐离子等
杂质较少[10-11]，由表 2可知，简易 CTAB 法纯度最高，SDS-CTAB 法最低。
2.2 DNA质量的凝胶电泳检测
由图 1和图 2可知，除 CTAB-硅珠法没有检测到 DNA 条带，其他 4种方法均获得完整的 DNA 条带。SDS-
CTAB 法、高盐法、改良 CTAB 法的点样孔均有一定亮度，这说明 DNA 样品中含有未被去除的蛋白质、多糖及
其他一些次生代谢物质，这些物质与 DNA 粘连形成复合物，使部分 DNA 无法离开点样孔或电泳速度较慢 [12]。
其中高盐法的点样孔最亮，简易 CTAB 法效果最好。 由于没有去除 RNA，所以电泳结果有大量的 RNA 片段。
SDS-CTAB 法提取的 DNA 条带最清晰，高盐法有大量的 RNA 片段，改良 CTAB 法提取的 DNA 有微弱的拖尾，
说明 DNA 有降解，简易 CTAB 法提取 DNA 的条带相对较弱。 由图 1 可知，4 种方法中，花蕾和叶片所提取的
DNA 差异并不明显。 综上，从电泳结果 DNA 纯度看，简易 CTAB 法＞SDS-CTAB 法＞改良 CTAB 法＞高盐法。 可
见，简易 CTAB 法提取 DNA 效果较好，多糖、蛋白质等杂质较少，且步骤相对简单，可节省大量时间。
采用简易 CTAB法对 34个风信子品种提取了基因组 DNA，选取 16个品种经 0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测，
显示所提取的 DNA条带清晰，点样孔干净，且无拖尾现象，说明 DNA无降解现象，可用于下一步检测（图 3）。
2.3 ISSR-PCR 扩增结果
采用简易 CTAB 法提取 34 个风信子品种的基因组
DNA， 以其中的 12 个品种 DNA 为模板 ， 采用引物
UBC845 进行扩增，结果见图 4。 12 个品种均可扩增出丰
富的条带， 进一步证明简易 CTAB 法适合风信子 DNA 的
提取，可满足 PCR扩增的要求。
3 结论与讨论
从提取的 DNA 产量、 质量以及提取步骤等方面综合
考虑，风信子 DNA 的较优提取方法为简易 CTAB 法。简易
CTAB 法提取的 DNA 纯度较高，OD260/OD280为 2.01，OD260/OD230为 2.33；浓度为 406.8ng·μL-1。 同种方法不同部
位提取 DNA 差异不显著，但考虑到花蕾受季节限制，并且风信子鳞片含糖量较高，研磨时易结块，会对 DNA 提
取造成一定困难。 所以，在实际工作中选择风信子叶片做为提取 DNA 的材料。
572· ·
第 5期
图 4 引物 UBC845 对 12个风信子品种基因组 DNA
ISSR扩增结果
Figure 4 Electrophoresis diagram of ISSR analysis
of Hyacinthus orientalis With primer UBC845
1.Blue Star;2.Delt Blue;3.Atlantic; 4.Blue Jacket; 5.Ostara;6.Blue
Magic;7.Minos;8.Purple sensation; 9.Sky Jacket;10.Wood Stock;
11.Amethyst;12.Splendid Cornelia
研究表明，材料处理、选材部位及提取方法对 DNA 的
质量有着直接的影响 [13-15]。 材料的质量是提取高质量 DNA
的前提和保障， 故应采用正确的保存方法使得样品材料尽
量不要受到机械损伤和不被氧化褐变， 不为内源核酸酶催
化降解等。 本研究采用-80℃冻存法保存样品，获得了较高
质量的 DNA，这与前人的研究结果相同 [16-18]，为提取高质量
的基因组 DNA 奠定了基础。 同一植物不同部位的多糖和其
他一些次生物质含量不同，很难找到提取出高质量 DNA 的
通用方法 [19]，本研究中分别提取风信子鳞片、花蕾及叶片 3
个部位的 DNA 进行分析。 同种方法不同部位提取 DNA 差
异不显著，但花蕾受季节限制，而鳞片中含有大量的淀粉，仅有很少的细胞，研磨时易结块，故难以提取 DNA，
所以在实际研究中选择叶片做为提取 DNA 材料。
在提取 DNA 的过程中，多糖等次生代谢物质的干扰影响到 DNA 粗提物的数量和质量[20]。 这些物质会抑制
多种酶的活性，将对后续的操作产生严重的影响。风信子组织细胞中含有大量的多糖，如果提取方法选择不当，
会使 DNA 埋在这种粘稠胶状物中而难以溶解 [21]，所以，在总 DNA 提取过程中必须将酚类物质、多糖和蛋白质
等化合物除去。 本研究设计的 5种 DNA 提取方法去除杂质的程度不同，OD260/OD280的数值在 1.8~2.0范围内最
好，表示基本没有蛋白质、RNA 的污染[9]，OD260/OD230的数值在 2.0 左右表明色素、小分子、盐离子等杂质较少 [10-
11]，试验表明简易 CTAB 法的提取效果最好。 在实际工作中可针对不同植物材料的特性和实验要求选择合适的
提取方法[22]。 SDS-CTAB 与 CTAB-硅珠法操作步骤较为繁琐，且在用 CTAB-硅珠法提取 DNA 时，发现由于硅
珠漂洗液在低温情况下处于一种过饱和状态，增加了试验的难度，最终导致无法提取 DNA。 高盐法由于多加了
一步 NaCl溶解 DNA，可能会导致所得 DNA 中含有大量盐离子，影响 PCR扩增。 简易 CTAB 法不仅易于操作，
且所需药品相对简单、成本低，适于大量提取风信子基因组 DNA。
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[责任编辑 马迎杰]
胡凤荣等：风信子 DNA不同提取方法的效果比较 573· ·