全 文 ：园 艺 学 报 2( 0 )7, 34 ( 5 ) : 126 7 一 1272
A
e t a H
o rt j
e u l t u 朋 e iS n j e a
风信子再生花芽中胚珠特征基因 h o m a de l 的表达
宿红艳 ’ , 王 磊” , 葛宜和 ` , 张玉香 ` , 李兴国2 , 张宪省 ,
鲁东大学生命科学学院 , 山东烟台 2 64 0 25 ; ’ 山东农业大学生命科学学院 , 山东泰安 27 101 8)
摘 要 : 以风信子花被片为外植体 , 通过控制外源植物生长调节剂 6 一 B A 和 2 , 4 一D 浓度诱导再生胚珠的
分化。 细胞学观察显示 , 离体条件下胚珠的发育过程与自然状态下基本一致 。 利用原位杂交技术分析风信
子胚珠特征基因 ho m a dS I 在再生胚珠分化过程中的表达模式 。 在胚珠形态发生之前 , ho 7azI 山 1 m RN A 就已在
心皮状结构边缘的某些细胞中积累 , 之后集中在由此处产生的胚珠原基和幼嫩的胚珠中 , 表明 ho lna dS I
m R N A 在启动再生胚珠的分化的过程中起重要作用 。 分别提取不同发育时期再生花芽的总 R N A , 以 ho m -
a dS I 的特异序列设计引物 , 进行 R T一 PC R 分析 。 结果显示 , 在降低 6 一 BA 和 2 , 4 一D 浓度后 s d 的再生花芽中
即检测到了 ho m a dS I m R NA 的积累 , 而在高浓度 6 一 B A 和 2 , 4 一D 条件下持续培养的花芽中均未检测到该基因
的转录产物 , 表明低浓度 6 一 BA 和 2 , 4 一D 诱导 ho ln a ds l 在再生花芽中的表达 。
关键词 : 风信子 ; 胚珠 ; 花芽 ; 基因 ; 表达分析 ; 植物生长调节剂
中图分类号 : 5 68 2 . 2 ` 9 文献标识码 : A 文章编号 : 05 13 一3 53 x ( 20 7 ) 05 一 12 67刁 6
E x P r e s s i o n A n a l y s i s o f O vu l
e I d e n t i t y G e n e h o m a dS I D u r i n g in Vi 介’o F lo w e r -
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S u H o n g
一
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W A N G 玫 11 ` , G E Y i 一 h e l , z H A N G Y u 一 x i a n g { , Ll X i n g 一 g u o Z , a n d z H A N G x i a n 一 s h e n g Z
(
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oC l eg of L诉 sc ic cn es , uL do ng un iv e sr iyt , aY n at i , hs a n g己。 gn 264 025 , hC ina ; 2 co l le g e of ha sc ic nc e 、
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A b s t r a e t : T e Pal s o f yH
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.
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a t io n o f o v u l e s
t h r o u gh e o n t r o l li n g th e l e v e l o f 6
一
B A a n d Z
,
4
一
D i n t h e m e d i a
.
A n a t o m i e a l s t u d i e s u s i n g l i g h t m i e r o s e o p y
s h o w e d t h a t th e d e v e l o Pm e n t o f i n v it or o v u l e s r e s e m b l e d t h a t o f i n p l a n t a
.
T o in v e s t i g a t e th e te m P o r a l a n d
s p a t i al e x P er s s io n P a t t e r n o f h o m a d s l d u r i n g i n v i t or o v u l e i n i t i a t i o n
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.
T h e h yb r id i z a ti o n s i g n a l s w e r e
if r s t d e t e e t e d i n s o m e e e ll s a l o n g t h e e d g e o f e a甲 e l一 l ik e o r g a n , fr o m w h i e h t h e o v u l e s w e r e d e r i v e d , a n d
t h e n r e s t r i e t e d to t h e o v u le P r im o dr i a l a n d o v u l e s
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T h e r e s u l t s i n d ie a t e d th a t h o m a ds l p la y s a n im p o rt a n t r o l e
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D d u r i n g in v it r o o v u l e i n i t i a t i o n a n d d e v e l o p m e n t
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h o r ln o n e s
.
K e y w o r d s : 场 u e i n th us o r i e n t a l is L . ; O v u l e ; F l o w e r b u d ; G e n e ; E x P r e s s i o n a n a l y s i s : P l a n t gor wt h er g -
u l a t o r
风信子 口寿口 ic nt h o or ic nt al is L . ) 是我国重要的春季花卉 。 以风信子花被片为外植体 , 通过控制
外植体的年龄和外源植物生长调节剂的浓度 , 可诱导花芽的再生和控制不同花器官的分化 ( uL el
a l
· ,
19 8 5 )
。
收稿日期 : 2 0 6 一 12 一 06 ; 修回日期 : 2 0 7 一 04 一 23
基金项目 : 国家自然科学基金项目 ( 30 37 0 14 3 : 30 2 7 0 6 5 1 ) ; 鲁东大学中青年基金项 目 (04 3 30 2 ; 2 (X拓 3 30 1 )
* 通讯作者 A u th o r fo r e o er s p o n de n e e ( E 一m ia l : w a n gl e i9 9 0 9 @ 16 3 . C o m )
DOI : 10. 16420 /j . i ssn. 0513 -353x . 2007. 05. 037
1268 园 艺 学 报 34 卷
本实验室已成功建立起该再生系统 , 将花粉粒处于二胞晚期的外植体在含有高浓度 6 一 B A ( 2
m g
·
L
一 ’
) 和 2 , 4 一 D (0 . 1 m g · L 一 ’ ) 的 M S 培养基上培养 1 个月 , 可以诱导花芽的再生 。 如果保持高
浓度不变 , 从再生花芽的中心部位会连续不断地分化出新的花被片 。 如果将再生花芽转移到低浓度
6
一
BA (0
.
2 m g
·
L
一 ’
) 和 2 , 4 一D (0 . ol m g · L 一 ’ ) 的培养基上 1 个月即能观察到胚珠原基的形成 , 之
后 , 胚珠逐渐发育成熟 。 这种实验系统将花器官分化的复杂过程简化为单类器官的发生 , 初步建立起
植物生长调节剂与胚珠发生的对应关系 , 为研究植物生长调节剂调控胚珠发育的机理提供了有效途径
( L
u e t a l
. ,
19 8 8 ; 张宪省 等 , 2 0 0 0 ; L i e t a l . , 2 0 0 2 ) 。
由于同源异型基因与胚珠发生的关系比较清楚 , 因此 , 我们的首要任务是从风信子中克隆直接控
制胚珠发生的同源异型基因 。 目前 , 利用同源克隆的方法已从风信子的胚珠中分离到 M A D S b ox 基因
ho m
a山 1 , R N A 分子杂交结果表明 , ho m a山 l 为在胚珠中特异表达的基因 。 为确定该基因的功能 , 构
建 35 :5 : ho m a ds l 正义表达载体 , 并转化拟南芥 。 转基因植株的第一轮花器官转变为心皮状结构 , 其
边缘着生有异位的胚珠 , 末端具有明显的柱头状的乳突 , 从功能上进一步阐明 ho m a ds l 为风信子决定
胚珠特征的关键基因 (X u e t a l . , 2 0 0 4 ) 。
在此基础上 , 本研究着重利用风信子花器官再生系统 , 分析 ho m a ds l 在再生胚珠分化过程中的组
织特异性表达 , 及其表达与外源植物生长调节剂浓度之间的关系 , 以期为最终揭示植物生长调节剂控
制胚珠发育的机理提供新的资料 。
1 材料与方法
1
.
1 材料
试验为风信子栽培品种 ` Del ft B lue ’ , 从北京金地公司购买 3 年生鳞茎 , 于 1 月上旬埋于土中 ,
在 0 一 5℃左右的温度中贮存 2 个月后 , 陆续用于试验 。
1
.
2 花芽的再生及其花被片和胚珠的诱导
取花粉粒处于二细胞晚期的花芽 , 按 uL 等 ( 19 8 ) 的方法进行分离和消毒 。
以分离出的花被片作为外植体 , 在含有 6 一B A 2 m g · L 一 ’ 、 2 , 4 一D 0 . 1 m g · L 一 ’ 和蔗糖 3% 的 M s
( M盯as hi ge & kS o g , 1962 ) 培养基上诱导产生花芽 , 然后在相同的培养基上诱导花被片的分化 。 一
个月后 , 将再生花芽转移到含有 6 一BA 0 . 2 m g · L 一 ’ 、 2 , 4 一D 0 . 01 m g · L 一 `的 M S 培养基上诱导胚珠的
分化 。
培养条件参照 uL 等 ( 19 88) 的文献 。
1
.
3 细胞学观察
选取花蕾 、 幼花和成熟的雌蕊以及在附加 6 一 BA 2 m g · L 一 ’ 、 2 , 4 一 D 0 . 1 m g · L 一 `的培养基上培养
o
、
5
、
10 和 3 o d 和转移至含有 6 一 B A 0 . 2 m g · L 一 ’ 、 2 , 4 一 D 0 . 0 一 m g · L 一 ’ 的培养基上培养 2 0 、 3 0 、 4 5
和 6O d 的再生花芽 , 用 FA A ( 50 % 乙醇 : 10 % 冰醋酸 : 5% 甲醛 ) 固定 16 h , 经脱水 、 透明 、 浸蜡 、
包埋后 , 用 AO 手摇式切片机进行切片 , 厚度为 7 一 8 林m 。 甲苯胺蓝 ( T B O ) 染色后 , 用 Ol yP m us
B H
一
2 型显微镜观察照相 , 进行细胞学观察 。
1
.
4 原位杂交
选取不同发育时期的再生花芽 , F AA 固定过夜 ( 4 ℃ ) 。 经脱水 、 透明 、 浸蜡后 , 用石蜡 ( 51 9 -
m a ) 包埋 。 用 AO 手摇式切片机进行切片 , 厚度为 8 林m 。
根据 ho m a ds l 的核昔酸序列 , 在 3 ’ 端非保守区设计一对特异引物 : H S ( 5 ’ 一 T G AA TA C AT G -
C A G AA A A G G
一
3
’
) 和 H 6 ( 5 ` 一A T CAT A AT A C T G AG C CA T AG 一3 ` ) , 进行 P CR 反应 。 反应条件如下 : 94 ℃
预变性 3 m in 后 , 94 ℃变性 1 m in , 56 ℃退火 1 m in , 72 ℃延伸 1 m in , 共进行 35 个循环 。 经测序证实
该片段为 ho aln ds l 的 3 `端序列 。
5期 宿红艳等 : 风信子再生花芽中胚珠特征基因 ho nal ds l的表达 126 9
将该片段连接到 pG EM 一 T载体上 , 分别用 Nc o l 和 助。 I 对得到的重组质粒进行线形化 。 以纯化
后的线形化产物为模板分别在 S p 6 和竹 转录酶的作用下合成由地高辛标记的反义和正义探针 , 具体
方法参照 D IG 一R NA L a b e l i n g 愉 t ( R o e h e ) 进行 。
将标记好的探针于 85 ℃水浴 5 m in , 迅速置于冰水浴中冷却 , 然后加人杂交液 ( oR hc e ) 中至终
浓度 Zo gn · m L 一 ’ 。 每张玻片上滴加 10 林L杂交液 , 于湿室中 42 ℃ 杂交过夜 。
经洗片 、 封闭后 , 每片滴加 2 00 林L a n t i一 D I G 一A p (按 l : 1 0 0 稀释 ) 。 用 2% N B罗 B e IP 显色后 ,
封片照相 。
1
.
5 总 R N A 的提取和 R -T P C R 分析
分别提取不同发育时期再生花芽的总 R N A , 具体方法参照 RN ea sy lP an t iM in 儿 t ( QI A G EN) 说明
书进行 。
取 10 林g 总 R NA , 用 10 U 的 DN a s e l ( R N a s e 一 fer e ) 在 37 ℃消化 1 5 m i n , 然后用苯酚 / 氯仿 / 异戊
醇抽提 3 次 , 乙醇沉淀 。 取 2 林9 R N A 进行反转录 , 合成 e DN A 第一链 ( A e e e s s RT一P e R s y s te m , P r e -
m e g a )
。
以 H S 和 H 6 为引物进行 P C R 反应 , 反应条件同上 。 取 5 林L P CR 产物 , 用 1 . 2% 琼脂糖凝胶电泳
分离后在 1 林g · m L 一 ’澳化乙锭溶液中染色 。
2 结果与分析
2
.
1 低浓度植物生长调节剂诱导风信子再生花芽中胚珠的产生
为进一步研究再生胚珠是否具有成熟的胚囊 , 选取在自然情况下不同发育时期的雌蕊和离体条件
下不同发育时期的再生花芽进行细胞学观察 。
图 1 , A 一 D 和 E 一 L 分别显示在自然情况下和离体条件下胚珠的发育过程 。 根据再生花芽的形态
特征 , 将再生胚珠发育过程分为 8 个时期 (表 1 ) 。 这些观察表明 , 再生胚珠分化启动至大抱子发生
和胚囊发育的过程与自然条件下的基本一致 。
表 1 风信子再生胚珠的发育过程
T a ble 1 D
e v e l0 Pm
e n t o f het 代g e en ar edt o vu les i n yH a c in ht u s
培养时间
C u l t u祀 t i m e
( d )
时期
St a g e
特征描述
D e s e ir P t i o n
植物生长调节剂
p lan t g r o w th er g u la t o r ( m g
·
L
一 ’
外植体 (图 1 , E )
E x p la nt s ( F ig
.
l
,
E )
花丝腋部表皮下细胞开始分裂 (图 1 , )F
C e l l d i v i s i o n b e ig
n s in ht e e e l l s b e low 叩 id e mr i s ( F ig · l , F )
花芽原基的形成 (图 1 , G )
F l o alr p ir
ln o r d i a ( Fi g l
,
G )
再生花芽分化出几轮花被片 (图 1 , H )
F low
e rs iw ht a fe w w h o rl s of t e p al s ( F ig
.
l
,
H )
花芽中心部位产生心皮状结构 (图 1 , )I
C a甲 e l一 li ke o r g a n s fo
rme
d fro m th
e e e n t e r Of fl o ral b
u d s ( F i吕 l , I )
胚珠原基产生 (图 l , )J
O v u le p ir m de i a ( F ig
.
l
,
J )
具有内珠被和外珠被的幼嫩胚珠 (图 1 , K )
Y o u n g o v u l e s w i ht t w o i nt e即 m e n t s ( F ig l , K )
成熟的再生胚珠 (图 1 , )L
M a t u re o v u l e s ( F ig
.
l
,
L )
6
一
B A
2
.
0
0
.
2
0
.
2
2
,
4
一
D
0
.
10
0
.
10
0
.
10
0
.
10
0
.
0 1
0
.
0 1
0
.
0 1
0
.
0 1
127 0 园 艺 学 报 34 卷
图 1 风信子胚珠在离体条件下与在植株中发育过程的比较分析
A 一 D
. 胚珠在植株中的发育 ; E 一 L . 再生花芽中胚珠的发育。
vo
. 胚珠 ; 叩 . 胚珠原基 ; p . 胎座 ; s t . 雄蕊 ;
t
;
。 ’ 心皮状结构 ; fm . 花分生组织 ; gy . 雌蕊 ; m . 雌配子体 ;
花被片 ; tP . 花被片原基 。 标尺 二 0 . 2 m m 。
iF g 1 C om P a ar it v e an al yis o f
o v ul e d e v e lo p m e n t in lP an at an d in
v自阳
A 一 D . o v u le d e v e l叩m e n t i n ht e fl o w er of th o p lan at ; E 一 L . o v u le d e ve lo p m e n t i n th e r e g e n e art e d fl o w e sr . e o . CaI’P e I一 li ke o铭 an :
fm 科 o alr m e ir s t e m ; gy
·
S t
.
G y n o e e i u m ; m M e g ag a m e t o p h y : o v
.
o vu le ; 叩 . o v u le p ir m o dr i a ; p , lP a n e e n l a ;
S t a m e n : t e
.
eT p al ; tp
.
eT p al p ir m
o rd ial
.
B ar 二 0
.
2 m m
.
2
.
2 h o m山众 1 在再生胚珠分化过程中的组织特异性表达
试验结果显示 , ho m a dS I 的转录产物特异地在心皮状结构边缘的某些细胞中积累 ,
及花被片中未检测到 ho m a ds l 的表达 ( 图 2 而在其它细胞A 、 B ) 。 在胚珠开始产生之后 , 杂交信号则集中在由上
图 2 ho m a ds l 在再生胚珠分化过程中时空表达分析
e 0
iF .g
心皮状结构 ; ip . 内珠被原基 ; n u . 珠心 ; 。 p . 胚珠原基 ; et . 花被片 ; 标尺 二 0 . 1 m m 。
2 L o c a l七a it o n o f h o m a ds l in ht e t is u e s Of r e g e n e ar t ed n o we r d u ir n g o v u 1e d ife er n t ia眨o n
e o
.
C呷 el 一 ljk e o r g a n ; i p . 知 n e r in 之e g “ m e n t p ir m odr i u m ; n u . N u e e ll u s
o p
.
O v u le p ir m耐 i u m ; t e . eT p al . B a r = 0 . 1 m m .
5期 宿红艳等 : 风信子再生花芽中胚珠特征基因 ho nla dS I的表达 12 7 1
述表达部位产生的胚珠原基中 (图 2 , C ) , 并持续在幼嫩胚珠的内珠被原基和珠心中 ( 图 2 , D ) 。
而在加人正义探针的阴性对照样品中未检测到相应的杂交信号 (结果未附 ) 。
ho m
a山 l 的表达类似于目前已鉴定的胚珠特征基因如矮牵牛加7 / n 和拟南芥 st k 的表达模式 , 后
两个基因均特异地在胎座及胚珠中表达 ( A n g e n e n t e t al . , 199 5 ; C o l o m b o e t a l . , 199 5 ; R o u n s l e y 。 t
al
. ,
199 5 ; F a v a or e t al
. ,
2X() 3 )
。
2
.
3 低浓度 6一 B A 和 2 , -4 D 诱导再生胚珠分化过程中 h o m山众 1 的表达
为了进一步了解 ho lan dS I 在再生花芽中表达的情况 , 分别提取不同发育时期再生花芽的总 RN A ,
以 h o lan ds l 的特异序列设计引物 , 进行 R T 一 P CR 分析 。 结果 (图 3) 显示 , 在转移到低浓度 6 一 BA 和
2
,
4
一
D 条件下培养 5 、 or 、 20 d 的再生花芽及再生胚珠中均能扩增出约 40 帅 的条带 , 而在外植体和
在高浓度 6 一B A 和 2 , 4 一D 条件下持续培养 30 、 35 、 40 和 50 d 的再生花芽中未检测到相应的条带 。
经序列分析证实该片段为 ho m a dS I 的片段 。 该结果表明 , 低浓度 6 一 B A 和 2 , 4 一 D 诱导 ho ma ds l 在
再生花芽中的表达 。
图 3 ho m山众 1 在不同发育时期再生花芽中的表达分析
M
.
Mar ke r ; 1
. 外植体 ; 2 一 5 . 分别为在高浓度 6 一 B A 和 2 , 4 一D 条件下培养
30
、
35
、
40 和 5 0 d 的再生花芽 ; 6 一 8 . 分别为转移到低浓度
6
一
B A 和 2 , 4 一D 条件下培养 5 、 or 和 20 d 的再生花芽 ;
9
. 再生胚珠 。
F ig
.
3 E x p r e S io n Of h o 刀协山1 d u血9 hte d e vel OP me n t o f ht e r e g e n e ar t de n o w e rs
M a r k e r : 1
.
E x P la n t s : 2 一 5
.
R e ge n e ar t e d fl ow
e rs a t hi gh l
e v e l s o f h o rm
o n e s of r 30
,
35
,
4()
,
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5 0 d a y s r e s p e e t i v e l y ; 6 一 8
.
R e罗n e ar t e d fl o w e 玲 at d叮 5 , 10 a n d 2 0 da y s re s pe e t i v e ly
aft
e r t ra n s fe re d
t o th e m ed i a w i th l o w l e v e l s o f p lan t
g r o w th re列 at o r s ; 9 . nI : i : ro o vu le s .
3 讨论
激素作为重要调节物质 , 参与植物生长发育的许多过程 , 胚珠的发育同样受到激素的调节 。 例如
在蝴蝶兰中 , 授粉通过诱导雌蕊中乙烯合成酶和 A C C 氧化酶基因的表达促进了乙烯的合成 , 而雌蕊
中乙烯浓度的升高进而启动了胚珠 的发育 ( N a d e a u e t al . , 19 9 3 ; o ’ N e i l l e t a l · , 19 9 3 ; z h a n g &
O
,
N e i l
,
1 9 9 3 )
。
然而 , 迄今为止人们对于激素调节胚珠发育的分子机理了解甚少 。 这主要是由于自然条件下各类
花器官的发育在种类 、 时间和空间上呈高度复合状态 , 并且植物体内存在多种激素 , 给研究工作带来
困难 。 因此 , 建立离体花器官再生系统将为研究激素调节胚珠发育的分子机理提供一个有效的途径
(张宪省 等 , 2 0 0 0 ; U e t al . , 2X() 2 ; X u e t al . , 2 0 04 ) 。
本研究以风信子花被片为外植体 , 通过控制生长调节剂浓度成功诱导了再生胚珠的分化 。 细胞学
观察结果表明 , 离体条件下胚珠的发育过程与自然状态下基本一致 。 由于 ho m a ds l 是决定风信子胚珠
17 2 2园 艺 学 报 34卷
特征的关键基因 ( X u etl a ., 2 0 0 4 ) , 推测再生胚珠的产生同样需要该基因的参与 。 因此 , 利用原位
杂交和 RT 一 P CR 检测了 ho m a ds l 基因在风信子再生花芽中的表达情况 。 结果显示 , 在胚珠形态发生之
前 , ho m a ds l m RN A 就已特异地在心皮状结构边缘的某些细胞中积累 , 之后集中在由此处产生的胚珠
原基和幼嫩的胚珠中 , 类似于特异地在胎座及胚珠中表达的矮牵牛加7 / n 和拟南芥 st k 的表达模式 。
值得注意的是 , 在降低 6 一BA 和 2 , 4 一 D浓度后 s d 的再生花芽中即检测到了 ho m a山 1 m R NA 的积
累 , 而在高浓度 6 一B A 和 2 , 4 一D条件下持续培养的花芽中均未检测到该基因的转录产物的结果 。 我们
推测 , 离体条件下降低外源生长调节剂浓度可能通过直接或间接的作用调控 ho lan ds l 表达 , 进而控制
胚珠的产生 。
R e fe r e n c e s
An罗 n e n t G C , F ar n k e n J , B u s s e h e r M , v an Dij k e n A , v a n W e n t J L , D o n s H J M , v a n T u n e n A J . 19 9 5 . A n o v e l e la s s o f M A D S b o x g e n e s 15
i n v o l v e d in o v u le d e v e lo p m e n t i n p e t u n i a
.
T h e P l a : I t C e l l
,
7 ( 10 ) : 1 56 9 一 15 82
C o lo m b o L
,
F r a n k e l, J
,
K o e tj e E
,
v a n W e rl t J D () n s H J M
,
A
,l g e l一e n t G C ,
18 59 一 18 6 8
.
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『
r u l l e n A J
.
1 99 5
`
T h e p e t u n la M A D S bo x g e n e 厂B尸1 1 d e t e r -
m i n e s o v u l e id e n t i t y
.
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e P la n t C e l l
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7 (川 :
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v a ro R
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