全 文 ：分子植物育种，2015年，第 13卷，第 6期，第 1336-1342页
Molecular Plant Breeding, 2015, Vol.13, No.6, 1336-1342
研究报告
Research Report
利用 ISSR分子标记方法鉴定风信子杂种后代
胡凤荣 * 何国仁 王斐 任翠
南京林业大学风景园林学院,南京, 210037
*通讯作者, hufengrong2003@sina.com
摘 要 园艺风信子品种染色体倍性变异丰富，染色体倍性高的品种杂交更易获得杂种后代，致使其杂种后
代真实性鉴定较为困难。本研究利用 3条引物对风信子 3个杂交组合(‘Ostara’בFondant’,‘Sky Jacket’×
‘Fondant’,‘White Pearl’בBlue Jacket’)的杂种后代进行 ISSR分子标记研究，以鉴定各杂交组合杂种后代
的真实性。结果表明：‘Ostara’בFondant’组合中 12个杂种后代为真实杂种，真实杂种率为 92%；‘Sky
Jacket’בFondant’杂种后代中 7个为真实杂种，真实杂种率为 41%；‘White Pearl’בBlue Jacket’14个杂种
后代均鉴定为真实杂种，真实杂种率为 100%。研究结果显示 ISSR分子标记方法可以用于风信子杂种后代
真实性的鉴定，将为开展风信子品种间大量杂种后代的快速鉴定和早期选择提供理论依据和实践方法。
关键词 风信子,杂种后代, ISSR,杂种鉴定
The Identification of the Hyacinth Hybrid Progeny by the Method of ISSR
Molecular Marker
Hu Fengrong * He Guoren Wang Fei Ren Cui
College of Landscape Architecture of Nanjing Forestry University, Nanjing, 210037
* Corresponding author, hufengrong2003@sina.com
DOI: 10.13271/j.mpb.013.001336
Abstract In horticulture, the large amount of ploidy variation in the chromosomes of hyacinth and the more
accessible hybrid offspring from hyacinth cultivators with high ploids makes it difficult to identify the authenticity
of their hybrid offspring. In this study, ISSR molecular labeling with 3 PCR primers was used to identify the
offspring of three hybrid combinations of hyacinth, including‘Ostara’בFondant’,‘Sky Jacket’בFondant’,‘White
Pearl’בBlue Jacket’. The results showed that 12 hybrid offspring from the combination of‘Ostara’בFondant’, 7
from the combination of‘Sky Jacket’בFondant’, and 14 hybrid offspring from‘White Pearl’בBlue Jacket’were
identified, with hybrid authenticity rates of 92%, 41%, and 100%, respectively. According to this study, ISSR
molecular markers can be used to identify the authenticity of hybrid offspring in hyacinth, which further provides
theoretical guidance and practical methods for rapid identification and early selection of the hybrid offspring
among various cultivars of hyacinth.
Keywords Hyacinth orientalis, Hybrid progeny, ISSR, Identification of hybrid
收稿日期：2014-11-27 接受日期：2015-01-05 网络出版日期：2015-04-16
URL: http://www.biopublisher.cn/index.php/mpbopa/article/view/2797
基金项目：本研究由江苏省高校优势学科建设工程资助项目(PAPD)资助
风信子(Hyacinth orientalis)是百合科(Liliaceae)
风信子属(Hyacinth)秋植球根花卉，原产于南非和地
中海(Van, 1992)。自 1562年风信子从土耳其引入东
欧(Darlington et al., 1951)，育种专家就不断对其进行
改良。现代栽培的园艺风信子，是由野生于黎巴嫩、
叙利亚、东美索不达米亚等地的原种风信子(H. orie-
ntalis)驯化培育而来。原种风信子有三个重要变种，
即罗马风信子(H. romanus)、大筒浅白风信子(H. ori-
entalis. var. praecox)和普罗文斯风信子(H. orientalis.
var. provincialis) (沈强等, 2004,中国林业出版社, pp.
63-64)。16世纪中叶，欧洲人开始栽培与应用风信
子，原种仅有蓝色与白色 2个色系，直至 18世纪中
叶陆续选育出红色、粉色、紫色和黄色系品种，1768
年有记录的风信子品种已超过 2000个，近年来同属
植物 H. amethystinus、H. ciliatus、H. azureus 和 H.
lineata也被逐渐引入栽培并参与育种研究(沈强等,
2004,中国林业出版社, pp.63-64)。
观赏植物的杂种鉴定、品种区分，常用方法主要
有：形态学方法、细胞学方法、生化标记、分子标记和
电镜技术等，也可多种方法相结合进行综合分析鉴
定(杨海岩, 2011)。其中形态标记、细胞标记和生化标
记能间接反映基因特征和基因表达结果，但这些标
记易受环境条件影响、多态性差且数目有限(陈名红
等, 2011a; 2011b)。而分子标记却可以直接检测生物
个体间 DNA的差异，并且具有特异性强、准确性高、
DNA用量少、重复性好、快速且信息量大、受生育阶
段和组织器官差异及环境的影响小等优点，因此能
有效揭示物种本质(陈名红等, 2011a; 2011b)。
ISSR (inter-simple sequence repeat)即内部简单
重复序列标记，是由 Zietkiewicz 等(1994)提出的一
种新型分子标记技术。ISSR标记技术具有实验操作
简单、DNA用量少、重复性高、稳定性好、安全性高、
耗资少等优点(陈名红等, 2011a;柴胜丰等, 2014)。因
此，该技术一经问世就在植物遗传分析方面得到了
广泛应用，其中在水稻(Oryza sativa L.)、小麦(Triticum
aestivum L.)等重要经济作物中首先得到应用(杜金昆
等, 2002;陈兆贵等, 2009)。目前已逐步拓展到观赏
植物领域，其应用范围包括：遗传多样性分析、亲缘
关系及分类研究、杂种后代鉴定、品种鉴定和种质资
源研究等。索志立等(2004; 2005)利用 ISSR标记技术
构建了杨山牡丹(Paeonia ostii)和牡丹(Paeonia suffru-
ticosa Andr.)、紫斑牡丹(Paeonia papaveracea)与牡丹
种间杂种后代的 DNA指纹图谱，在杂种后代中检测
到了分别来自双亲的特征带。吴学尉等(2009)对百合
杂种后代进行 ISSR鉴定，既检测到子代与父母本共
有的位点，又检测到特异性条带，进一步说明 ISSR
是一种有效的杂种后代鉴定方法。韩国辉等(2011)利
用引物 P827和 P834从 36株沙田柚(Citrus maxima
(Burm.) Merr. cv. Shatian Yu)×强德勒柚(Citrus maxi-
ma)杂交后代中鉴定出 31株为真杂种，用引物 P810、
P811、P812、P835 把 52 株沙田柚 ×红江橙 (Citrus
sinensis (Linn.) Osbeck cv. Gailiang Cheng)杂种后代
全部鉴定出来，并且获得了一个适用于沙田柚和红
江橙杂交后代鉴定分析的完全显性标记 P810。陈健
文等(2008)利用 30个 ISSR标记，对 10个杂交组合的
164个 BC2无性系的杂种真实性进行鉴定，结果表明
有 160个是真正的杂种，余下的 4个无性系不能确定
其杂种的真实性。此外，ISSR标记还曾用于鉴定杂交
稻种子(何霭如等, 2008)、西瓜(Citrullus lanatus)杂交
种(羊杏平等, 2010)以及杉木(Cunninghamia lanceolata)
杂交种(杨玉玲, 2006)的遗传纯度。由于园艺风信子
品种起源于同一个原种和三个变种亲缘关系较近，
染色体倍性变异丰富，有二倍体、三倍体、四倍体和
非整倍体存在，且高倍性的品种之间杂交更易获得
杂种后代(Brat, 1969)，因此，采用细胞学等方法进行
风信子品种间杂种后代鉴定较为困难。
本课题组采用 ISSR 分子标记方法对 29 个风
信子品种的亲缘关系和遗传多样性进行了研究(胡
凤荣等, 2015)，但尚未有风信子杂种后代鉴定的相关
报道。本研究利用 3条引物对风信子 3个杂交组合
(‘Ostara’בFondant’,‘Sky Jacket’בFondant’,‘White
Pearl’בBlue Jacket’) 的杂种后代进行 ISSR分子标
记研究，以鉴定各杂交组合杂种后代的真实性，期望
为风信子品种间大量杂种后代的快速鉴定及早期选
择提供理论依据和准确方法。
1结果与分析
利用 ISSR分子标记进行亲子代鉴定，需要在杂
种后代中检测到与双亲共同具有的位点和分别与亲
本之一共同具有的位点(索志立等, 2004)。本研究根据
UBC807、UBC815、UBC845等 3条引物对‘Ostara’×
‘Fondant’杂交组合的 13个 F1代扩增图谱统计(图 1)，
结果表明：‘Ostara’בFondant’杂交后代共检测到 173
个位点，其中子代与父母本共有位点检测到 103条；
子代与母本共有位点 2个，位点编号 UBC815-1400
在 4个子代中出现，位点编号 UBC845-500在 7个子
代中出现；子代与父本共有位点检测到 4个，其中位
点编号 UBC807-300 在 4、6 和 12 号 3 个子代中出
现，位点编号 UBC815-1500在 2号、6号、7号、12号
和 13号 6个子代中出现，位点编号 UBC815-450在
8号、9号、10号、12号和 13号 5个子代中出现，位点
编号 UBC845-1200 在 2 号、5 号、6 号、7 号、8 号和
10号 6个子代中出现(表 1)。
根据 UBC807、UBC815、UBC845等 3条引物对
‘Sky Jacket’בFondant’杂交组合 17个 F1代的扩增
图谱(图 2)，统计结果显示：共扩增出 278条谱带，其
中与父母本共有位点 220个，与母本共有位点 3个，
利用 ISSR分子标记方法鉴定风信子杂种后代
The Identification of the Hyacinth Hybrid Progeny by the Method of ISSR Molecular Marker 1337
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
图 2‘Sky Jacket’בFondant’杂交后代 ISSR扩增图谱
注: M: DL100 marker;斜方向箭头为杂交后代特异条带
Figure 2 Electrophoresis diagram of ISSR analysis of hybrid by
‘Sky Jacket’בFondant’
Note: M: DL100 marker; Arrow to the oblique direction repre-
sents female specific fragments
图 1‘Ostara’בFondant’杂交后代 ISSR扩增图谱
注: M: DL100 marker;正方向箭头为父本特异性条带,斜方向
箭头为杂交后代特异条带
Figure 1 Electrophoresis diagram of ISSR analysis of hybrid by
‘Ostara’בFondant’
Note: M: DL100 marker; Arrow to the forward direction repre-
sents male specific fragments, and arrow to the oblique direction
represents female specific fragments
表 1利用 3条 ISSR引物获得的杂交后代及其亲本的 DNA指纹图谱比较
Table 1 Comparison of DNA fingerprints of the hybrids and their parents based on ISSR-PCR by 3 primers
标记编码
Maker code
UBC807-300
UBC807-300
UBC807-1400
UBC807-500
UBC807-430
UBC807-900
UBC815-1500
UBC815-1400
UBC815-450
UBC845-1200
UBC845-500
UBC845-500
UBC845-600
UBC845-630
UBC845-700
UBC873-600
杂种后代个体数
No. of hybrid progeny
3
2
4
11
3
1
6
4
5
6
7
7
5
10
6
7
Ostara
-
-
Fondant
-
-
-
-
White Pearl
-
-
-
Blue Jacket
-
-
-
-
Sky Jacket
-
-
-
Ostara×Fondant
-
-
-
-
-
-
White Pearl×
Blue Jacket
-
-
-
-
-
-
-
Sky Jacket×
Fondant
-
-
-
分别在位点编号为 UBC807-300、UBC807-1400、
UBC845-500处出现，其中 UBC807-300在 2个子代
中表现，UBC807-1400 在 4 个子代中可检测到，
UBC845-500在7个子代中出现；在这个组合中没有
检测到与父本共有的位点(表 1)。
利用 UBC807、UBC845和 UBC873等 3条引物
对‘White Pearl’בBlue Jacket’杂交组合的 14个 F1代
进行 ISSR-PCR扩增(图 3)，统计结果显示：3条引物
共扩增出 132 条谱带，其中与父母本共有谱带为
28 条，与母本共有位点 3 个，位点编号分别为
UBC807-900、UBC807-430 和 UBC845-600，其中
UBC807-900位点在 1个子代出现，UBC807-430位
点在 3个子代中出现，UBC845-600在 5个子代中检
注:如编号为 UBC807-300则表示引物 UBC807PCR扩增产生分子量大约在 300 bp的 DNA片段
Note: For example numbers for UBC807-300 indicates primers UBC807 PCR amplification produce molecular weight about 300 bp
DNA fragment
1338
利用 ISSR分子标记方法鉴定风信子杂种后代
The Identification of the Hyacinth Hybrid Progeny by the Method of ISSR Molecular Marker
图 3‘White Pearl’בBlue Jacket’杂交后代 ISSR扩增图谱
注: M: DL100 marker;正方向箭头为父本特异性条带,斜方向
箭头为杂交后代特异条带
Figure 3 Electrophoresis diagram of ISSR analysis of hybrid by
‘White Pearl’בBlue Jacket’
Note: M: DL100 marker; Arrow to the forward direction repre-
sents male specific fragments, and arrow to the oblique direction
represents female specific fragments
表 2利用 3条 ISSR引物获得的杂交后代特异性 DNA指纹图谱比较
Table 2 Comparison of DNA fingerprints of the hybrids specificity based on ISSR-PCR by 3 primers
组合
Crossing
‘Ostara’בFondant’
‘Sky Jacket’בFondant’
‘White Pearl’בBlue Jacket’
标记编码
Maker code
UBC807-280
UBC815-300
UBC807-480
UBC807-280
UBC845-300
UBC845-200
UBC807-1100
UBC845-1500
UBC845-1400
UBC845-900
UBC873-1000
UBC873-800
UBC873-580
杂种后代个体数
Number of hybrid progeny
4
7
2
1
4
3
3
3
7
3
4
2
3
测到。子代与父本相同位点有 4 个，位点编号为
UBC807-500、UBC845-700、UBC845-630、UBC873-
600，位点UBC807-500在 11个子代中出现，只有 5号、
6号和 14号 3个子代没有检测到，位点UBC845-700
在 4号、7号、8号、10号、12和 13号 6个子代中表现，
位点 UBC845-600在 10个子代中表现，而在 8号、10
号、13号和 14号中没有检测到，位点 UBC873-600
在 2号、4号、7号、9号、10号、11号和 12号 7个子代
中出现(表 1)。
从 ISSR-PCR扩增图谱中可以看出，杂种后代出
现了特异性条带即产生了父母本都没有的条带。从表 2
中可以看出：‘Ostara’בFondant’杂交后代中UBC807、
UBC815两条引物扩增出特异性条带，其中编号为
UBC807-280的位点在 10号、11号、12号和 13号 4
个子代可以检测到，编号 UBC815-300的位点出现在
7号、8号、9号、10号、11号、12号和 13号 7个子代
中，UBC845这条引物则没有检测到特异性条带；在
‘Sky Jacket’בFondant’杂交后代中，检测到 4个特异
性位点，其中编号 UBC807-480特异位点在 5 号和
10号 2个子代可以检测到，编号 UBC807-280位点
在 12号 1个子代中检测到，位点编号为 UBC845-300
的位点在 8号、9号、13号和 16号 4个子代中表现，
位点编号为 UBC845-200 的位点在 8 号、9 号和 13
号 3个子代可以检测到。‘White Pearl’בBlue Jacket’
杂交后代中 UBC807、UBC845、UBC873等 3条引物
均扩增出特异性条带，其中位点编号为 UBC807-1100
特异性条带在 7号、8号和 10号 3个子代中出现，编
号为 UBC845-1500的位点在 3号、4号和 5号 3个
子代中出现，编号为 UBC845-1400的位点在 2号、3
号、5号、6号、7号、8号和 9号 7个子代中出现，编号
为 UBC845-900位点在 3号、8号和 11号 3个子代中
出现，编号UBC873-1000位点在 5号、6号、7号和 13
号 4个子代中出现，位点UBC873-800在 5号和 11号
2个子代中可检测到，位点UBC873-580在 2号、4号
和 14号 3个子代中出现。
通过上述分析可知，‘Ostara’בFondant’杂交后
代的 12个杂交后代为真实杂种，1个杂交后代为假杂
1339
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
种，真实杂种率为 92%；‘Sky Jacket’בFondant’杂交
组合中 7个杂交后代为真实杂种，10个杂交后代为
假杂种，真实杂种率为 41%，‘White Pearl’בBlue
Jacket’杂交组合中 14个杂交后代均鉴定为真实杂种，
真实杂种率为 100%。
2讨论
杂交可以继承父母本的优良性状或创造出新的
优良性状，丰富物种遗传多样性，拓宽生境，进而促
进基因组进化和物种进化(乔燕春等, 2010)。在风信
子杂种后代鉴定中，对于杂种后代的真实性鉴定十
分必要，这样在早期就可预测后代的性状更趋向母
本还是父本，进而可以确定杂种是否需要继续培育
和选择，以降低育种成本。本研究结果显示，在杂种
后代中不仅出现了与父本共有或与母本共有的条
带，还出现了父母本没有出现的条带。推测其原因可
能是由于亲本为高度杂合的品种，来源于不同长度
的等位核苷酸序列之间形成的异源双链体(胡晓宁,
2008)，形成了不同于亲代的遗传变异。
利用 ISSR技术对 3个杂交组合的杂种后代进
行早期鉴定，根据父本遗传信息是否遗传给后代，或
者后代中是否出现新带型，来断定 F1代是否为真杂
种。乔燕春等(2010)认为鉴定杂种是否为真实杂种主
要以出现父本的特征带为主，一旦出现杂种后代有
而双亲无的特征带，就可直接判断其为真实杂种。在
杂交组合‘Ostara’בFondant’中检测到子代与父本
共有 4个位点，特异性位点为 2个，共在 12个子代
中表现；‘Sky Jacket’בFondant’杂交组合中没有检
测到子代与父本共有条带，特异性位点检测到 4个，
共在 7 个子代中表现；‘White Pearl’בBlue Jacket’
杂交组合中子代与父本共有位点为 4个，特异性位
点为 7个，共表现在 14个子代中。本研究发现‘Sky
Jacket’בFondant’和‘Ostara’בFondant’的杂种后代
中出现了 F1代是假杂种的现象，推测其原因可能是
因为风信子是虫媒传粉植物，杂交是春季在大田内进
行的，此时小型昆虫较多干扰授粉致人工杂交混乱。
3材料与方法
3.1试验材料
以‘Sky Jacket’、‘Fondant’、‘Ostara’、‘White
Pearl’和‘Blue Jacket’等 5个风信子品种为材料，均
为购自北京碧溪花卉的荷兰进口优质风信子种球。
3.2试验试剂与仪器
琼脂糖、Taq DNA 聚合酶、dNTPs、Mg2+、10 ×
Buffer(Mg2+ Free)、ISSR 引物、DNA Marker (DL100)
均购于上海赛百盛生物公司。
PCR扩增仪(朗基MG96+)；DYY-Ⅲ型恒压恒流
电泳仪(北京六一仪器公司)；黑马凝胶成像系统(珠
海黑马医学仪器有限公司)。
3.3试验方法
3.3.1杂种后代的获得
以‘SkyJacket’、‘Fondant’、‘Ostara’、‘White Pearl’
和‘Blue Jacket’为亲本，配制 3个杂交组合，春季在田
间进行杂交授粉，通过胚拯救获得杂种后代组培苗。
3.3.2基因组 DNA的提取
采用简易 CTAB法提取 5个风信子品种及其杂
种后代组培苗叶片基因组 DNA (胡凤荣等, 2011)。
3.3.3风信子 ISSR-PCR反应体系
风信子 ISSR-PCR扩增程序采用 TD-PCR，扩增
体系为：20 μL的总反应体积，包括 10× Buffer 2 μL、
25 mmol/L Mg2+ 1.4 μL、2.5 mmol/L dNTPs 1.5 μL、
10 pmol/μL引物 1.5 μL，5 U/μL Taq聚合酶 0.2 μL，
30 ng/μL模板 1 μL，最后用双蒸水补足体积(胡凤荣
等, 2013)。扩增程序为：94℃预变性 5 min；梯度降温
扩增 Touch-down-PCR，94℃变性 40 s，54℃退火 45 s，
72℃延伸 90 s，3 个循环；94℃变性 40 s，52℃退火
45 s，72℃延伸 90 s，10个循环；94℃变性 40 s，51℃
退火 45 s，72℃延伸 90 s，20个循环；94℃变性 40 s，
50℃退火 45s，72℃延伸 90s，20个循环，72℃延伸 8min，
最后 4℃保存(胡凤荣等, 2013)。
3.3.4 ISSR-PCR引物
选用 UBC807、UBC815、UBC845等 3条引物对
‘Ostara’בFondant’杂交组合的 13 个 F1 代、‘Sky
Jacket’בFondant’杂交组合 17 个 F1 代、‘White
Pearl’בBlue Jacket’杂交组合的 14个 F1代进行 IS-
SR-PCR扩增。
作者贡献
何国仁和任翠是本研究的实验设计和实验研究
的执行人；任翠完成数据分析；王斐和任翠完成论文
初稿的写作；胡凤荣是项目的构思者及负责人，指导
实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都
阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由江苏省高校优势学科建设工程资助项
1340
目(PAPD)资助。
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Tree Genetics and Molecular Breeding (TGMB)
Tree Genetics and Molecular Breeding (ISSN 1927-5781) is an international, open
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breeding, particularly publishing innovative research findings in the basic and applied
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studies in tree genetics and molecular breeding, include studies in crop/fruit/forest/
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