全 文 ：研究报告
Research Report
山丹百合 cpDNA-PCR 反应体系建立与优化
蒋福娟 1,2 唐道城 1 唐楠 1*
1 青海大学高原花卉研究中心, 西宁, 810016; 2 大通县林业调查队, 大通, 810100
*通讯作者, natasha_tn@hotmail.com
摘 要 本试验以采自青海东南部地区的山丹百合为材料，结合单因素与 L16(45)正交设计对山丹百合
cpDNA-PCR 反应体系的 Mg2+、dNTPs、引物、Taq 酶和模板 DNA 浓度进行优化，建立最优的山丹百合
cpDNA-PCR 反应体系，为研究山丹百合遗传多样性及其演变提供技术支持。研究表明：在 25 μL 反应体
系中，以 Mg2+ 2.0 mmol/L、dNTPs 0.2 mmol/L、引物 0.2 μmol/L、Taq 酶 0.25 U、模板 DNA 50 ng 最佳，
退火温度优化后为 53.1℃。建立的反应体系在 6 个山丹百合居群中经验证具有较高的稳定性和重复性，可
用于山丹百合遗传多样性和分子谱系地理学方面的研究。
关键词 山丹百合, 叶绿体 DNA, 单因素试验, 正交设计试验
Construction and Optimization of cpDNA-PCR System for Lilium
Pumilum DC
Jiang Fujuan 1,2 Tang Daocheng 1 Tang Nan 1*
1 Plateau Flower Research Center of Qinghai University, Xining, 810016; 2 Datong Forestry Investigation Team, Datong, 810100
* Corresponding author, natasha_tn@hotmail.com
Abstract To obtain an optimal cpDNA-PCR system for Lilium pumilum DC., single-factor test and L16(45)
orthogonal test were used to 6 populations which collected from southeast region of Qinghai. Concentration of
Mg2+, dNTPs, primers, Taq polymerase and DNA template were screened at four levels. As a result, the best
cpDNA-PCR amplification system for Lilium pumilum was Mg2+ 2 mmol/L, dNTPs 0.2 mmol/L, Primer 0.2
μmol/L, Taq polymerase 0.25 U, and DNA template 50 ng in a 25 μL reaction system. Annealing temperature was
53.1℃. The optimized cpDNA-PCR system was validated on 6 populations, by which the high tability and
repeatability of this system was confirmed. The establishment of the reaction conditions could be further used in
study of genetic diversity and phylogeography of Lilium pumilum DC.
Keywords Lilium pumilum, cpDNA, Single factor tests, Orthogonal design
山丹百合(Lilium pumilum DC)为百合科百合属卷丹组中的一个种，在世界各地广泛分布。青海境内分
布的百合属植物有山丹百合和假百合 2 种(刘尚武, 1999)，其中山丹百合是青海高原地区百合属植物唯一野
网络出版时间：2016-09-01 16:14:30
网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20160901.1614.002.html
生种，主要分布在青海省东南部海拔 1 900.0 m~3 800.0 m 干旱向阳的山坡草地、林缘及林间沟谷(Tang et al.,
2014)。耐寒耐旱，喜凉爽的气候环境和疏松、肥沃、排水良好的土壤。野生种一般株高 5.0 cm~50.0 cm，
在适宜气候和肥沃的土壤环境下栽培，株高可达到 80.0 cm 以上。鳞茎较小，周径约 3.0 cm~10.0 cm，生
长速度极慢；鳞片白色，肥厚，富含淀粉、纤维素、维生素及花色苷等多种营养成分，具有较高的营养价
值，可用于食用和药用；叶纤细且多互生，花瓣反卷，花色鲜红色，具有较高的观赏价值。
cpDNA 在高等植物中以双链闭环 DNA 的形式存在，一般为 120 kb~220 kb，由大单拷贝区和小单拷贝
区两个反向重复序列组成。cpDNA 基因保守，具有分子量小、结构简单和单亲遗传的特点，由于具有独立
的进化历史，cpDNA 基因成为植物分子进化、分子系统学和分子地理学研究的热点之一。许多研究表明众
多物种在种内居群间和居群内个体间都存在 cpDNA 变异(Taberlet et al., 1991)，且 cpDNA 非编码序列的核
苷酸置换率较高，形态多样，能够较好的表现种间和种内遗传的变异情况，为系统发育的研究提供相关的
信息位点(Small et al., 2005)。目前已在中国菊属(赵惠恩等, 2003)、中国枣属(李学营, 2005)、陆均松(苏应娟
等, 2005)、西藏沙棘(刘腾靓, 2009)、建兰(李亚, 2013)、蕙兰(龚黄莎, 2013)、野生寒兰(张威, 2014)等物种
的系统发育研究上广泛应用。
本实验以采自青海东南部的山丹百合为试验材料，采用单因素试验和正交设计试验相结合，正交设计
验证单因素试验的方法，优化山丹百合 cpDNA-PCR 反应体系的主要影响因子，建立山丹百合 cpDNA-PCR
扩增的最佳反应体系，有利于开展高原地区山丹百合遗传多样性和分子谱系地理学研究。
1 结果与分析
1.1 DNA 纯度与浓度
百合叶片中含有较多的多糖、酚类等次生代谢产物，易与核酸形成复合物影响 DNA 的溶解度或产生
褐变，进而影响 DNA 的质量(姜福星, 2006)。本研究中山丹百合 DNA 使用改良 CTAB 法提取，研磨叶片
时在研钵中加入少量 PVP 干粉，以减少 DNA 氧化，并在 CTAB 提取介质中加入 2%的 β-巯基乙醇来提高
DNA 浓度和质量，经核酸蛋白仪和 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测(表 1)，OD 值及 DNA 明亮程度能够满足
cpDNA-PCR 扩增要求(刘紫英和袁斌, 2009)。
表 1 DNA 纯度和浓度
Table 1 The concentration and purity of DNA
编号
No.
DNA 样品
DNA sample
OD 值
OD value
浓度(ng/μL)
Concentration (ng/μL)
1 MD 1.924 885
2 YL 1.867 420
3 JSG 2.061 1 525
4 YQ 1.985 1 935
5 BS 1.842 350
6 XBS 1.952 410
1.2 引物初筛
本试验首先用 psbA/trnH、trnL/trnF、petB/petD 三对引物进行 PCR 扩增，最后只有 petB/petD 能扩增
出清晰、明亮且单一的条带(图 1)，故选用这对引物进行 cpDNA-PCR 反应体系的优化试验。

图 1 6 个居群山丹百合 cpDNA-PCR 电泳检测
注: M: DL2000 DNA marker; 1-6: 6 个山丹百合居群(MD, YL, JSG, YQ, BS, XBS); 1, 2, 3 相同数字为重复
Figure 1 Electrophoresis for cpDNA-PCR of 6 Lilium pumilum population
Note: M: DL2000 DNA marker; 1-6: 6 Lilium pumilum population (MD, YL, JSG, YQ, BS, XBS); replications of same numbers
1.3 影响 cpDNA-PCR 扩增因子的单因素筛选
1.3.1 Mg2+浓度对山丹百合 cpDNA-PCR 反应的影响
试验表明，Mg2+浓度在 1.0 mmol/L 时，条带不稳定且出现非特异性扩增，即 Mg2+浓度偏低，使反应
产物减少；Mg2+浓度在 2.5 mmol/L 时，条带清晰但出现大量引物二聚体，即 Mg2+浓度过高，使反应特异
性降低(邓明文等, 2007)。Mg2+浓度为 2.0 mmol/L 时(图 2)，条带清晰单一且稳定，故为最佳水平。

图 2 Mg2+浓度对 cpDNA-PCR 的影响
注: M: DL2000 DNA marker; 1-4: Mg2+浓度依次为 1 mmol/L, 1.5 mmol/L, 2 mmol/L, 2.5 mmol/L
Figure 2 Effects of Mg2+ concentrations on cpDNA-PCR
Note: M: DL2000 DNA marker; 1-4: Mg2+ concentrations were 1 mmol/L, 1.5 mmol/L, 2 mmol/L, 2.5 mmol/L
1.3.2 dNTPs 浓度对山丹百合 cpDNA-PCR 反应的影响
设 dNTPs 浓度 0.05 mmol/L、0.1 mmol/L、0.15 mmol/L、0.2 mmol/L 四个水平，当 dNTPs 浓度为 0.05
mmol/L 和 0.15 mmol/L 时，条带的稳定性及重复性较差；当 dNTPs 浓度为 0.1 mmol/L 时，条带稳定但是
不够清晰，即浓度过低降低了 PCR 产物的产量，当 dNTPs 浓度为 0.2 mmol/L 时条带稳定且最清晰(图 3)。

图 3 dNTPs 浓度对 cpDNA-PCR 的影响
注: M: DL2000 DNA marker; 1-4: dNTPs 浓度依次为 0.05 mmol/L, 0.1 mmol/L, 0.15 mmol/L, 0.2 mmol/L
Figure 3 Effects of dNTPs concentrations on cpDNA-PCR
Note: M: DL2000 DNA marker; 1-4: dNTPs concentrations were 0.05 mmol/L, 0.1 mmol/L, 0.15 mmol/L, 0.2 mmol/L
1.3.3 Primer 浓度对山丹百合的影响
不同引物浓度下，cpDNA-PCR 反应均能扩增出单一条带(图 4)，而随着浓度的增加，条带由深变浅，
逐渐模糊，二聚体越来越明显，选用 0.2 μmol/L 时，条带清晰可辨，且引物二聚体少。

图 4 引物浓度对 cpDNA-PCR 的影响
注: M: DL2000 DNA marker; 1-4: 引物浓度依次为 0.2 μmol/L, 0.3 μmol/L, 0.4 μmol/L, 0.5 μmol/L
Figure 4 Effects of primer concentrations on cpDNA-PCR
Note: M: DL2000 DNA marker; 1-4: primer concentrations were 0.2 μmol/L, 0.3 μmol/L, 0.4 μmol/L, 0.5 μmol/L
1.3.4 Taq DNA polymerase 用量对山丹百合 cpDNA-PCR 反应的影响
根据 Taq 酶含量在 0.25 U、0.5 U、0.75 U、1.0 U 四个梯度的变化可知(图 5)，Taq 酶含量对山丹百合
cpDNA-PCR 反应的影响较小。但是，Taq 酶含量增多时，易产生非特异性扩增且增加试验成本，故选用
0.25 U Taq 酶含量最佳。

图 5 Taq 酶含量对 cpDNA-PCR 的影响
注: M: DL2000 DNA marker; 1-4: Taq 酶含量依次为 0.25 U, 0.5 U, 0.75 U, 1.0 U
Figure 5 Effects of Taq polymerase contents on cpDNA-PCR
Note: M: DL2000 DNA marker; 1-4: Taq polymerase contents were 0.25 U, 0.5 U, 0.75 U, 1.0 U
1.3.5 Template DNA 浓度对山丹百合 cpDNA-PCR 反应的影响
四个浓度梯度扩增出的条带由浅至深，浓度下降，亮度减弱，浓度增加，亮度也随之增强，当 DNA
浓度为 50 ng 时，条带最稳定最整齐，引物二聚体最少(图 6)。

图 6 模板 DNA 浓度对 cpDNA-PCR 的影响
注: M: DL2000 DNA marker; 1-4: 模板 DNA 浓度依次为 5 ng, 20 ng, 50 ng, 100 ng
Figure 6 Effects of Template DNA concentrations on cpDNA-PCR
Note: M: DL2000 DNA marker; 1-4: Template DNA concentrations were 5 ng, 20 ng, 50 ng, 100 ng
1.4 影响 cpDNA-PCR 扩增因子的正交优化
以 JSG 居群 DNA 为模板，petB/petD 为引物，按照 L16(45)正交设计进行 PCR 扩增，16 个组合均扩增
出条带(图 7)，并对扩增情况从高到低依次打分(何正文等, 1998)，条带单一且清晰度高的组合记为 16 分，
条带最差的记为 1 分，依次类推，从 16 分记到 1 分。其中组合 12 得分最高，条带清晰单一，几乎没有引
物二聚体。

图 7 山丹百合 cpDNA-PCR 反应体系正交优化
注: M: DL2000 DNA marker; 1-16: L16(45)正交试验设计中的 16 个组合
Figure 7 orthogonal optimation of cpDNA-PCR reaction system for Lilium pumilum
Note: M: DL2000 DNA marker; 1-16: 16 combinations in orthogonal design L16(45)
根据评分并依据穆立蔷等(2006)的极差分析法，计算出各因素相同条件下的试验值之和(Ki)、各因素条
件下的数据平均值 (ki)和相同因素不同条件下平均值的极差值 (R)。各因素水平的变化对山丹百合
cpDNA-PCR 反应的影响依次为(表 2)：模板 DNA (R=8.5)>Mg2+ (R=6.75)>dNTPs (R=5.75)>Taq 酶(R=1.5)>
引物(R=0.75)，模板 DNA、Mg2+、dNTPs 对反应体系影响较大，而 Taq 酶和引物对反应体系影响较小。
根据 ki 越大，反应水平越好，得出正交优化的最佳反应体系为 Mg2+ 2.0 mmol/L，dNTPs 0.1 mmol/L，引物
0.2 μmol/L 或 0.3 μmol/L，Taq 酶 0.25 U，模板 DNA 50 ng，极差分析与打分评价的最佳反应体系(12 号)相
近，仅 dNTPs 的用量有较小差异。
表 2 正交试验极差分析
Table 2 Range analysis of orthogonal test
参数
Parameter
Mg2+ (mmol/L) dNTPs (mmol/L) 引物(μmol/L)
Primer (μmol/L)
Taq 酶(U)
Taq polymerase (U)
模板 DNA (ng)
Template DNA (ng)
K1 38 20 35 37 14
K2 33 43 35 35 33
K3 46 39 32 31 48
K4 19 34 34 33 41
k1 9.5 5 8.75 9.25 3.5
k2 8.25 10.75 8.75 8.75 8.25
k3 11.5 9.75 8 7.75 12
k4 4.75 8.5 8.5 8.25 10.25
R 6.75 5.75 0.75 1.5 8.5
1.5 山丹百合 cpDNA-PCR 最优反应体系的确定
单因素筛选试验与正交优化得出的体系基本一致，根据极差 R 值可知引物浓度在 0.2 μmol/L 或 0.3
μmol/L 时对体系的影响程度最大，而且一致。考虑到引物量大会增加引物二聚体的数量，故得出
cpDNA-PCR 的最优反应体系：在 25 μL 的反应体系中，各因素水平的组成为 Mg2+ 2.0 mmol/L、dNTPs 0.2
mmol/L、引物 0.2 μmol/L、Taq 酶 0.25 U、模板 DNA 50 ng。
1.6 退火温度的确定
以 petB/petD 为引物，根据梯度 PCR 仪自动生成的 8 个温度梯度进行退火温度筛选。试验表明，退火
温度大于 63.0℃几乎没有扩增产物，在超过 56.6℃时非特异性扩增条带明显，而在 46.6℃~56.6℃时均可扩
增出清晰条带(图 8)，本试验选择 53.1℃作为引物 petB/petD 的最佳退火温度，可以有效保证扩增产物和引
物二聚体及非特异性产物的干扰。


图 8 petB/petD 退火温度对 cpDNA-PCR 扩增的影响
注: M: DL2000 DNA marker; A: 1-8: 退火温度分别为 59.8℃, 59.2℃, 58.1℃, 56.6℃, 54.6℃, 53.1℃, 52.1℃, 51.6℃; B: 1-8: 退
火温度分别为 56.6℃, 55.8℃, 54.5℃, 52.6℃, 50.2℃, 48.5℃, 47.3℃, 46.6℃
Figure 8 Effects of annealing temperature on cpDNA-PCR amplification by primer petB/petD
Note: M: DL2000 DNA marker; A: 1-8: Annealing temperatures were 59.8℃, 59.2℃, 58.1℃, 56.6℃, 54.6℃, 53.1℃, 52.1℃,
51.6℃; B: 1-8: Annealing temperatures were 56.6℃, 55.8℃, 54.5℃, 52.6℃, 50.2℃, 48.5℃, 47.3℃, 46.6℃
1.7 山丹百合 cpDNA-PCR 反应体系验证
根据建立的最佳反应体系，从 10 条引物中筛选出 PCR 扩增产物单一、清晰、明亮、稳定的二对引物(图
9)，即 1 号 psbA/trnH 和 2 号 petB/petD，可用于山丹百合 cpDNA-PCR 扩增。利用选出的二条引物建立的
最优反应体系，对 6 个居群山丹百合的 DNA 进行扩增，并检测优化体系、反应参数稳定性。引物 psbA/trnH
和 petB/petD 在 6 个山丹百合居群中都能扩增出清晰、稳定的条带，证明建立的山丹百合 cpDNA-PCR 反
应体系稳定可靠(图 10)。

图 9 各引物 PCR 扩增产物电泳
注: M: DL2000 DNA marker; 1-10: 10 对引物组合
Figure 1 Electrophoretogram for PCR amplification products of each primer
Note: M: DL2000 DNA marker; 1-10: 10 pairs of primer combinations


图 10 引物 petB/petD 和 psbA/trnH 对 6 个山丹百合 DNA 的 cpDNA-PCR 扩增
注: M: DL2000 DNA marker; 1-6: 6 个山丹百合居群(MD, YL, JSG, YQ, BS, XBS)
Figure 8 Amplification of template DNA of 6 Lilium pumilum by primer petB/petD and psbA/trnH
Note: M: DL2000 DNA marker; 1-6: 6 Lilium pumilum population (MD, YL, JSG, YQ, BS, XBS)
2 讨论
cpDNA (chloroplast DNA)分子标记是基于 PCR 反应的技术，具有多拷贝、单亲遗传、高度保守和多个
信息位点的特点，被广泛应用于植物类群系统与进化研究。cpDNA-PCR 反应受众多因素影响，对各种因
素优化期望获得最佳反应体系具有十分重要的意义。由于试验是通过查看条带是否单一，凝胶电泳条带是
否明晰、状态是否稳定来得出结论，没有统一的判断标准，缺乏足够的客观度，故需要多次试验以减低主
观性，使结论具有说服力。
为了建立山丹百合 cpDNA-PCR 反应体系，本研究采用正交优化和单因素筛选相结合的方法，尽管两
种方法单独应用各有其优势和不足，但仍为目前应用最广泛的方法(骆建霞和孙建设 , 2002)。2 种方法得
到的最佳反应体系并不完全吻合，引物浓度出现了 2个最佳水平，这与对扩增情况的直观判定和试验中PCR
反应的不稳定性有关，也与单因素筛选容易忽略互作效应和正交试验可能出现的主效及互作效应的丢失有
关。将 2 种方法结合起来综合判断得到的最优反应体系可以提高试验的精确度，既克服了单因素试验中对
交互作用的忽略，也能较为精确地估计主效和互作。获得的最优反应体系即在 25 μL 中，Mg2+ 2.0 mmol/L、
dNTPs 0.2 mmol/L、引物 0.2 μmol/L、Taq 酶 0.25 U、模板 DNA 50 ng；PCR 反应程序除退火温度为 53.1℃
外，其余部分与江西建兰(李亚, 2013)完全一致。利用优化体系筛选出适合山丹百合 cpDNA-PCR 扩增的引
物 2 对和退火温度为 53.1℃，扩增稳定，反应的特异性明显。在引物初筛时，psbA/trnH 和 trnL/trnF 引物
没有扩增出单一条带，这可能与引物对退火温度的特异性要求有关，这与伯乐树(胡尚力等, 2013)的研究结
论一致。因此针对不同植物材料和使用不同引物时，为了确定最佳引物和最佳退火温度，进行温度梯度退
火试验十分必要。
试验中，如何克服和减少单因素和正交试验中引物二聚体和非特异性扩增产物的出现，成了一大难题。
首先要在单因素筛选试验中选取各个因子适宜的浓度，尤其是通过降低引物浓度控制产物中形成引物二聚
体的机会十分必要；此外还要考虑正交优化中各个因子之间的互作效益，每个因子浓度的变化可能与其它
因子产生互作，各个试验条件之间存在相互影响；退火温度也是影响试验中引物二聚体和非特异性扩增产
物出现的重要因素，退火温度低，扩增产物的产量高，但引物二聚体和非特异性产物也随之增多，退火温
度高，PCR 产物量少，但扩增产物的特异性增强(陈万胜等, 2008)，因此选择一个合适的退火温度对试验结
论至关重要。
本研究由正交试验和极差分析可知，各因素水平的变化会影响山丹百合的 cpDNA-PCR 反应，程度依
次为：Template DNA (R=8.5)>Mg2+ (R=6.75)>dNTPs (R=5.75)>Taq polymerase (R=1.5)>Primer (R=0.75)。这
表明在山丹百合 cpDNA-PCR 反应体系中 Template DNA 浓度是影响反应的主要因素，其次是 Mg2+浓度，
Taq polymerase 和 Primer 对反应的影响不大，均值差异不明显，这与单因素试验分析基本一致，二者在各
水平间均能扩增出条带，对比无明显差异，这与其它植物 cpDNA-PCR 反应的研究结论不同，如郁金香(巨
秀婷和阿啟兰 , 2016)、珙桐(张玉梅等, 2011)、伯乐树(胡尚力等, 2013)、观光木(何长青等, 2014)，说明试
验结论与实验材料有关。本研究通过建立山丹百合最优 cpDNA-PCR 反应体系，为研究山丹百合 cpDNA
分子标记，纯化回收其后续扩增产物，克隆载体和测序提供了理论依据，为开展山丹百合分子谱系地理学
的深入研究提供了帮助。
3 材料与方法
3.1 试验材料与试剂
本研究以居群方法对山丹百合进行取样，在青海省东南部地区采集 6 个居群(MD, YL, JSG, YQ, BS,
XBS)的山丹百合(表 3)，各居群间隔至少 1 km。采样居群中心位置采用 GPS 全球卫星定位系统定位。采集
不同居群山丹百合嫩叶为试验材料，用去离子水冲洗，再用 70%乙醇的棉球擦洗干净，编号并贴好标签后
放入离心管中，立即放入液氮罐，带回后于超低温冰箱中长期保存。Taq 酶(Mg2+free)、dNTPs、Mg2+、10×PCR
Buffer 及 DNA Marker 均购自宝信生物公司，cpDNA 引物由上海生工公司合成。
表 3 采样地的地理位置和生态因子 1
Table 3 The geographical position and ecological factors of sampling localities 2
居群 P①
Population
海拔
Altitude (m)
经度
Longitude (E)
纬度
Latitude (N)
年均降
MAP
② (mm)
年均
MAT② (℃ )
年日照时
AST
② (h)
坡向 /坡
SDt/SD
② (°)
植被类
PF
②

地理位置
Location
MD 2 036 102°38′59.0″ 35°49′20.6″ 370 5.5 2 003 东 75
East 75
灌草
Shrub-grass
海东地区
Haidon area
YL 2 798 101°59′58.9″ 35°29′47.2″ 427 3.2 2 693 西 75
West 75
灌草
Shrub-grass
黄南地区
Huangnan area
JSG 2 821 102°04′30.6″ 36°02′42.8″ 470 2.2 2 602.6 东 75
East 75
灌草
Shrub-grass
海东地区
Haidon area
YQ 2 206 101°58′13.5″ 35°56′50.0″ 280 5.0 2 376 南 60
South 60
草丛
Herbosa
黄南地区
Huangnan area
BS 2 647 102°46′49.1″ 36°22′34.7″ 310 6.6 2 220 东南 60
Southeast 60
草丛
Herbosa
海东地区
Haidon area
XBS 2 761 101°57′40.8″ 35°21′35.1″ 406 3.3 2 646 西南 30
Southwest 30
灌草
Shrub-grass
黄南地区
Huangnan area
注: ①MD为循化县孟达乡, YL 为同仁县牙浪乡, JSG为化隆县沙连堡乡介什古, YQ为尖扎县要其乡, BS为民和县北山乡, XBS为同仁县西卜沙乡; ②由各地气象部门提供, MAP: The 3
mean of annual precipitation, MAT: The mean of annual temperature, AST: Annual suntime, SDt: Slope direction, SD: Slope degree, PF: Plants form 4
Note: ①MD is Mengda township, Xunhua County, YL is Yalang township, Tongren County, JSG is Jieshengu of Shalianbao township, Hualong County, YQ is Yaoqi township, Jianzha County, 5
BS is Beishan township, Minhe County, XBS is Xibusha township, Tongren County; ②Provided by the local Meteorological Department, MAP: The mean of annual precipitation, MAT: The 6
mean of annual temperature, AST: Annual suntime, SDt: Slope direction, SD: Slope degree, PF: Plants form 7
3.2 试验方法 8
3.2.1 提取和检测叶片基因组 DNA 9
取植株的健康嫩叶，使用改良 CTAB 法(陈名红等, 2013, 江苏农业科学, 41(3): 27-29)提取山丹百合10
基因组 DNA。DNA 的质量用 1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，其纯度和浓度通过核酸蛋白检测仪来检测，将11
DNA 的浓度稀释为 5 ng/μL 、20 ng/μL 、50 ng/μL、100 ng/μL。 12
3.2.2 引物初筛 13
以居群 JSG 的 DNA 为模板，参考江西建兰(李亚, 2013) cpDNA-PCR 反应方法，首先确定基本扩增反14
应体系(25 μL)为：2.0 mmol/L Mg2+ 2.0 μL、0.2 mmol/L dNTPs 0.5 μL、10 μmol/L Primer 各 1.0 μL、1.25 U Taq 15
polymerase 0.25 μL、50 ng DNA 模板 1.5 μL、10×PCR Buffer 2.5 μL，不足 25 μL 的用灭菌 ddH2O 补齐。PCR16
反应过程为 94℃预变性 5 min 后，进入 35 个循环：包括 94℃变性 45 s，53.5℃退火 45 s，72℃延伸 1 min。17
随后 72℃终延伸 10 min，-4℃存储备用。然后采用 25 μL 反应体系和反应程序进行引物的初步筛选。随机18
选取三对引物组合 psbA/trnH、trnL/trnF 和 petB/petD，从中选出一个条带清晰单一的引物(petB/petD)用于19
体系优化试验(表 4)。 20
表 4 试验所用引物序列 21
Table 4 Primers used in this study 22
编号
Number
引物
Primer
序列(5’-3’)
Sequence (5’-3’)
1 psbA
trnH
GTTATGCATGAACGTAATGCTC
CGCGCATGGTGGATTCACAATCC
3 petB
petD
CTGCCGTATTTATGTTAATG
GTCTAGCCCCTGTTCTTCCT
2 trnL
trnF
CGAAATCGGTAGACGCTACG
ATTTGAACTGGTGACACGAG
4 PipetB1411F
PipetD738R
GCCGTMTTTATGTTAATGC
AATTTAGCYCTTAATACAGG
5 rpl32
trnL
CAGTTCCAAAAAAACGTACTTC
CTGCTTCCTAAGAGCAGCGT
6 psbJ
petA
ATAGGTACTGTARCYGGTATT
AACARTTYGARAAGGTTCAATT
7 rps16
trnK
AAAGTGGGTTTTTATGATCC
TTAAAAGCCGAGTACTCTACC
8 atpI
atpH
TATTTACAAGYGGTATTCAAGCT
CCAAYCCAGCAGCAATAAC
9 petL
psbE
AGTAGAAAACCGAAATAACTAGTTA
TATCGAATACTGGTAATAATATCAGC
10 atpB-49
rbcL-188
TTTCAAGCGTGGAAACCCCA
TACAGTTGTCCATGTACCAG
3.2.3 cpDNA-PCR 扩增单因素试验设计 23
依据建兰 cpDNA-PCR 反应方法(李亚, 2013)，以居群 JSG 的 DNA 为材料，分别对 Mg2+ 浓度、dNTPs24
浓度 、Taq polymerase 含量、Primer 浓度和 DNA 模板浓度 5 个因素设置 4 个水平梯度参数(表 5)，进行优25
化试验，每个处理做 3 个重复。PCR 产物用 1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测并拍照分析。DNA 模板为居群26
JSG。 27
表 5 cpDNA-PCR 反应体系的各因素浓度梯度优化设计 28
Table 5 Optimization of the cpDNA-PCR system parameters 29
编号
No.
Mg2+ (mmol/L) dNTPs (mmol/L) 引物(μmol/L)
Primer (μmol/L)
Taq 酶(U)
Taq polymerase (U)
模板 DNA (ng)
Template DNA (ng)
1 1 0.05 0.2 0.25 5
2 1.5 0.1 0.3 0.5 20
3 2 0.15 0.4 0.75 50
4 2.5 0.2 0.5 1 100
3.2.4 cpDNA-PCR 反应体系正交试验设计 30
以居群 JSG 的 DNA 为材料，利用引物组合 petB/petD，根据 L16(45)正交设计(表 6)完成 5 因素 4 水平31
共 16 个组合反应体系的 PCR 扩增，每个体系中都包含 10×PCR Buffer 2.5 μL，筛选最佳组合。 32
表 6 L16(45)正交试验设计 33
Table 6 The L16(45) orthogonal design 34
编号
No.
Mg2+ (mmol/L) dNTPs (mmol/L) 引物(μmol/L)
Primer (μmol/L)
Taq 酶(U)
Taq polymerase (U)
模板 DNA (ng)
Template DNA (ng)
1 1 0.05 0.2 0.25 5
2 1 0.1 0.3 0.5 20
3 1 0.15 0.4 0.75 50
4 1 0.2 0.5 1 100
5 1.5 0.05 0.3 0.75 100
6 1.5 0.1 0.2 1 50
7 1.5 0.15 0.5 0.25 20
8 1.5 0.2 0.4 0.5 5
9 2 0.05 0.4 1 20
10 2 0.1 0.5 0.75 5
11 2 0.15 0.2 0.5 100
12 2 0.2 0.3 0.25 50
13 2.5 0.05 0.5 0.5 50
14 2.5 0.1 0.4 0.25 100
15 2.5 0.15 0.3 1 5
16 2.5 0.2 0.2 0.75 20
3.2.5 退火温度的优化 35
首先根据引物 petB/petD的两个Tm值(59.8℃和 51.6℃)，先设定最高温度为 59.8℃，最低温度为 51.6℃，36
而后用 Tm 计算出的理论退火温度(理论退火温度=Tm-5℃)，以 Tm 值为中心设定梯度试验进行验证(56.6℃37
~46.6℃)，最终确定该引物的最佳退火温度。设置最高最低温度后 PCR 仪程序自动生成 8 个温度梯度，每38
个温度处理做 3 个重复。 39
3.2.6 反应体系的验证 40
利用优化的 PCR 反应体系，对 10 对 cpDNA 通用引物(表 4)进行筛选。并用筛选出的引物对 6 个居群41
(MD, YL, JSG, YQ, BS, XBS) DNA 进行扩增，验证反应体系。 42
作者贡献 43
蒋福娟是本研究的实验设计和实验研究的执行人，完成数据分析和论文初稿的写作；唐道城参与项目44
的构思；唐楠是项目的的构思者及负责人，指导实验设计、数据分析和论文的写作与修改。全体作者都阅45
读并同意最终的文本。 46
致谢 47
本研究由青海东南部山丹百合资源遗传多样性及遗传结构(2013-07)和青海省园林植物研究重点实验48
室发展专项(2015-Z-Y17)共同资助。 49
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