全 文 ：西北农业学报　2008 , 17(3):285-289
Acta A griculturae Boreali-occidentalis Sinica
秦巴山区野生山丹百合 DNA提取与 RAPD反应体系建立＊
钟海丰 ,张延龙＊ ,牛立新
(西北农林科技大学园艺学院 ,陕西杨凌　712100)
摘　要:以秦巴山区野生山丹百合幼嫩叶片为材料 ,采用常规 CTAB 法提取百合基因组 DNA , 得到的 DNA
基本能满足 RAPD-PCR分析。通过单因素逐一递进优化 , 得到在 20 μL 的 PCR反应体系中 , 野生山丹百合
RAPD分析的最佳反应体系为:40 ng的模板 DNA , 0.4 μmo l/ L 随机引物 , 2.25 mmol/ L Mg 2+ , 0.2 mmol/ L
dNTPs , Taq DNA 聚合酶 1.5U , 1×buffe r缓冲液 , ddH2O 补足 20μL 。 RAPD 扩增反应程序为:94℃预变性
4 min , 94℃ 30 s , 37℃ 45 s , 72℃ 90 s , 35 个循环 ,最后 72℃ 10 min , 4℃保存 。该反应体系具有较好的稳定性
及可重复性。
关键词:秦巴山区;山丹百合;DNA 提取;RAPD反应体系建立
中图分类号:Q785　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1004-1389(2008)03-0285-05
A Study on DNA Extraction and Establishment of RAPD
Reaction System in Lilium pumilum DC.
Fisch from Qinba Mountainous Area
ZHONG Hai-feng , ZH ANG Yan-long＊ and NIU Li-xin1
(Col lege of Hort icu ltu re , Northw es t A &F Universi ty , Yan gling S hannxi　712100 , China)
Abstract:The materials for the DNA ex traction w hich used the method of CTAB were some sample s
of leaves w hich taken from Li l ium pum ilum DC.Fisch that came from the Qinba mountainous area.
And the optimized reaction system and prog ram of RAPD for w ere as fo llow s.The reactions w ere per-
fo rmed in a volume o f 20μL , which containing 40ng DN A template , 0.4μmoL random primer , 2.25
mmo l/ L Mg 2+ , 0.2 mmo l/L dN TPs , 1.5U Taq DNA po lymerase , 1×buf fer so lution.T he RAPD re-
action w as prog rammed by 1 cycle for 4min at 94℃, fol lowed by 35 cycles fo r 30 s at 94℃, 45 s at
37℃, and 90 s at 72℃ and finally , by 1 cycle fo r 10 min at 72℃, storing at 4℃.The reaction sy stem
w as w ell reproducible and highly reliable , and i t could be ef fectively fo r RAPD analy sis in Li l ium
pumilum DC.Fisch.
Key words:Qinba mountainous area;Li lium pumilum DC.Fisch;DNA ex tract ion;T he establish-
ment o f the RAPD reaction sy stem
　　百合(Lil ium spp.)是单子叶植物亚纲百合
科(Liliaceae)百合属的所有种类的总称 ,全世界
约有 90多种 ,中国是世界百合的起源中心。据调
查 ,中国拥有约 46种 18个变种 ,占世界百合总数
的一半以上 ,其中 36 种 15 个变种是中国特有
种[ 1-2] ,但是目前我国种植的百合多数是从国外引
进的 。而国内现有的百合资源尚未得到充分的利
用 ,而且破坏和流失现象十分严重。要改变这种
＊收稿日期:2007-11-09　　修回日期:2007-12-10
基金项目:国家自然科学基金(30571523).
作者简介:钟海丰(1982-), 男, 畲族 , 在读硕士 , 研究方向:野生百合种质资源研究。E-mai l:haifeng915@gm ail.com.
＊通讯作者:张延龙 , 女 , 陕西延安人 , 硕士 , 教授。主要从事百合种质资源的研究以及主要球根花卉新品种选育与种球
发育生理的研究。 E-mai l:z zll22@126.com
落后状况必须充分发挥我国丰富的百合资源优
势 ,综合应用几种检测方法全面了解现有百合资
源的遗传多样性 ,以更好地开发保护和利用我国
的百合资源。随机扩增多态性 DNA(randomam-
plified po lymo rphic DNA , RA PD)技术是由Wil-
liams J G K 等于 1990年首先创立的一种 DNA
分子标记技术[ 3] ,因其具有操作简便快捷 、灵敏度
高 、通用性好且无需预先了解物种基因组信息等
优点[ 4-6] 而被广泛应用于种质资源[ 7-8]和亲缘关系
分析[ 8-11] 方面 ,尤其在对遗传背景所知甚少的物
种上具有特殊优势 。但同时 , RAPD对实验条件
敏感 ,稳定性较差[ 12-13] ,使得不同研究者的研究结
果难以比较 , RAPD-PCR的稳定性是阻碍 RAPD
被广泛应用的关键问题。因此 ,建立一个稳定性
好 、可重复性高的适合百合野生种的 RAPD-PCR
体系对于 RAPD 分析在野生百合中的应用至关
重要 。本试验以秦巴山区野生山丹百合为材料 ,
探讨适合于秦巴山区百合野生种的 RAPD-PCR
反应的最佳体系 ,从而为分析秦巴山区几个百合
野生种的种间亲缘关系及种内不同居群的遗传多
样性提供保障。
1　材料与方法
1.1　材料
采自秦巴山区野生山丹百合种球 ,栽种于西
北农林科技大学园艺场花卉实验基地 ,待萌芽 ,采
幼嫩叶片 ,置冰盒中带回实验室超低温冰箱中保
存备用。
1.2　试剂
Taq DNA 聚合酶 、引物 、dN TPs 、DL 2000
Marker 、琼脂糖等均购自沃尔森生物技术有限公
司。氯仿 、异戊醇 、无水乙醇 、EDTA 、β-巯基乙醇
等均为国产分析纯试剂。
1.3　主要仪器
PCR仪为 Eppendporf 5331 梯度 PCR 仪;
DYY-11型电泳仪购自北京市六一仪器厂;UV-
1700分光光度计;凝胶成像仪为 CUM20 Synop-
tics L.t.d.。
1.4　方 法
1.4.1 　百合基因组 DNA 的提取 　用常规
CTAB法[ 14] 提取山丹百合基因组 DNA ,略有改
动[ 15] 。
1.4.2　基因组 DNA 质量和浓度的检测　琼脂
糖凝胶电泳取 5 μL DNA样品加 2 μL 溴酚兰溶
液 ,在 1.0%琼脂糖凝胶上于 3 ～ 5 V/cm 的电场
中电泳 1 h ,溴化乙锭染色 30 min后 ,在凝胶成像
仪上观察记录 。DNA 纯度检测用紫外分光光度
计进行检测 ,以 ddH2O 为对照 ,测定 260 nm 和
280 nm波长下的 OD值 ,算出 OD260/OD280值。
1.4.3　RAPD反应条件优化　以 RAPD 反应体
系(在 20 μL 反应体系中 ,含 40 ng 模板 DNA 、
1.5 mmo l/L Mg 2+ 、0.2 mmol/ L dNTPs 、1.5 U
Taq DNA 聚合酶 、0.4 μmol/L 随机引物)及程序
(94℃预变性 2 min ,94℃20 s ,36℃30 s ,72℃90
s ,40个循环 ,最后 72℃10 min ,4℃保存[ 16])为基
础对 RAPD 反应体系(总体积 20μL)中的模板
DNA 用量 、Mg2+浓度 、dN TPs 浓度 、Taq聚合酶
用量 、随机引物浓度及 RAPD反应程序中的退火
温度 、循环次数等影响因素逐一设置多个浓度梯
度进行试验(具体见结果与分析部分),找出适合
于山丹百合 RAPD-PCR反应的最佳反应体系 。
1.4.4　RAPD扩增产物的检测　将扩增产物在
浓度为 1.5%琼脂糖胶上 ,于 1×TAE 缓冲液中 ,
以 DL2 000 DNA Ladder 为分子量标准 ,100V的
电压下恒压电泳 1.5 ～ 2 h , 经 EB 染色 10 ～ 30
min ,用凝胶成像系统观察并照相。
2　结果与分析
2.1　野生山丹百合基因组 DNA的提取
由于百合鳞片中的多糖含量很高 ,多糖 、多酚
往往与 DNA 缠在一起共沉淀 ,形成粘稠的褐色
混合物而难以得到适用于 RA PD 的高质量的
DNA[ 17] 。因此以嫩叶为材料 ,采用常规 CTAB
法提取基因组 DNA ,得到的秦巴山区野生山丹百
合基因组 DNA 电泳图谱见图 1。
图 1　山丹百合部分样品基因组总 DNA电泳图谱
Fig.1　The electrophoretogram of some samples
from Qinba mountainous area
　　从琼脂糖凝胶电泳检测的结果来看 ,用此方
法提取的山丹百合基因组总 DNA 的质量较好 ,
·286· 西　北　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　17 卷
在 1%的琼脂糖胶电泳上为清晰的一条带 , RNA
去除干净 ,无降解现象或降解很少 ,分子量大于
23 kb ,且质量比较稳定 ,一致性高。各样品的基
因组 DNA主带比较明显 ,除浓度有所差别外 ,带
型基本整齐一致 , 基本满足 RA PD-PCR 扩增的
要求 。基因组总 DNA 纯度用 UV-1700 紫外分
光光度计对 DNA 的纯度进行定量检测 , OD260/
OD 280的比值均在 1.8 ～ 2.0之间 ,DNA 浓度达到
350 ng/μL 以上 ,其质量和纯度均达到了 RAPD
反应的模板要求 。
泳道 1-7.1.0 、1.25 、1.5 、1.75 、2.0 、
2.25 、2.5 mmol/ L;M 为 PCR Marker
图 2　不同Mg2+浓度的 RAPD-PCR扩增结果
Fig.2　The result of RAPD-PCR of different
concentration of Mg2+
2.2　RAPD反应体系的优化
由于 RAPD的反应体系中存在许多种成分 ,
包括模板 DNA 、随机引物 、Taq DNA 酶 、Mg2+ 、
dN TPs及反应缓冲液等 ,另外反应的条件也很复
杂 ,故影响结果的因素很多。对各因素设置不同
的浓度梯度以单因素递进筛选法(即对上一轮筛
选出的某个因素的最佳处理作为固定值用于下一
个因素筛选的基础)进行优化 ,以期得到稳定性好
的适合秦巴山区野生山丹百合的 RAPD-PCR反
应体系。
2.2.1　Mg2+浓度对 RAPD反应的影响　研究
结果表明 ,Mg 2+浓度对 RAPD扩增有显著影响。
Mg 2+是 Taq DNA 聚合酶的激活剂 。Mg2+不足
会使 Taq 聚合酶效率降低 ,导致扩增产物减少;
Mg 2+浓度过高对扩增效果也不利 ,会引起特异性
条带扩增产物的增加。设置 7个浓度梯度 ,分别
为 1.0 、1.25 、1.5 、1.75 、2.0 、2.25 、2.5 mmol/L。
当 Mg 2+浓度为 2.5 mmo l/L 时 ,扩增谱带较模
糊 ,扩增背景亮 ,当低于 1.75 mmo l/L 时中间部
分条带也出现缺失现象。扩增带的明亮度 、清晰
度和稳定性都是以 2.0 ～ 2.25 mmol/ L 时最佳 ,
经反复试验最终确定 Mg2+浓度为 2.25 mmo l/
L。
　　泳道 1-5.0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mmol/ L;M 为 PCR Marker
图 3　不同 dNTPs浓度的 RAPD-PCR扩增结果
Fig.3　The result of RAPD-PCR of different
concentration of dNTPs
2.2.2 　dNT Ps 浓度对 RAPD 反应的影响 　
dN TPs浓度对 RAPD反应的影响其实就是底物
对反应的影响。dN TPs 是作为 RA PD反应的原
料参与新链 DNA 的合成过程 。一般使用浓度在
50 ～ 200 μmol/L 之间。设置 5个浓度梯度 ,分别
为 0.1 、0.15 、0.2 、0.25 、0.3 mmol/ L。dN TPs浓
度在 0.2 ～ 0.25 mmo l/L 时条带最清晰 ,且数目
多 ,亮度高 。在 0.15 mmo l/L 和 0.3 mmol/L 时
部分条带缺失 ,且亮度减弱 , 0.1 mmol/L 时扩增
基本失败 。故选择 dNTPs浓度为 0.2 mmol/ L。
　　泳道 1-5.0.5 、1 、1.5 、2 、2.5U;M 为 PCR Marker
图 4　不同 Taq DNA聚合酶浓度的 RAPD-PCR扩增结果
Fig.4　The result of RAPD-PCR of different
concentration of Taq DNA polymerase
2.2.3　T aq DNA 聚合酶浓度对 RAPD反应的
影响　在 PCR反应中 Taq聚合酶的用量受到反
应体积 、酶活性 、酶的耐热性等因素的制约。因此
需要合适的 Taq 聚合酶使用量 。设置 5 个浓度
梯度 ,分别为 0.5 、1 、1.5 、2 、2.5U 。当 Taq酶浓
度为 0.5U 和 1U 时 ,扩增强度弱 ,条带不清晰。
浓度为 1.5 ～ 2.5U时区别不明显 ,从经济角度和
试验效果综合考虑采用 1.5U 。
·287·3 期　　　　　　　　　　钟海丰等:秦巴山区野生山丹百合 DNA 提取与 RAPD 反应体系建立
2.2.4　引物浓度及模板 DNA 浓度对 RAPD反
应的影响　由于在 RA PD反应体系中 ,所使用的
一般是 10bp 的随机引物 , 这样的引物与模板
DNA 的结合位点比较多。引物浓度过低时 ,与
模板结合机率降低 ,扩增受到影响;引物浓度过高
时 ,引起错配和非特异性扩增 ,且可增加引物之间
形成二聚体或多聚体的机会[ 18] 。设置 7 个浓度
梯度 ,分别为 0.1 、0.2 、0.3 、0.4 、0.5 、0.6 、0.7
μmol/L。引物浓度在 0.3 ～ 0.6 μmol/ L 均能扩
增出清晰稳定的条带。最终选择 0.4 μmol/ L 的
引物浓度 。
泳道 1-7.0.1 、0.2 、0.3 、0.4 、0.5 、0.6 、
0.7μmol/ L;M 为 PCR Marker
图 5　不同引物浓度的 RAPD-PCR 扩增结果
Fig.5　The result of RAPD-PCR of different
concentration of primer
　　关于模板 DNA 浓度对 RAPD反应的影响 ,
研究者有不同说法 ,但普遍观点认为模板 DNA
浓度的轻微变化不影响扩增产物的带型 ,故允许
有一定的变化范围。本试验设置的 9个浓度梯度
分别为 10 、20 、40 、60 、80 、100 、140 、180 、220 ng/
体系 。试验结果也证明了模板 DNA 浓度的变化
范围较大 ,在 20 ～ 80 ng 之间扩增结果基本没差
异 ,小于 10 ng 扩增结果不稳定 ,甚至失败 ,大于
100 ng ,会明显增加背景亮度 ,给分析带来困难。
本试验最终选择 40 ng 的模板 DNA浓度。
2.2.5 　退火温度对 RAPD-PCR 的影响 　在
RAPD-PCR体系中不同模板 DNA 及不同引物其
最适退火温度不同[ 19] ,本试验中在退火温度分别
为 35℃、36℃、 37℃、 38℃、 39℃条件下进行
RAPD-PCR ,发现在 36 ～ 38℃范围内随温度升
高 , RAPD谱带更清晰 ,特异性更强 ,随退火温度
的升高 ,引物和模板结合的特异性增强 ,结合的机
率减少。反之 ,引物和模板结合的特异性降低 ,结
合的机率增加。考虑到既要尽量避免出现阴性结
果 ,又要增强结果的特异性 ,认为在 37℃下退火
45 s较适宜。
2.2.6 　循环次数对 RA PD-PCR 的影响 　
RAPD-PCR循环次数的多少直接影响扩增产物
的量及结果的特异性 ,循环次数少 ,产物量少;循
环次数太多 ,则有非特异性产物产生。因为 PCR
反应到达一定程度后 ,会产生平台效应[ 20] ,过多
的循环会增加非特异产物的数量和复杂性 ,本试
验认为循环次数为 30 ～ 35次较适宜。
3　讨论
基因组 DNA 的提取是 RAPD扩增成功的基
础 , RAPD扩增的效果与模板 DNA 的提取方法 、
提取质量及 DNA 的纯度和完整性有着密切的关
系[ 21] 。不同植物的基因组必须采取与之相适宜
的提取方法 ,本试验用常规 CTAB 法 ,通过两次
氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提 ,除去蛋白质等物质。
在提取液中加入 β-巯基乙醇和 PVP 两种抗氧化
剂 ,可防止 DNA 的褐化;材料也是关键 ,尽量采
取百合的幼嫩叶片用于基因组 DNA的提取 。
Taq DNA 聚合酶活性需要 Mg2+。Mg2+浓
度过低 ,会显著降低酶活性。Mg 2+浓度过高又使
酶催化非特异性扩增增强 。Mg 2+浓度还会影响
引物的退火 、模板与 PCR产物的解链温度 ,从而
影响扩增片段的产率。 Taq DNA 聚合酶浓度过
高易产生非特异性扩增产物积累 ,过低使新链合
成效率下降 ,从而导致扩增产物减少;dN TPs是
RAPD反应的“原料” ,在 Taq DNA 聚合酶的作
用下 ,引物与单链 DNA 碱基配对相结合 , dN TPs
延伸结合上去 , 产生不同长度的 DNA 片段 ,
dN TPs浓度过高会产生错误渗入 ,过低导致 PCR
产率下降;引物浓度同样也影响 RAPD 扩增结
果 ,过高会增加非特异性谱带 ,过低会明显减少扩
增谱带。
本试验通过对各因素的筛选 ,最终确定适合
于野生山丹百合的 RAPD 扩增体系(20 μL)为:
40 ng 的模板 DNA , 0.4 μmo l/L 随机引物 , 2.25
mmo l/ L M g2+ ,0.2 mmol/ L 的dNT Ps , Taq聚合
酶 1.5U , 1×buffer 缓冲液 , ddH2O 补足 20 μL。
RAPD扩增反应程序为:94℃预变性 4 min , 94℃
30 s ,37℃45 s , 72℃ 90 s ,35个循环 ,最后 72℃
10 min , 4℃保存 。用该优化反应体系进行扩增 ,
均可出现清晰条带 ,为 RAPD标记在百合上的应
用提供了保障 。
·288· 西　北　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　17 卷
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