全 文 ：西北农业学报　2008 , 17(6):158-163
Acta A griculturae Boreali-occidentalis Sinica
农杆菌介导的百合 ACO反义基因遗传转化的研究①
张建鑫 , 刘雅莉＊ ,孟　芮 ,王跃进
(农业部西北园艺种质资源与遗传改良重点开放实验室;陕西省农业分子生物学重点实验室;
西北农林科技大学园艺学院 ,陕西杨凌　712100)
摘　要:以东方百合`索邦 (L ilium o riental `Sorbonne )无菌苗鳞茎 、鳞片叶及愈伤组织为外植体 , 通过
EHA105和 GV3101 两种根癌农杆菌(A grobacterium tume f aciens)菌株介导 , 将 ACO 反义基因导入东方百
合“索邦” 。结果表明 ,愈伤组织预培养 7 d , 侵染 30 min , EHA105菌液浓度 OD=0.8 , 共培养 5 d , 可获得 7.
14%的转化率 。经 GUS 、PCR、PCR-Southe rn 及基于梯状胶回收的 PC R法检测证明 ACO反义基因已转入转
化植株基因组中。
关键词:东方百合`索邦 ;ACO 反义基因;遗传转化
中图分类号:S188　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1004-1389(2008)06-0158-06
Research on Genetic Transformation of ACO Antisense Gene
into Lily Mediated by Agrobacterium Tumefaciens
ZHANG Jian-xin , LIU Ya-li＊ , MENG Rui and WANG Yue-jin
(Key Laboratory of Hort icu ltu ral Plant Germplasm Resou rces and Genetic Imp rovemen t in Northw es t China of M inis t ry of
Agricul tu re , Key Laboratory for M olecu lar Biology of Agricul tu re of Shaanxi Provin ce , C ol lege of Hort icu lture ,
Northw est A&F Universi ty , Yangling Shaan xi 712100 China)
Abstract:In vit ro bulbs , scale leaves and callus o f Li l ium oriental `So rbonne were used as the ex-
plants.ACO antisense gene had been transfo rmed into Li lium oriental `So rbonne mediated by
Agrobacterium tumef aciens EHA105 and GV3101.The resul ts show ed 7.14% of genetic t ransfo rma-
tion rate w as obtained acco rding to the procedures:the callus pre-cultured 7 d , immersed into bacteri-
al suspension(OD600 =0.8)o f EHA105 for 30 min , and then co-cultiv ated for 5 d.The ACO ant i-
sense gene w as integ rated into the genome o f transgenic plants confi rmed by PCR , GUS , PCR-South-
ern and ladderlike purification-based PCR analy sis.
Key words:Li lium o riental `Sorbonne ;ACO antisense gene;Genet ic t ransfo rmation
　　百合是世界著名的切花品种 ,在世界花卉市
场中占有极其重要的位置 。百合属于呼吸跃变型
花卉 ,在开花过程中伴随着乙烯的大量释放而迅
速衰老 ,如能有效控制百合花期乙烯生成量即可
延长其观赏寿命 ,增加百合的观赏价值 。传统上
多采用化学保鲜剂控制百合花期乙烯合成 ,延长
百合花期 。但是 ,化学保鲜具有毒副作用并且成
本较高。因此 ,有必要采用基因工程手段控制百
合花期的乙烯生成 ,达到延长花期的目的。
已有研究表明 ,通过反义基因抑制 ACO (1-
Aminocyclopropane-1- carboxylic acid Oxidase)
的表达可有效控制乙烯的生物合成。1990 年 ,
Hamilton等[ 1] 采用反义 RNA 技术抑制转基因番
茄果实中 ACO活性并实现对乙烯生成和果实成
①收稿日期:2008-05-12　　修回日期:2008-05-22
基金项目:国家自然科学基金项目(No.30371013)。
作者简介:张建鑫(1983-),男 ,硕士研究生 ,研究方向:观赏植物生物育种研究。 E-mial:owenzjx@163.com
＊通讯作者:刘雅莉(1960-),女 ,副教授 ,主要从事观赏植物生物育种及采后生理方面研究。 E-mial:lyl6151@126.com
熟的控制 ,这是世界上首例获得减少乙烯生成的
转基因植株。采用反义 RNA 技术抑制 ACO 活
性的研究在香石竹[ 2-3] 、花青菜[ 4] 和甜瓜[ 5] 等植
物中亦有报道。但关于 ACO 反义基因对百合转
化的研究尚未见报道 。
本研究以东方百合`索邦 无菌苗鳞茎 、鳞片
叶及愈伤组织为材料 ,研究了根癌农杆菌介导法
的遗传转化体系 ,并将 ACO 反义基因导入百合 ,
利用多种转基因检测方法对转化植株进行鉴定 ,
以获得阳性植株 ,为获得长花期的百合新品系奠
定基础。
1　材料与方法
　植物材料
东方百合`索邦 无菌苗由本实验室保存并繁
殖 ,愈伤组织由无菌苗鳞茎组织在附加 NAA 0.5
mg/L+6-BA 0.4 mg/L +V b1 0.4 mg/L +蔗
糖 90 mg/L 的 MS培养基中诱导形成。
　农杆菌菌种和植物表达载体
根癌农杆菌(Agrobacterium tume f aciens)菌
株 EHA105 、GV3101及百合 ACO反义基因植物
表达载体由农业部西北园艺植物种质资源与遗传
改良重点开放实验室提供 。该载体插入了克隆自
百合体内的 ACO 基因反向片段 ,并携带 Hpt选
择标记基因和一个 CaMV 35S 启动子及 GUS 报
告基因 ,GFP报告基因(图 1)。
　试剂来源
工具酶和 DNA Marker 购自 TakaRa 公司
(日本),凝胶回收试剂盒购自 Tiangen 公司(北
京), DIG 高效引物标记和检测试剂盒 I 购自
Roche 公司(德国), PCR引物由上海生物工程公
司合成 ,其他常规试剂均为国产分析纯 。
图 1　ACC氧化酶反义基因植物表达载体
Fig.1　ACC oxidase gene antisense plant expression vector
　农杆菌介导法遗传转化
挑取携带目的基因的根癌农杆菌单菌落 ,
EHA105和GV3101分别接种于含相应抗生素的
LB 液体培养基中 , 28℃ 220 r/min 振荡培养过
夜 ,取 200μL 该菌液接种到 20 mL 液体 LB培养
基中相同条件下培养到 OD=0.8 , 4℃, 5 000 r/
min ,离心 10 m in ,用附加 20 mg/L 的 AS(aceto-
syringone ,乙酰丁香酮)的液体 MS 培养基重悬
沉淀 , 28℃ 220 r/min 振荡培养 2 h , 分别稀释
EHA105OD值至 0.6 、0.8 、1.0;GV3101OD 值
至 0.6以备侵染材料 。
以愈伤组织 、无菌苗鳞茎及鳞片叶为外植体 ,
用刀片划伤 ,预培养 0 、1 、2 、3 、5 、7 d后浸入上述
菌液中 ,28℃轻轻摇动侵染 ,侵染时间分别为 10 、
20 、30 min。侵染后用无菌滤纸吸去表面菌液 ,转
入共培养培养基(MS+NAA 0.5mg/L),黑暗条
件下共培养 3 、5 、7 d。然后将外植体转入筛选培
养基(MS +NAA 1.5mg/L +Hyg 15 mg/L),
25℃培养 ,两周转接一次 ,筛选抗性芽。每个处理
接种外植体 30个。
　转基因植株的检测
1.5.1　GUS 基因组织化学法检测　取在筛选培
养基中生长良好的抗性植株为材料 ,未转化植株
为对照。采用固定染色法进行检测 。
1.5.2　PCR检测　取抗性植株和未转化植株的
幼嫩叶片为材料 ,采用 CTAB(cetyl trimethy l am-
monium brom ide)法[ 6] 提取基因组 DNA 。根据
载体上 HPT Ⅱ 基因序列 ,设计合成下列引物 。
上游引物:5 GGA TCCCCTGACCTAT TG-
CA TCTCCC-3 ;
下游引物:5 GTCGACCTAT T TCT TTGC-
CCTCGGAC-3 。
以基因组 DNA 为模板 , 进行 PCR 检测。
PCR反应体系为 25 μL ,反应程序为:94 ℃起始
变性 5 min;94 ℃变性1 min , 60 ℃复性50 s , 72
℃延伸 1.5 min , 35个循环;72 ℃延伸 10 min。
凝胶电泳分析 PCR产物。
1.5.3　Southern 和 PCR-Southe rn检测　基因
组 DNA 使用限制性内切酶 Hind Ⅲ 37 ℃酶切
20 h 。凝胶电泳分析酶切产物及PCR产物 。采
·159·6 期 张建鑫等:农杆菌介导的百合 ACO 反义基因遗传转化的研究
用虹吸印记法将酶切产物和 PCR产物转移到尼
龙膜上 ,用地高辛标记的探针对酶切产物和 PCR
产物进行 Southern和 PCR-Southern检测 。
1.5.4　基于 PCR法的梯状胶回收检测[ 7] 　采
用限制性内切酶 Hind Ⅲ对基因组 DNA 进行酶
切 ,将胶条纵向均匀切成 36块 ,使用凝胶回收试
剂盒分别进行回收 ,以回收的 DNA 为模板使用
HPT Ⅱ 引物对其进行 PCR扩增 ,凝胶电泳分析
PCR产物 。
2　结果与分析
　农杆菌介导法遗传转化
2.1.1　不同农杆菌菌株对遗传转化的影响　分
别对农杆菌菌株 EHA105 和 GV3101 侵染东方
百合`索邦 愈伤组织获得的抗性芽进行 PCR检
测 ,GV3101侵染的愈伤组织没有获得 PCR阳性
植株 ,而 EHA105 获得较高转化率 ,说明农杆菌
EHA105对百合比较敏感 ,适宜作为百合的遗传
转化菌株(表 1)。
表 1　不同农杆菌菌株对遗传转化的影响
Table 1　Effect of different
Agrobacterium on transformation
农杆菌
菌株
Agrobacterium
抗性芽数
No.of
hygr.buds
PCR阳性植株数
Posit ive
plant let s
转化率/ %
T ran sform at ion
rate
EHA105 70 5 7.14
GV3101 23 0 0
2.1.2　不同受体系统对遗传转化的影响　对 3种
不同受体系统经农杆菌菌株 EHA105转化 ,对在筛
选培养基中生长良好的抗性芽进行 PCR检测 ,鳞片
叶受体系统没有获得阳性植株 ,愈伤组织受体系统
的转化率最高为鳞茎受体系统转化率的 6.43倍(表
2)。抗性植株在筛选培养基中生长良好(图2)。
表 2　不同受体系统对对遗传转化的影响
Table 2　Effect of different recipient on transformation
外植体
Explan t
抗性芽
分化数
No.of hygr.buds
PCR阳性植株数
Posit ive
plant let s
转化率/ %
T ran sform at ion
rate
愈伤组织 Callus 70 5 7.14
鳞茎 Bulb s 180 2 1.11
鳞片叶 S cale leaves 33 0 0
A.抗性植株生长 15 d;B.抗性植株生长 30 d;C.抗性植株生长 90 d
A.Hyg romy cin-resi stan t plants cul tu red for 15 d;B.Hygromycin-resis tant plants cultured for 30 d;
C.Hygromycin-resi stant plants cultured for 90 d.
图 2　抗性植株生长情况
Fig.2　Development of hygromycin-resistant plants
2.1.3　预培养时间对抗性芽分化的影响　经不
同时间预培养的外植体 ,各取 30个进行转化 ,30
d后统计抗性芽分化情况 。结果表明 ,随预培养
时间延长 ,抗性芽分化率明显提高 ,预培养 7 d时
分化率达到最大值 100%(图 3)。
2.1.4　不同菌液浓度对抗性芽分化的影响　对
预培养7 d的外植体在农杆菌 EHA105菌液浓度
OD 600 =0.6 ～ 1.0条件下进行转化 ,不同浓度均
分化出抗性芽 ,对愈伤组织 ,在 OD600 =1.0时抗
性芽分化较好 ,分化率达 56.7%,鳞茎和鳞片叶
在 OD 600 =0.8时抗性芽分化较多 ,分化率分别为
93.3%和 26.7%。OD600值 0.6 ～ 1.0 之间均有
褐化现象 ,少数褐化外植体上也可分化出抗性芽 ,
因此 ,农杆菌 EHA105 侵染百合的最适浓度在
OD 600 =0.8左右(表 3)。
图 3　预培养时间对抗性芽分化的影响
Fig.3　Effect of preculture t ime on inducing
hygromycin-resistant buds
·160· 西　北　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　17 卷
2.1.5　侵染时间对抗性芽分化的影响　侵染时
间对抗性芽分化影响不大(表 4),侵染后不会造成
农杆菌污染 ,对后继的脱菌工作无影响。为使农杆
菌充分侵染外植体 ,侵染时间选择 30 min为宜。
表 3　菌液(EHA105)浓度对抗性芽分化的影响
Table 3　Ef fect of different agrobacterial(EHA105)concentration on inducing hygromycin-resistant buds
菌液浓度
Concent ration s
接种数
No.of cul tu red
抗性芽分化数 No.hyg r.bud s
愈伤组织 Callus 鳞茎 Bu lbs 鳞片叶 S cale leaves
OD600=0.6 30 13 26 6
OD600=0.8 30 15 28 8
OD600=1.0 30 17 23 4
表 4　侵染时间对抗性芽分化的影响
Table 4　 Effect of different inoculation time on inducing hygromycin-resistant buds
侵染时间/ min
Inoculat ion tim e
接种数
No.of cul tu red
抗性芽分化数 No.hyg r.bud s
愈伤组织 Callus 鳞茎 Bu lbs 鳞片叶 S cale leaves
10 30 16 26 2
20 30 23 28 0
30 30 18 24 5
2.1.6　共培养时间对抗性芽分化的影响　共培
养时间在 3 ～ 5 d 对抗性芽分化的影响差别不明
显 ,但当共培养时间延长到 7 d时 ,外植体在筛选
过程中会过早变黄变褐 ,且农杆菌会在培养基内
生长 ,即使加入羧卞青霉素也难以控制 。为了使
农杆菌能充分侵染外植体 ,提高转化效率 ,适宜的
共培养时间为 5 d(表 5)。
表 5　共培养时间对抗性芽分化的影响
Table 5　Ef fect of co-cultivation time on inducing hygromycin-resistant buds
共培养时间/ d
Co-cul tivation t ime
接种数
No.of cul tu red
抗性芽分化数 No.hyg r.bud s
愈伤组织 Callus 鳞茎 Bu lbs 鳞片叶 S cale leaves
3 30 18 28 7
5 30 19 26 5
7 30 0 0 0
　抗性植株检测
2.2.1　GUS 基因组织化学法检测　经过 GUS
染色后 ,可看到未转化的对照植株叶片全部褪色
变成浅黄色。而转化植株的叶片呈现蓝色 ,且颜
色均一(图 4),证明 ACO 反义基因已成功导入受
体植株中 。
A.未转化植株;B.转化植株
A.Non-t ran sformed plant;B.Transformed plant
图 4　转基因植株的 GUS基因组织化学法检测
Fig.4　GUS gene histochemical
detection of transformed plants
2.2.2　PCR检测　以潮霉素抗性植株叶片中提
取的 DNA 为模板进行 PCR 扩增 ,抗性植株的
PCR产物凝胶电泳结果显示 ,在 781bp处获得阳
性条带 ,而未转化植株没有获得条带(图 5)。
M.分子量标准 DL2000;P.ACO反义基因表达载体
提取质粒;C.未转化植株 1～ 9 , 转化植株
M.DL2000 Marker;P.plasmid f rom ACO anti sense vecto r as
template;C.non-transformed plants;1～ 9 , t rans formed plan ts
图 5　转基因植株 PCR检测
Fig.5　PCR analysis of transformed plants
2.2.3　PCR-Southern 检测　采用限制性内切
酶 Hind Ⅲ对百合基因组 DNA 进行酶切 ,通过
电泳结果可看到 ,其产物均呈现出清晰的弥散条
·161·6 期 张建鑫等:农杆菌介导的百合 ACO 反义基因遗传转化的研究
带 ,说明基因组 DNA已被充分酶切 ,且载体内无
Hind Ⅲ酶切位点 ,证明此酶可用于 Southern杂
交检测(图 6 , A)。
对 PCR检测阳性的 4 个植株进行 Southern
杂交检测 ,结果表明 , Southe rn杂交没有得到条
带 ,原因可能是由于百合基因组较大 ,外源基因相
对量较少很难检测到。而对 1 号植株的 PCR-
S outhern获得阳性杂交条带(图 6 , B)。
M.分子量标准 DL2000;P.质粒 DNA ;1.未转化植株;
2～ 5.PCR检测阳性植株;6.PCR 产物
M .Maker DL2000;P. plasmid DNA; 1. non-t ransformed
plan ts;2～ 5.posit ive plants by PCR analysi s;6.PCR products
图 6　基因组 DNA酶切(A)及 PCR-Southern分析(B)
Fig.6　Digested fragments of genomic
DNA(A)and PCR-Southern analysis(B)
2.2.4　基于 PCR 法的梯状胶回收检测 　基于
PCR法的梯状胶回收检测的酶切凝胶电泳结果
如图 7所示 ,酶切产物呈弥散型条带 ,证明基因组
DNA 已被充分酶切 。
M.分子量标准λHindⅢ和 DL2000;
1.百合基因组 DNA酶切电泳
M.MarkerλH indⅢ&DL2000;
1.Elect rop horesi s of diges ted f ragmen ts of li lium
图 7　基因组 DNA的酶切电泳
Fig.7　Electrophoresis of digested
fragments of genomic DNA
将酶切产物胶条均匀切成 36块 ,分别进行回
收 ,以回收产物为模板 ,进行 PCR扩增。凝胶电
泳分析 PCR产物 ,从图 8可以看出 ,在 2 、3 、4 、9 、
10 、14 、15 、16号泳道为 PCR阳性 ,22 ～ 36号泳道
为 PCR阴性(图略)。结果表明 ,样品 2 、3 、4 应为
导入基因在基因组中的同一个拷贝位于 10 kb左
右;9和 10为同一个拷贝位于 4 500 bp左右;14 、
15 、16为同一个拷贝位于 2 500 bp左右 。
M.分子量标准 DL2000;1～ 21.基于梯状胶回收的 PCR产物电泳
M.M arker DL2000;1～ 21.Electroph oresis of ladderlike pu rifi cat ion-based PCR products
图 8　基于梯状回收的 PCR 产物电泳
Fig.8　Electrophoresis of ladderlike purif ication-based PCR products
3　讨论
百合属于单子叶植物 ,传统观念认为 ,单子叶
植物不是农杆菌的有效寄主 ,因而不适宜采用农
杆菌介导法转化。但自 1987 年 , G rimsley 等[ 8]
利用农杆菌介导法将玉米条纹病毒(MSV)基因
导入单子叶植物玉米中以来 ,农杆菌介导的遗传
转化研究相继在石刁柏[ 9] 、水稻[ 10-11] 和小麦[ 12]
等单子叶植物中得到成功的报道 。近年来 ,
Hoshi等[ 13-14] 利用农杆菌介导法将报告基因成
功导入东方百合和麝香中 。但目前通过农杆菌介
导法将功能基因导入百合的研究少见报道[ 15] 。
基因转化首先要选择良好的植物受体系统 ,
百合遗传转化中常用的为愈伤组织受体系统与直
接分化受体系统 ,本研究对这两种受体系统的遗
传转化效果进行比较。结果显示 ,愈伤组织受体
系统的转化率明显高于鳞茎和鳞片叶直接分化受
体系统 ,转化植株后期生长良好。因此 ,愈伤组织
更适宜作为东方百合`索邦 品种的遗传转化受
体。不同植物对农杆菌的敏感性差异很大[ 16] ,因
·162· 西　北　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　17 卷
此有必要对适合百合遗传转化的农杆菌菌株进行
选择 。在遗传转化中通常选用的农杆菌菌株属胭
脂碱型和农杆碱型两类[ 17] 。本研究使用农杆碱
型代表菌株 EHA105和胭脂碱型菌株 GV3101
对外植体进行转化 , 结果显示 , 农杆菌菌株
EHA105可用于百合的遗传转化 , 这与唐东芹
等[ 18]的研究结果一致 。
Southern检测不仅可以鉴定外源基因的导
入 ,并且可以对其拷贝数进行检测 ,被公认为有效
的转基因检测方法。但 Southern 检测在百合转
基因鉴定中成功的报道很少。是由于 Southern
检测外对被检测基因量要求较高 ,而百合基因组
较大而外源基因相对数量很少 ,因此很难检测
到[ 12] 。本研究首先通过 GUS 组织化学染色法 、
PCR及 PCR-Southern检测 ,初步证明外源基因
已导入百合基因组中。进一步应用基于 PCR法
的梯状胶回收检测这一新方法对外源基因在百合
基因组内的拷贝数进行检测 ,结果显示外源基因
在百合基因组内有 3个拷贝。证实此方法可有效
用于对百合转基因中的外源基因的拷贝数进行鉴
定。相关基因表达情况及对乙烯合成的抑制作用
仍需进一步对转基因植株进行移栽和大田验证。
参考文献:
[ 1] 　Hamil ton A J , Lyet t G W , Griers on D.Ant isense gene
that inhibi t synthesi s of hormone ethy lene in t rans genic
plants[ J] .Natu re , 1990 , 346(6281):284-287.
[ 2] 　Savin K L , Baidoete A C , Graham M W , et al.Ant isense
ACC oxidase RNA delays carnation petal senes cen ce [ J] .
Hb rtscience ,1995 , 30(5):970-972.
[ 3] 　张树珍 ,汤火龙 , 杨本鹏 , 等.ACC氧化酶反义基因遗传转
化康乃馨的研究[ J] .园艺学报 , 2003 , 30(6):699-702.
[ 4] 　徐晓峰 ,黄学林 ,黄　霞.ACC 氧化酶反义基因转化花青菜
的研究[ J] .中山大学学报 , 2003 , 42(4):64-68.
[ 5] 　Hector G N , Daniel J C , Don J H , et a l.Transformation
of a muskmelon`Galia hybrid parental line(Cucumisme-
lo L.var.reticulatus S er.)wi th an anti sense ACC oxidase
gene [ J] .Plant Cell Report s , 2006 , 25(3):198-205.
[ 6] 　Doyle J L , Doyle J J.Is olat ion of plant DNA from fresh tis-
sue [ J] .Focus , 1990 , 12:13-15.
[ 7] 　吴　康.中国野生葡萄抗白粉病新基因遗传转化及检测方
法研究[ D] .杨凌:西北农林科技大学 , 2007:16-20.
[ 8] 　G rim sley N , Hohn T , Davies J W and H ohn B.Agrobacte-
rium-mediated delivery of infect ious maize st reak vi rus into
maiz e plants [ J] .Nature , 1987 , 325:177-179.
[ 9] 　Bytebier B , Deb oeck F , G reve H , et al.T-DN A organiza-
tion in tumor cultures and t ransgenic p lan ts of th e m ono-
coty ledon Asparagu s of fi cinalis[ J] .Proceedings of the Na-
tional A cademy of S ciences of the USA , 1987 , 84(15):
5345-5349.
[ 10] 　Chan M T , Chang H H , H o S L , et a l.Agrobacterium-
mediated p rodu ction of t ransgenic rice plants expressing a
chimericα-amylase promoter/β-glucu ronidase gene [ J] .
Plant Molecu lar Biology , 1993 , 22:491-506
[ 11] 　王彩芬 ,付永彩 , 朱作峰 ,等.水稻遗传转化甘露糖安全筛
选体系的建立[ J] .西北农业学报 , 2007 , 16(2):41-45.
[ 12] 　Cheng M , Fry J E , Pang S , et al.Gen et ic transformation
of w heat mediated by Agrobacterium tum efaciens [ J ] .
Plant Physiology , 1997 , 115:971-980.
[ 13] 　H oshi Y , Kondo M , M ori S , et a l.Production of t rans-
genic lily plan ts by Agrobacterium-mediated t ransforma-
ti on [ J] .Plant Cell Report s , 2004 , 22(6):569-364.
[ 14] 　H oshi Y , Kondo M , Kobayashi H .Ag robacterium-medi-
ated t ransformation of Lilium longif lorum [ J] .Acta H or-
ti cul tu rae , 2005 , 673(2):543-547.
[ 15] 　李邱华 ,洪　波 ,仝　征 ,等.新铁炮百合遗传转化体系的
建立及 Zm 401 基因的导入[ J] .农业生物技术学报 ,
2008 , 16(1):96-102.
[ 16] 　C ervera M , Lopez M , Navarro L , et a l.Virulence and su-
periuulence of Agrobacterium tumefacien s in w oody f ruit
plants [ J] .Physiol Mol Plant Path ol , 1998 , 52:67-78.
[ 17] 　王关林 ,方宏筠.植物基因工程原理与技术[ M ] .北京:科
学出版社 , 1998:205-206.
[ 18] 　唐东芹 ,钱虹妹 ,唐克轩 ,等.根癌农杆菌介导半夏凝集素
基因 pBIXPT A对百合的转化[ J] .上海交通大学学报:农
业科学版 , 2004 , 22(2):135-137;167.
·163·6 期 张建鑫等:农杆菌介导的百合 ACO 反义基因遗传转化的研究