全 文 ：·
2 14
· 中国药理学通报 c几 fo e, e p h a , 二 a co l o 夕i e a l B u l l e ￡` : 1 9 9 4 ; J u n ; 1 0 ( 3 )
蔡芦碱对分离的大鼠
神经细胞内游离钙的影响 ’
卢步峰 鲁友明 ’ 黄治森
(镇江医学院生物化学研究室 , 江苏 2 1 2 0 0 1 )
提要 用 F ur a 一 2 双波长荧光法测得分离的大鼠神经
细胞静息胞内游离钙浓度 ( 〔aC +2 〕i) 为 1 1 .9 4士 .9 1
n m o l
·
L 一 ’ (玉士 5 . : = 8 ) .票芦碱 ( 1 0一 ` m o l · L 一 ’ )可显
著促进 ca Z+ 内流而使 〔aC Z+ 〕i 升高 ( p < 0 · 0 1 , : = 8 ) ;
尼莫地平对静息〔C护+ 〕i 无影响 . 但能浓度依赖性地
对抗黎芦碱所致〔ca 抖 〕i 的升高 。 提示草芦碱诱发的
〔ca 什〕i 升高由存在于神经细胞膜上的 L 型电压依
赖性钙通道介导 ; 尼莫地平可用以间接地保护神经
细胞免受蔡芦碱的兴奋毒性 。
关镇词 大鼠 神经细胞 细胞内游离钙
蔡芦碱 尼莫地平
测定细胞内游离钙的含量及其变化有助
于了解细胞功能的启动 、加强或抑制 ,从而认
识 aC Z+ 对正常生理 、 药理 、 毒理或病理反应
的调节作用 。 本文采用国外 80 年代发展起来
的 F ur a 一 2 双波长荧光法 〔` ,测定分离的大鼠
神经细胞内钙离子浓度 ( 〔C a Z+ 〕 . ) ,观察神经
毒素票芦碱 ( v e r a t r i d i n e )对〔c a Z+ 〕 , 的影响 ,探
讨产生这种影响的作用机制 。
l 材料和方法
1
.
1 材料
1
.
1
.
1 试 荆 F ur a 一 2/ A M 和 蔡芦碱均 为
s sg m a 产品 ,胰蛋白酶 , D sf e o 进 口分装 ; T r it o n
x
一
! 0
,
u s A 进 口分装 ; 尼莫地平由医科院药
物研究所馈赠 。 其余试剂均为国产分析纯 。
1
.
1
.
2 仅器 R F 一 5 0 0 0 型双波 长荧光分光
光度计 , 日本岛津公司产品 。
1
.
2 方法
1 9 9 3一 0 5一 18 收稿 . 19 9 4一 0 2一 2 7 修回
, 江苏省自然科学荃金资助项目
海军神经生物学研究中心分子药理学研究室 . 南京
2 1 0 0 49
1
.
2
.
1 细胞愚液的制备 参考 D i l k y 等〔2 ,的
方法 , 取 舍S D 大鼠 , 体重 198 士 20 9 , 断头处
死 , 取全脑立即置 冰 H a n k s 液 ( m m o一 L 一 ` :
N a C I ] 3 7 ; K C I 5
.
0 ; C a C I: 1
.
3 ; M gS O
;
0
.
8 ;
N a Z H卜o ; 0 . 6 ; K H Z P O . 0 . 4 ; N a H C o : 3 . 0 ;葡萄
糖 5 . 6 ; p H 7 . 4) 中 , 仔细剥离 、 剔除软脑膜及
血管 , 用 H an ks 液冲洗 2~ 3 次 , 剪碎后 , 置 5
~ 10 倍的 1 . 25 9 · L一 ,胰蛋白酶中 , 于 37 ℃
轻轻搅拌 2 0 m i n 。 以冰 R p M I 1 6 4 0 培养基
(含 5 9 · L一 `牛血清白蛋 白 )中止 消化 。 过
2 2 0 目筛网 ,滤液 以 2 50 X g 离心 5 m in ,再以
H an ks 液洗一次 。 最后用 R P M I 1 6 4 0 培养基
(含 5 9 · L一 `牛血清白蛋白 )制备成一定量
( 1少 ~ 1护 个细胞 · L 一 ` )的细胞悬液 。 台盼兰
排斥试验检查 ,细胞成活率达 95 %以上 .
L .2 2 uF ar
一 2 负载及 关光测定 分离 的神
经细胞 F ur a 一 2 负载 及荧光 测 定均采 用文
献山 报道的 F ur a 一 2 双波长荧光 法 。 测定条
件 : 激发波宽 10 n m ,发射波宽 10 n m ,激发波
长 3 4 0 n m 和 3 8 0 n m , 发射波长 5 0 0 n m , 响
应因子 0 . 02 ,扫描间隔 1 5 。 测定时依次记录
静息期和不同剂量黎芦碱加入后的 34 0 n m /
3 8 0 n m 荧光比率 ( R ) 。 根据下列公式 , 可从测
到 的 R 值和 F ur a 一 2/ aC Z+ 解离常数 ( K d )算出
c a , + 浓度 。
〔C a Z+ 〕 . = 凡 ( F 。 / F . ) ( R一 R , .。 ) / ( R . ` 一 R )
式 中 R . 、 和 R , In分别为最大和最小的荧光比
率 。 亦即是在胞外游离 c a , + 浓度大于 1 m m of
·
L 一 ’和存在高 于此 ca Z+ 浓度 2 倍的 EG T A
情况下 , 分别加入 0 . 8 0 m m o一 L 一 , T r s to n x -
! 0 0 后所测得的荧光比率 。 F。 和 F ; 分别代表
C a Z + 为零和饱 一和状态下 ,在 3 80 n m 波长测得
中国药理 学通报 c hi : e se pha, 二 a e o如夕i e a l B o l l o t葱: 1 9 9 4 ; J u n ; 1 0 ( 3 ) · 2 15 ·
的荧光强度 。 K。 值为 2 2 4 n m o l · L 一 ’ 。 在计算
aC
Z+ 浓度之前 , 再减 去在没有负载 F ur a 一 2/
A M 的细胞 中测到的自发荧光 。
L Z
·
3 钙拮杭荆处理 将细胞悬液分为两
组 , 一组测定前加一定量的尼莫地平 ( 1 0一 6~
10 一 ` m o l · L一 ’ )与 F u r a 一 2 、 神经细 胞共同孵
育 , 另一组测定前不含尼莫地平 , 观察其对黎
芦碱引发〔C a Z + 〕: 变化的影响 。
2 结果
2
.
1 慕芦碱对神经细胞 〔aC ,+ 〕 . 的影响 图 1
显示 , 在细咆外 aC +2 浓度为 1 . 3 m m of · L 一 `
时 , 用本法分离的神经细胞静息 〔ca +2 〕. 为
1 1 9
.
4 士 9 . 1 n m o l · L一 , (牙士 s , n ~ 8 ) 。 加入
1 0一 5 m o l · L一 `黎芦碱可使 〔e a , + 〕. 升高 2 9 %
( 1 6 7
.
0 士 8 . 8 n m o l . L一 ` ) ;而 1 0一 6 m o l · L一 ’
黎 芦碱所致〔aC Z + 〕 , 的增加仅有 1 0% ( 1 3 0 . 7
士 1 .0 2 n m of · L一 ’ ) ; 在胞外蔡芦碱浓度 1 0一 `
m o l
·
L 一 ’ 时 , 〔c a , + 〕: 增 加 9 4% , 可达 2 3一 1
士 1 · 8 n m of . L一 ’ , 显示黎芦碱对分离的神
经细胞 〔C a Z + 〕 , 的增加呈一定剂量关系。
影响 。
806420
次\辞众冲启名脚ùē+.己口
一 6 一 5 一 4
lgc / m ol
·
L一 `
10 一 6 1 0 一 5 1 0 一月
黎芦碱 / m m ol · L 一 ’
图 i 城芦碱对神经细胞〔aC , + 〕 . 的影响
与静息状态相比 , . p < 0 . 05 · “ p < .0 01 : 一 8
2
.
2 尼莫地平对葬芦碱诱导的 〔C扩 + 〕 . 升高
的抑制效应 为探讨蔡 芦碱所致 神经细 胞
〔aC , + 〕 , 升高的作用机制 , 在加入黎芦碱前 5
m in
,预先加入一定浓度的 L 型钙通道拮抗剂
尼莫地平 ,能阻断黎芦碱 ( 10 一 ’ m ol · L 一 ’ ) 引
起 的〔e a , 斗 〕, 增加 , 并具一 定的齐.J量效应 ( 图
2 )
。 尼莫地平本身对静息状态下汇 a ? + 〕 没有
图 2 尼莫地平对攀芦碱 ( 1 0 一 弓 m ol · L一 ’ )诱导的
印 a’ + 〕. 升高的抑制效应 `不加尼莫地平时
〔aC t+ 〕 . 的增加百分率为 10 0 % )
3 讨论
黎芦碱是以百合科 M e la n t h a e e a e 亚科植
物提取的黎芦生物碱类中作用最强的幽体生
物碱 。 小剂量时具有一定的降压作用 ,而剂量
较大时则成为一种脂溶性神经毒素 , 能引起
神经肌肉兴奋 , 心律不齐等 , 这是由于可兴奋
膜去极化 , 兴奋性增高所致 。 通过髓鞘神经纤
维电压钳实验发现这种毒素能使一部分或所
有钠通道的激活过程朝负电位方向移动 , 使
得钠通道在静息电位下持续激活〔 , , 。 除此 , 它
还可完全阻断钠通道的失活 。
我们的实验发现 , 作为钠通道激动剂的
黎芦碱在胞外 aC Z + 存在下 , 可使分离的神经
细胞 〔C a Z勺 . 升高 。 胞外 aC +2 通过细胞膜上特
异的钙通道进入胞浆 , 或者内质网和线粒体
中 aC Z + 释放到 胞液 , 均可使〔C a 艺十〕 . 升高 ,本
研究发现 L 型钙通道拮抗剂尼莫地平可阻断
蔡芦碱诱发的 〔aC Z+ 〕. 升高 ,且呈明显的剂量
一效应关系 , 当尼莫地平为 [ 0 一 ` m ol · L一 ’时 ,
黎芦碱诱发的 〔C a Z + 〕. 升高几乎全被抑制 ,表
明黎芦碱诱发的 〔aC , + 〕. 升高 , 主要是激活了
神经细胞膜上 的 L 型 电压依赖性钙通道所
致 。 这与 iP nt or 等 〔。报告黎芦碱可 c a ? 十依赖
J性促进大 鼠脑中某些嗦吟衍生物的释放是一
致的 。
现代神经生物学研究证 明『5〕 , 神经细咆
0550
一!曰二out`zōē+、。勺口
·
2 1 6
· 中国药理学通报 e 八i , 。 s 。 尸六a , 二 a e o l o夕i e a l B : 11“ i : 1 9 9 4 ; J u n ; 1 0 ( 3 )
中正常钙稳态的维持是保证其功能与结构完
整的重要因素 。 一旦细胞在某些病理状态或
毒理作用下出现钙失衡或钙超载 , 则导致细
胞一系列代谢功能异常 , 直至细胞损伤或死
亡 。 本研究证实 ,黎芦碱在较大剂量能使分离
的神经细 胞〔aC Z十〕 . 升高 ,可能正是其神经兴
奋毒性的作用机理 。 此外 ,我们的研究发现 ,
在分离的神经细胞中 , 尼莫地平可浓度依赖
性地逆转这种黎芦碱所致 〔C a 竺十〕. 的增加 ,表
明作为一种有效的钙通道拮抗剂〔` 〕 , 尼莫地
平可用以间接地保护神经细胞免遭蔡芦碱的
毒害 。
参 考文 献
1 卢步峰 . 鲁友明 ,黄治森 . 用 氏 r , 一 2 双波长荧光法测定
神经细胞内游离钙 · 生 物化学与生 物物理进 展 . 19 94 ,
2 ( 3 )
: 2 7 0
2 D i吐d y J E 。 L es l le SW . E t h a n o ! i n h i b i t s N M D A 一 i n d u e ed i n -
e r e a咒 10 f r e e i n t r a份 Il u l a r C a , + i n d i s , o c 加 tde b r a i n ce l l .
价口廷. 肠刀 。 19 8 9 ; 4 9 9 ( 2 ) : 38 3 ~ 7
山 t比 r a l l W A . N e u r o t o x i n s t h a t a e之 on v o l t a g e 一 , n s i t i v e
s叫 i u m e h a n n e l s i n e x e i t a b l e m e m bar n e s . 月盆扮 u R理 尸知尸杯四 -
诫 了。石以 , 1 9 8 0 , 2 0 : 1 5~ 4 3
P`n t or J , B ia z R e y M A . T o r es M , M i r a , 氏 r t u助 1 M T .
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清 ) . L I F (李芳 ) . E f f ec l s o f n im阅厄p i n e o n 一 g一u t a m a t e 一 i n -
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m o v sn ` r a t , . 滩`翻 hP a ,耐之汉 S` , ( 中 国药理学报 ) . 1 9 9 1 .
1 2 ( 4 )
:
2 9 7
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E f f e e t s o f v e r a t r i d i n e o n i n t r a e e l l u l a r f r e e C a Z+
C o n C e l t r a t i o n i n d i S S O C i a t e d r a t n e U r o n S
L U B u
一
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A B S T R A C T T h e i n t r a e e l l u la r f r e e C a Z+
e o n e e n t r a t i o n ( 〔aC Z+ 〕, ) w a s m e a s u厂e d i n f r e s h -
] y d i s s o e ia t e d n e u r o n s rP e Pa r e d f r o m S P r a g u e
-
D a w l e y r a rs u s i n g t h e 月u o r e s e e n t C a Z+ i n d ie a t o r
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.
T h e r e s ti n g 〔C a Z+ 〕 . o f n e u r o n s i n
C a Z +
一 e o n t a i n in g s o l u t i o n w as 1 1 9
.
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·
L一 ` (牙士 s , 、 = 8 ) . V e r a t r id i n e ( a N a + e h a n -
n e l b一o e k e r , 10 一 刁 m o - · L 一 ’ ) m a r k e d ly
O巨v is i o n o f M o l代 u l a r
父 a r e h C e n t r c 。 N a n J n` g
P h a r m a e o l呢y . N a v a l N e u r o b i o IOg y R e
2 1 0 0 4 9
e v o k e d 〔Q Z+ 〕 , o f n e u r o n s ( P < 0 . 0 1 , 、 一 8 )
a n d t h i s i n e r e a se e o u l d be P r e v e n t e d o r r e v e r s ed
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n d e n t aC
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t h a t t h e r i se o f 〔C a ? + 〕 , in d u e e d b y v e r a t r i d i n e i,
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i C让V 。
K EY WO R D S r a t ; n e u r o n s ; i n t r a e e l l u la r
f re e e a l e iu m ; v e r a t id i n e ; n im o d i P i n e