全 文 ：农业环境科学学报 2010,29(8):1455-1459
Journal of Agro-Environment Science
摘 要：采用光照培养箱培养斜生栅藻的方法，以甘油为溶剂，研究了三聚氰胺对斜生栅藻的毒性效应。结果显示，当三聚氰胺的浓
度在 50、200 mg·L-1时，对斜生栅藻生长有促进作用，在 750 mg·L-1时则表现出抑制效应，染毒 7 d后对叶绿素的影响和对藻密度
的影响一致，显示浓度-效应关系，即浓度越高抑制效应越明显。三聚氰胺对斜生栅藻超氧化物歧化酶（SOD）的影响表现为：当三聚
氰胺浓度为 200 mg·L-1时酶的活性达到峰值，然后开始下降，在 750 mg·L-1 SOD的活性与对照相比减少了 43.6%，三聚氰胺对斜生
栅藻的脂质过氧化产物丙二醛（MDA）的影响和对可溶性糖的影响效应是一致的，随着浓度的增加均在减少。
关键词：三聚氰胺；斜生栅藻；光合色素；超氧化物岐化酶（SOD）；丙二醛（MDA）
中图分类号：X503.225 文献标志码：A 文章编号：1672- 2043(2010)08- 1455- 05
三聚氰胺对斜生栅藻的毒性研究
何 桢，胡晓静，牟 文，周巧巧，张 灿，杨 雪，熊 丽，刘德立
（湖北省遗传控制与整合生物学重点实验室，华中师范大学生命科学学院，武汉 430079）
Melamine Toxicity of Scenedesmus Obliquus Kütz
HE Zhen, HU Xiao-jing, MU Wen, ZHOU Qiao-qiao, ZHANG Can,YANG Xue, XIONG Li, LIU De-li
（Hubei Key Laboratory of Genetic Regulation and Integrative Biology, College of Life Sciences, Huazhong Normal University, Wuhan
430079, China）
Abstract：Due to high prevalence of epidemic cases of renal failure among Chinese infants in 2008, resulting from of melamine contaminated
milk, raised concerns about food safety and also the international interest to studying the melamine toxicity mechanism was established.
Melamine is an organic base and a trimer of cyanamide, with a 1,3,5-triazine skeleton or simply, its an azocyclo-containing organic com－
pound, and traditionally used in the chemical and sporadically mixed into animal feeds to boost protein content. Animal feeding with exces－
sive melamine concentration can induce renal failure and even death. The residue of melamine in edible animal products also threatens hu－
man health. Melamine is used as food additives which has a ranther poor biodegradability. The possibility of water resources and soils being
contaminated by melamine discharge arouse more and more concern. This study was designed to test the melamine toxicity effects on aquatic
ecosystem. S. obliquus was exposed to series melamine concentrations（0, 50, 200, 750 mg·L-1）. Five parameters were measured after 7 days
exposure, which were growth rate, superoxide dismutase（SOD）, photosynthetic pigments, free malondialdehyde（MDA）and soluble sugar
contents. Melamine concentration of 50, 200 mg·L-1 caused a significant increase in growth and photosynthetic pigments contents. SOD ac－
tivities of S. obliquus were stimulated first and then inhibited with the increasing of melamine concentrations, and reached its peak in 200
mg·L-1（compared with the control, P<0.05）reduced by 43.6% in 750 mg·L-1（compared with the control）. The contents of MDA and soluble
sugar were inhibited significantly under moderate and high concentration（50, 200, 750 mg·L-1）of melamine.This study indicated that, SOD
was sensitive to melamine exposure and could be used as a potential biomarker for risk assessment of aquatic ecosystem safety.
Keywords：melamine; Scenedesmus Obliquus Kütz; photosynthetic pigments; SOD; MDA
收稿日期：2010－03－03
基金项目：国家自然科学基金（30771429.20672041）
作者简介：何 桢（1987—），女，研究方向为分子毒理学。
通讯作者：熊 丽 E-mail：xionglily@mail.ccnu.edu.cn
三聚氰胺是一种白色结晶粉末，分子式 C3N6H6，
分子量 126.12，含氮量高（约为 66%），能溶于甲醛、乙
醛、热的乙二醇、甘油，微溶于水，不溶于乙醚、苯、四
氯化碳等溶剂；溶液微显碱性，没有异味，利用传统的
凯氏定氮法测定蛋白质含量时不易发现掺入到食品
和饲料中的三聚氰胺，造成高蛋白含量假象。三聚氰
胺作为食品和饲料添加剂，具有轻微的生物学毒性，
长期饲喂含三聚氰胺的日粮后会对动物产生危害。近
来，三聚氰胺陆续在众多动物性食品中被检出。2008
年的三鹿奶粉事件[1]、引起婴幼儿泌尿系结石等事件，
2010年 8月
引起了公众对三聚氰胺的密切关注和广泛重视。
有关三聚氰胺在哺乳动物中的毒性作用已有初
步研究[2]，然而是否会对藻类产生负面影响还未见报
道。藻类作为水生生态系统初级生产者，其种类的多
样性和初级生产量直接影响水生生态系统的结构功
能，因而成为监测评价水环境质量的重要指示生物，
藻生长和繁殖对水生生态系统的平衡和稳定具有重
要意义。斜生栅藻对毒物敏感，个体小，繁殖快，培养
方便，在较短时间内可得到化学物质对其许多世代及
种群水平的影响评价，生长状况在一定程度上能反映
水环境质量，是一种通常使用的测试生物。因此，选择
极常见的浮游藻类斜生栅藻（Scenedesmus Obliquus
Kütz）作为实验生物，研究三聚氰胺对其毒性效应，以
期为相关部门制订三聚氰胺环境排放标准和食品安
全评估提供科学依据。
1 材料和方法
1.1 实验材料与仪器
三聚氰胺（melamine、分析纯）由天津东丽区泰三
化学试剂厂提供；斜生栅藻（S. obliquus）由中国科学
院武汉水生生物研究所藻种库提供（No.FACHB39），
并经室内扩大培养用于实验。斜生栅藻的培养基为
HB-4缺氮培养基[3]，所有试剂均为分析纯。
高速冷冻离心机（EPPENDORF），酶标仪（BIO-
TEC），粒度计数仪（BACKMAN），光照培养箱。
1.2 实验方法
1.2.1 驯化培养
将斜生栅藻（FACHB39）在无菌条件下转移至
HB-4 人工培养液中，于光照培养箱中驯化培养 1
周，至对数生长期进一步扩大培养。培养条件如下：
温度（25±0.5）℃，pH 7~8；明暗周期比 12 h∶12 h，光强
3 000 lx，静置培养，每日定时人工摇动 3次。
1.2.2 溶剂不可见效应浓度（No Observed Effect Con－
centration，NOEC）的测定[4-5]
由于三聚氰胺微溶于水，易溶于甘油等溶剂，实
验以甘油为溶剂，设置 5个实验浓度和一个空白对照
组（缺氮），经 7 d染毒后，用粒度计数仪计数，测定藻
细胞的密度（个·mL-1），计算甘油的 NOEC。
1.2.3 三聚氰胺对斜生栅藻生长的影响
根据以上测得的溶剂 NOEC设置实验浓度，将处
于对数生长期的斜生栅藻接种于灭菌的无氮HB-4
人工培养基中，起始藻密度均为 6.8×106个·mL-1。根
据预实验加入用甘油配置的三聚氰胺母液（500 g·L-1
的母液，水浴加热助溶）使其成系列浓度（50、200、750
mg·L-1），以无氮的 HB-4培养基为对照组。每隔 24 h
取样测定藻细胞密度。
1.2.4 光合色素的测定
取 20 mL培养 7 d的藻液，5 000 r·min-1冷冻离
心 10 min收集藻细胞，转移到 10 mL的试管中，加
80%的丙酮 5 mL，封住试管口，置于黑暗中抽提 24 h
后，充分混匀，4 000 r·min-1离心 10 min，取上清液分
别测定 OD663、OD645、OD450，并以 80%的丙酮参比，计算
各自的光合色素含量[6]。并测定其吸收光谱，以 80%
的丙酮作为参比，记录 300~800 nm波长范围内色素
吸收光谱。
1.2.5 粗酶液的提取[7]
取一定量的藻液 5 000 r·min-1离心 15 min收集
藻细胞，分别用磷酸缓冲液（0.1 mol·L-1，pH 7.8）润洗
藻细胞 3次，每组中加入预冷的磷酸缓冲液 3 mL（0.1
mol·L-1，pH 7.8）和少量的石英砂经冰浴碾磨，将匀浆
液在 4 ℃下 8 500 r·min-1离心 15 min，取上清液并记
下总体积，冷冻以备后面实验用。
1.2.6 SOD测定
采用 Beachchamp[8]建立的 Bewley[9]改良的氮蓝四
唑（NBT）光化学还原反应法。酶活力单位定义为能引
起反应初速度（不加酶时）半抑制时的酶用量。蛋白质
含量用考马斯亮蓝法测定[10]，以小牛血清蛋白作标准
曲线。
1.2.7 膜脂过氧化作用的测定
参照 Heath[11]和林植芳 [12]等的方法，根据膜脂过
氧化产物 MDA 与硫代巴比妥酸钠（TBA）的定量反
应，通过测定其反应产物在 OD532、OD450处的吸收值
来测定 MDA的含量。
1.2.8 数据处理
每组实验均设 3组平行，数据处理采用 Origin
5.0和 SPSS Statistics 13.0统计分析软件，并进行 t检
验和差异显著性分析。
2 结果与分析
2.1 溶剂的 NOEC值
分别以 0、0.02%、0.1%、0.2%、1%、2%的甘油处
理斜生栅藻，7 d后经方差分析，无显著差异的最高浓
度为 0.2%（表 1），即甘油对斜生栅藻的 NOEC值为
0.2%，正式实验中甘油的含量应低于 0.2%。
2.2 三聚氰胺对斜生栅藻的生长效应
三聚氰胺对斜生栅藻的生长曲线如图 1所示。由
何 桢等：三聚氰胺对斜生栅藻的毒性研究1456
第 29卷第 8期 农 业 环 境 科 学 学 报
图 1可见，染毒的前 3 d，三聚氰胺对斜生栅藻的生长
都有促进作用，并且浓度越高促进作用越强。但第 3 d
起，750 mg·L-1 浓度组对藻生长表现抑制效应；7 d
后，与对照组相比，三聚氰胺浓度为 50、200 mg·L-1
时，藻密度分别增加了 10.2%、2.70%，而在三聚氰胺
浓度为 750 mg·L-1时则减少了 7.60%。
2.3 三聚氰胺对斜生栅藻光合色素的影响
图 2表示三聚氰胺对斜生栅藻光合色素含量的
影响。从图 2可知，各种色素的含量，在三聚氰胺浓度
为 50、200 mg·L-1时，与对照组相比都显著增加；而在
三聚氰胺浓度为 750 mg·L-1时与对照组相比，各色素
含量显著减少。表现出低浓度三聚氰胺促进各光合色
素合成，而高浓度三聚氰胺则抑制光合色素合成。实
验过程中观察到随着暴露时间的延长，藻细胞的绿色
越来越浅，到高浓度时几乎为白色，这一现象和图 2
的藻密度结果一致。
2.4 三聚氰胺对斜生栅藻吸收光谱的影响
图 3显示了三聚氰胺对斜生栅藻的吸收光谱，染
毒 7 d后，各浓度组三聚氰胺的吸收光谱谱带完全相
似，在蓝光区 430 nm处和红光区 663 nm处均出现明
显的峰，不同浓度明显影响了峰值的大小，这与光合
色素含量的变化是一致的。
2.5 三聚氰胺对斜生栅藻 SOD活性、MDA以及可溶
性糖含量的影响
图 4 显示三聚氰胺对斜生栅藻 SOD 的活性、
MDA以及可溶性糖含量的影响。与对照相比，在 50
mg·L-1时，SOD 的活性变化不明显，200 mg·L-1时，
SOD 的活性显著增加，与对照组相比分别增加了
1.81%、62.1%；而在 750 mg·L-1时减少了 43.6%。MDA
含量与对照组相比逐渐减少，在 50、200 mg·L-1时，
MDA的含量分别减少了 36.3%、39.0%；而在 750 mg·
L-1时，MDA的含量增加了 42.4%。与对照组比可溶性
糖含量显著减少，分别减少了 14.4%、42.8%、55.2%，
表现出明显的浓度-剂量效应。
表 1 甘油对斜生栅藻生长的影响
Table 1 Effects of glycerol on growth of S. obliquus
甘油浓度/%
细胞数目/105个·mL-1
均值 标准偏差 差异性
0 1.55 0.15
0.02 1.59 0.05 不显著
0.10 1.34 0.21 不显著
0.20 2.05 0.36 不显著
1.0 14.60* 1.25 显著
2.0 31.44* 2.10 显著
图 2 三聚氰胺对斜生栅藻光合色素的影响
Figure 2 Effects of melamine on photosynthetic pigments
of S.obliquus.
1457
2010年 8月
3 讨论
已有实验证明[13-14]，NH+4 -N是藻类优先利用的 N
源，因为这种形态的 N可直接被利用，其他无机形态
的 N（如 NO-3、NO-2）都是间接利用的。有关藻类对有机
氮吸收利用的报道较少，本实验就三聚氰胺对藻的生
理进行研究。本研究中，染毒的前 3 d，三聚氰胺对斜
生栅藻的生长有促进作用，并且浓度越高促进作用越
强。但从第 3 d起，750 mg·L-1浓度组对藻生长表现抑
制效应，这可能是由于高浓度三聚氰胺的毒性作用；
随着染毒时间的延长，三聚氰胺逐渐在细胞内积累，
引起细胞内一系列生理生化指标发生变化，导致藻生
长被抑制。虽然氨氮是可被植物直接利用的氮，但高
浓度的非离子态氨和铵根离子会对植物产生毒害作
用，影响植物的生长，因此大部分植物不能耐受高浓
度的氨氮。有研究表明[15]，高浓度的非离子态氨和铵根
离子会对植物产生毒害作用，影响植物的生长。同时，
高浓度的有机氮源，有可能会对藻形成逆境胁迫，影
响植物正常生理活动和生长，如叶绿素、可溶性糖的
含量减少，从而抑制了藻的生长。三聚氰胺对斜生栅
藻的影响同王珺等[16]研究的富营养条件下不同形态
氮对轮叶黑藻的生理影响的结果是一致的。
叶绿素是藻细胞进行光合作用的色素。已有研究
表明不同植物、藻类等生物在遭受环境胁迫时，光合
色素的含量会发生变化[17]。这是客观反映植物利用光
照能力的一种重要指标，往往作为判断植物光合能力
强弱，反映环境胁迫状况的依据[18]，其含量的变化能
较好地反映生物各阶段的生长情况。光合器官是植物
细胞内活性氧的主要来源之一，而光合色素及与之结
合的内囊体均具有不饱和多烯烃结构，极易受活性氧
的攻击。在三聚氰胺胁迫下，光合色素的含量都有变
化。低浓度的三聚氰胺与无氮培养基的对照组相比较
显著增加，可能是三聚氰胺为藻的生长提供氮源，促
进叶绿素的合成。随着浓度的增加各种光合色素也在
逐渐增加，达到最大值时又开始减少。但是在高浓度
时三聚氰胺又抑制光合色素的合成，可能是三聚氰胺
的毒性作用在藻体内的积累。植物能够利用有机氮首
先要将其转化成为无机氮后再利用，高浓度的三聚氰
胺对藻光合色素有抑制作用，可能是三聚氰胺过多地
转化成无机氮，超过藻所能承受的限度，对藻形成逆
境胁迫，产生毒害，从而影响藻的正常生理活动，抑制
了它的正常生长。氮元素是藻类生长所必需的，但高
浓度的有机氮可能会对植物产生毒害作用，影响植物
的生长。这同颜昌宙等[15]研究的不同浓度氨氮对轮叶
黑藻地生理影响的结果是一致的。
SOD在生物的细胞中广泛存在，并作为细胞保护
酶被人们重视和研究，是生物体中惟一能直接地、特
异性地猝灭超氧自由基的抗氧化酶，是防御过氧化系
统的重要保护酶，在消除自由基、减轻脂质过氧化物
作用和膜损伤方面起重要作用[15]，它的变化可以反映
出生物对环境胁迫的适应性程度。MDA在细胞内的
积累通常被用来作为细胞在受到胁迫时膜脂过氧化
的重要指标。低浓度的三聚氰胺处理中，SOD的活性
有一定的升高，这主要是因为三聚氰胺作为惟一的氮
源，使光合作用加强。而光合器官是植物细胞内氧自
由基的主要来源[19]，随着光合效率的增加，氧自由基
增加，藻体为了降低氧自由基的损伤，诱导出更多的
SOD，以清除过多的氧自由基，使自由基在体内处于
平衡状态。此时 MDA含量变化不大，也说明细胞膜
没有受到较大的损伤。而在三聚氰胺为 750 mg·mL-1
时，SOD的活性在下降，此时 MDA的含量也有明显
的增加，说明细胞膜受到较大的损伤。
与对照组相比，胞外可溶性多糖随着三聚氰胺浓
度的增加反而逐渐减少，可能是在无氮的条件下，细
胞膜受到的损伤大于含氮的三聚氰胺处理组，从而使
大量的胞内糖渗透到细胞外，使胞外糖含量增加，这
同尤珊等[20]研究的光照对螺旋藻形态及胞外多糖的
影响和机理的结果是相同的。
4 结论
本实验的结果显示，在低浓度时，三聚氰胺能够
促进斜生栅藻生长，显示斜生栅藻可以吸收并利用三
何 桢等：三聚氰胺对斜生栅藻的毒性研究1458
第 29卷第 8期 农 业 环 境 科 学 学 报
聚氰胺来合成自身所需的物质。
三聚氰胺对斜生栅藻光合色素、生长的影响是一
致的。
三聚氰胺浓度在 200 mg·L-1以下时，SOD的活性
随其浓度的增加在上升，而在 750 mg·L-1时急剧下
降；MDA以及可溶性糖含量随着三聚氰胺浓度的增
加而减少。
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