全 文 ：　* 1997-08-11收稿　 1997-12-10修回
一种新的内源性钠泵抑制因子前海葱苷
原 A样物质在牛体内的分布
李素琴　符云峰　 Schoner W1　 Eim C1
(河北省医学科学院生化研究室 ,石家庄　 050021; 1德国 Jus tus- Libig Giess en　大学生化和内分泌研究所 )
提要　为了建立一种蟾蜍二烯羟酸内酯 ( bufadieno lides)前海葱苷原 A免疫方法 ,并对哺乳动物体内的前海葱苷原
A样物质进行检测 ,我们制备了兔和羊前海葱苷原 A抗体。利用 ELISA法检测了一种新的内源性钠泵抑制因子前
海葱苷原 A样物质在牛的肾上腺、丘脑、心脏、肾脏、肝脏、小脑、骨骼肌和血液中的分布。研究发现这种前海葱苷原
A样物质在肾上腺及下丘脑的含量高于其它腺体组织 ,其具有抑制人红细胞 86Rb摄取的特性 ,可与前海葱苷原 A
抗体发生免疫交叉反应 ,但几乎不与哇巴因抗体交叉反应 ,是一种新的类固醇激素。
关键词　内源性钠泵抑制因子　前海葱苷原 A抗体　前海葱苷原 A样物质　哇巴因抗体
　　许多研究组报道在哺乳动物体内存在一种内源
性类洋地黄物质 ( Endogenous digi talis-like facto r,
EDLF) ,它具有抑制细胞膜钠、钾腺苷三磷酸 ( Na+ -
K
+
-AT P)酶的作用 ,对钠平衡 ,动脉压和血管平滑
肌张力进行调节 [1 ]。 Hamlyn及其同事提出这种
EDLF在高血压病人血浆里是一种哇巴因样物
质 [2 ] , Haupert等提出牛下丘脑分泌一种哇巴因同
分异构体 [ 3]。另有学者从人胎盘组织 [4 ] ,白内障眼晶
体 [5 ]提取纯化得到蟾蜍二烯羟酸内酯类固醇 ,并发
现用抗蟾蜍二烯羟酸内酯前海葱苷原 A( Prosci llar-
idin A)
[6 ]和抗海蟾蜍毒素 ( Marinobufagenin)抗体
检测到的抗原物质的浓度与血压升高相平行 [ 7]。为
了进一步证实内源性强心烯羟酸内酯哇巴因样物质
和蟾蜍二烯羟酸内酯前海葱苷原 A样物质可能同
在体内生成和在血循环存在 ,我们在兔和羊身上制
备了抗前海葱苷原 A抗体 ,利用抗前海葱苷原 A抗
体和抗哇巴因抗体检测了它们在牛的各腺体组织及
血液中免疫反应活性的分布 ,并对其生物特性进行
了研究。
1　材料和方法
1. 1　Na+ -K+ -ATP酶抑制因子的纯化
牛的组织和血标本来自当地的屠宰场。牛宰杀
后迅速将所需的肾上腺、下丘脑、心脏、肾脏、肝脏、
小脑、膈膜等组织置于冰内 , - 20℃低温保存。1 g
组织用 10 m l甲醇匀浆 ,匀浆液在 4℃搅拌 2 h后离
心 9 000 xg 20 min,上清液冷冻干燥 ,干燥物按 40
mg提取物用 2 ml 50%甲醇悬浮。悬浮液同上述条
件离心 ,上清液在含有抗前海葱苷原 A抗体
Sephadex亲和层析柱上分离 ,用 pH间断洗脱法洗
下的活性物质 ,再以 C18 HPLC( M erck-Hitachi )反相
制备柱 ( 250× 30 mm, 18～ 10μm)纯化 , 10～ 30%异
丙醇-7-氟醋酸梯度洗脱 90 min,流速 4 ml /min,自
动分步收集器收集在紫外检测器 ( GAT LCD501
UV /V IS) 220 nm和 300 nm吸收峰处的洗脱液。洗
脱液冷冻干燥。余干渣用 1 m l磷酸缓冲液 ( PBS)溶
解 ,取 25～ 100μl用于 ELISA测定前海葱苷原 A
样物质的免疫活性 ;余干渣溶于蒸镏水进行人红细
胞86 Rb摄取率的生物活性测定。
血清中 Na+ -K+ -AT P酶抑制因子的纯化按
Sich发表的方法进行 [6 ]。
1. 2　制备抗前海葱苷原 A抗体
基本同 Sich发表的方法。将前海葱苷原 A与牛
血清白蛋白的连接物 100μg溶于 0. 5 ml生理盐水
和 5ml Freund s完全佐剂混合并在新西兰大白兔的
脊背皮内注射 5～ 6个位点 ,以后第 2、 3、 6、 12周再行
如上注射。第 40周取免疫的兔血 ,含于 1 mol /L甘氨
酸和 0. 5 mo l /L NaCl ( pH8. 9)溶液内的抗血清球蛋
白移入 -Pharmacia蛋白质 A层析柱 ,用 0. 1 mol /L
柠檬酸 ( pH3. 0)洗脱免疫球蛋白 Ig G,以 pH7. 0洗
脱液进行超过滤浓缩 , - 20℃贮存于含 0. 02% NaN3
和 50%甘油的 Tris /NaCl缓冲液 ( 50 mmo l /L Tris,
150 mmol /L NaCl, pH7. 8)内。制备羊前海葱苷原
A抗体方法同上。
1. 3　测定 86Rb摄取率
按 Wenzel法进行 [ 6]。
1. 4　 ELISA法测定前海葱苷原 A免疫反应活性 ,
同 Sich发表的方法 [ 6]。
1. 5　统计
统计分析使用美国微软公司的计算机软件
279中国应用生理学杂志 1998; 14( 3)DOI : 10. 13459 /j . cnki . cjap. 1998. 03. 032
Graphpad Prism ( Graphpad Sof tw are, San Diego ,
CA, U SA) B。所有数据以平均值±标准误 (x-± Sx-)
表示。
2　结果
40周后的兔抗前海葱苷原 A血清滴度的 KD值
为 2× 10- 9mo l /L; 46周后的羊抗前海葱苷原 A血清
滴度的 KD值 2× 15- 15。抗前海葱苷原 A抗体与前
海葱苷原 A发生免疫交叉反应 ,而不与哇巴因及其
它物质发生交叉反应 (表 1)。
Tab. 1　 Comparison of the specificities of antibodies against ouabain and pro scillaridin A fr om rabbits and sheep
Substances Anti
-ouabain lgG
f rom rabbit (% )
Anti-proscilla ridin A
lgG fr om rabbit (% )
Anti-pro scillaridin A
lgG fr om sheep (% )
Cardenolides:
o uabain 100. 0 　 0 　 0. 06
k-st rophanthidin 16. 67 　 0. 083 　 0. 06
digitox ig enin 　 3. 95 　N. D. 　 0. 11
digitox in 　 0 　 0. 46 　 0
digoxig enin 　 0. 23 　N. D. 　N. D.
digixig eninsulfa t 10. 0 　N. D 　 0. 58
digoxig enin-3- glucur onid 13. 13 　N. D. 　 0. 44
digoxin 　 0. 19 　 0 　 0. 04
gito xin 　 0. 36 　 0. 047 　 0. 37
conva llato xin 200. 0 　 0. 054 　 0
Bufadienolides:
pro scillaridin A 　 7. 75 100. 0 100. 0
bufa lin 　N. D. * 84. 4 　N. D.
marinobufagenin 　N. D. 　 5. 0 　 4. 37
Other sterold hormones:
co rtiso l 　N. D. 　 0 　N. D.
estradiol 　 0 　 0 　 0
testo sterone 　N. D. 　 0. 1 　N. D.
pro geste rone 　N. D. 　 0. 125 　N. D.
co rtico sterone 　N. D. 　 0 　N. D.
aldo sterone 　 0 　 0 　N. D.
　　* N. D.: none detected
　　 HPLC反相色谱分离图谱见图 1。A,不同保留
时间部分的洗脱液提取物用于人红细胞 86Rb摄取率
的生物活性结果见图 1. B;结果显示 ,与哇巴因保留
时间相似的提取物具有明显的抑制人红细胞 86Rb摄
取率的能力。
提取物用于 ELISA法测定前海葱苷原 A样和
哇巴因样的钠泵抑制因子在牛的各种腺体组织及血
液中的分布。结果显示前海葱苷原 A样和哇巴因样
的钠泵抑制因子在牛的肾上腺和下丘脑呈高水平分
布 (图 2. A和 B)。
3　讨论
已证实在高血压病人的血液中存在一种可与前
海葱苷原 A抗体交叉反应的抗原物质 ,其浓度与脉
压和收缩压相关 [6 ] ,低肾素性高血压病人血液中哇
巴因免疫活性物水平与收缩压和舒张压相关 [1, 8 ]。我
们利用甲醇提取、 Sephadex亲和层析分离、高效液
相色谱纯化得到了钠泵抑制因子提取物 ,利用高滴
度的抗前海葱苷原 A抗体和抗哇巴因抗体 ,检测了
前海葱苷原 A样免疫活性物和哇巴因样免疫活性
物在牛体内的分布。结果表明 ,它们不仅在牛肾上腺
呈高水平分布 ,在下丘脑也呈高浓度分布 (图 2A、
B)。哇巴因样免疫活性物在肾上腺的分布与 Ludens
报道的大鼠结果相同 [10 ] ,在下丘脑的分布与 Tymi-
ak报道的结果相同 [3 ]。这两种免疫活性物在 HPLC
反相色谱柱的保留时间 (图 1)与哇巴因几乎相同 ,有
可能这种反相色谱的分离条件适合于这两种不同的
化合物在同一保留时间的洗脱。有文献报道 ,培养的
280 Chin J Appl Ph ysiol 1998; 14( 3)
人和牛肾上腺细胞可分泌出高于细胞本身含量几倍
的哇巴因样免疫活性物 [9 ];并且在牛下丘脑也纯化
得到了它 [3 ]。因此肾上腺和下丘脑可能是这两种内
源性钠泵抑因子的主要合成部位 ,可以作为提取和
纯化前海葱苷原 A样免疫反应活性物和哇巴因样
免疫活性物的来源。最近又有学者从 20 Kg牛肾上
腺中提取得到具有抑制 Na+ -K+ -A TP酶活性的化
合物纯品 , MW= 600 Da ,λmax= 250 mm ,该物质与
抗前海葱苷原 A抗体交叉反应 ,但几乎不与抗哇巴
因抗体交叉反应 [12 ]。因此推测这种新的钠泵抑制因
子前海葱苷原 A样物质不是前海葱苷原 A,也不是
哇巴因 ,而是一种新的与血压和心血管功能调节有
关的类固醇激素。它的化学特性及其在高血压发病
中的病理生理作用还需进一步研究。
Fig. 1　 Compa rison of the hydrophobicity o f the sodium pump inhibito r f rom bovine adrenal co rtex and its cro ss-reactiv ity
w ith antibodies against ouabain and pro scillaridin A on a reversed phase chromatog r aphy on Lichro spher RP18.
( A) Rev ers ed phase ch romatog raph y of a methanol ex t ract f rom bovine ad renal cortex. The abso rbance at 220 nm is show n and the re-
ten tion times of ouabain and pros cil laridin A are indicated. ( B) Inhibit ion of 86Rb+ uptake in to h uman red blood cell s by individ ual f rac-
tions f rom th e m ethanol ext ract of bovine ad reanl cortex ob tained by rev ers ed ph ase chromatograph y. Mean values and S. E. M . of 3 sep-
arations are given
Fig. 2　 Tissue distribution o f the immuno reactivities fo r antibodies against ouabain and pro scillaridin A in bov ine tissues.
( A) Tis sue dis t ribution of th e imm unoreactivity for an tibodies agains t ouabain in bovine ti ssues. Th e f raction wi th a simi lar retention time
as ouabain in a LiCh rospher C18 column w as tested. Th e number of determinations is indicated in brackets. ( B) Tis sue dis t ribution of the
immuno reactivi ty for antibodies agains t prosci llaridin A in b ovin e tis sues. Th e f raction w ith a simi lar reten tion t ime as ouabain in a
LiChrosph er C18 column w as tes ted. Statis tic signif icance is f rom serum indicated by** P < 0. 01 and * P < 0. 05. Fo r details s ee “ Material
and Meth ods” sect ion
　　在德国 Justus-Libig Giessen大学合作研究期间 ,享受
德国政府资助及德国教育科学研究技术部支持 ,特此致谢。
4　参考文献
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THE DISTRIBUTION OF PROSCILLARIDIN A
IMMUNOREACTIVITIES OF A NEW ENDOGENOUS
Na
+
/K
+ -ATPase INHIBITOR IN BOVINE
Li Suqin, Fu Yunfeng , Schoner W , Eim C
( Hebei Academy of Medical Sciences. Insti tute of Experimental M edicine, Departmen t of Bioch emis t ry, Shi ji azh uang 050021;
Insti tute of Bioch emie and Endok rinologie; Jus tus Libig Universi ty Giess en , Gies een D-35392, Germany)
ABSTRACT
Cardiac g lycosides ar e widely used as r emedy to tr ea t hear t insufficiency. This g r oup of steroids exist with an ca rdeno-
lides o r with a bufadieno lides. Besides an immuno reac tivity fo r an isomer of the cardenolide ouabain cro ss-reactiv ities fo r the
bufadieno lide pro scillaridin A have been show n to exist in blood pla sma and to co rr ela te with blo od pressure. Ther efor e, to
lea rn w hether the tissue distribution pattern o f pr oscilla ridin A and ouabain immuno reactiv ities in the mammals. We used an-
tibodies r aised from rabbits and sheeps against th e bufadienolide proscilla ridin A to measure the concentra tion of cr oss-r eact-
ing materials in bov ine tissues w ith an indirect enzyme-linked imm unoso rbent assa y. The r esults show that bovine hypo thala-
mus and adrenal show the highest concentra tions of pr oscilla ridin A endouabian immunoreactivities as com pared to o ther tis-
sues and se rum.
　　 KBY WORDS　 Endogenous sodium pump inhibitio rs;　 proscillaridin A antibody;　 proscilla ridin A im muno reactiv ities;
　 ouabain antibody
(上接第 249页 )
而产生无复流现象 ,参与 IR肾损伤 ;而 CGRP则通过上述机制 ,参与抗 IR肾损伤的作用。IPC+ IR组同 IR组的肾均经历了
IR损伤的过程 ,但在再灌流 24 h时的 CGRP较 IR组高而 E T较之为低 ,肾组织和功能受损伤的程度较 IR组轻 ,表明 IPC具
有减轻 IR肾损伤的迟发性保护作用。反复短暂的 IR刺激可诱发肾内 CGRP的产生和释放增多 ,同时也可能抑制 ET的释放。
CGRP作为一种内源性保护物质 ,通过拮抗 ET的作用和自身的扩血管效应 ,减轻或防止了缺血后无复流现象的发生 ,参与
IPC对 IR肾的迟发性保护作用。
( 1997-07-28收稿　 1998-03-23修回 )　　
282 Chin J Appl Ph ysiol 1998; 14( 3)