全 文 :北方园艺2011(13):121~124 ·生物技术·
第一作者简介:刘芳伊(1987-),女,在读硕士,现主要从事观赏植
物遗传育种研究工作。
责任作者:尚爱芹(1969-),女,博士,副教授,现主要从事观赏植物
遗传育种及基因工程育种研究工作。E-mail:shangaiqin@
126.com。
基金项目:保定市科技支撑计划资助项目(102C001);河北农业大
学大学生科技创新活动基金资助项目。
收稿日期:2011-04-14
百子莲组培快繁与植株再生
刘 芳 伊,高 永 鹤,尚 爱 芹
(河北农业大学 园艺学院,河北 保定071001)
摘 要:以百子莲为试材,研究了百子莲的无菌播种、组培快繁及植株再生。结果表明:百子
莲成熟种子最佳的消毒方法:70%酒精消毒1min,然后用0.1% HgCl2灭菌3min。将种子接种
在不添加植物调节剂的MS培养基上,发芽状况良好;切取幼苗基部进行增殖培养,增殖的最佳培
养基为MS+6-BA 4.0mg/L+NAA 0.1mg/L。最佳外植体为去根的无菌苗,最佳不定芽分化培
养基为 MS+6-BA 4.0mg/L+NAA 0.1mg/L,其不定芽分化率达92%。在1/2MS+IAA
0.5mg/L培养基上,生根率达80%。驯化移栽后,其成活率达90%。
关键词:百子莲;无菌播种;组培培养;植株再生
中图分类号:S 681.9 文献标识码:A 文章编号:1001-0009(2011)13-0121-04
百子莲属(Agapanthus)植物是一种非常优秀的园
林花卉,原产南非,于1692年从好望角传入英国。
1679年在欧洲第一次发布的百子莲的名字叫非洲水
仙。之后Linnaeus开始提出非洲百合(又叫爱情花)叫
法,直到现在欧美仍沿用此名[1]。它的种类丰富,叶形
秀丽,花朵姿态优美,花期持续时间长。百子莲的抗性
较强,各种土壤类型均可生长,喜湿润土壤,也较耐旱。
目前,人工培育出很多品种,广泛地应用于切花生产、
园林美化、药用成分提取等方面[2-3]。Sakae S.等[4-5]建
立了百子莲遗传转化体系,并试图通过基因工程手段
培育新品种。但我国对百子莲引种栽培较晚,各方面
的研究尚在起步阶段,卓丽环[6]、孙颖[7]等对百子莲的
繁育系统进行了系统研究,但组织培养研究方面的资
料较少,其组培快繁及植株再生尚未见报道。
该研究通过种子在无菌条件下萌发而获得无菌植
株,进一步开展组织培养工作。通过组培快繁,可以周
年生产,在比常规育苗节省大量空间的基础上获得大
量的商品苗,从而满足都市园林绿化的需要,推动此花
卉在我国的广泛应用,增加北方园林绿化苗木种类。
该研究建立了百子莲无性快繁技术体系,为百子莲规
模化育苗、利用基因工程技术实现对百子莲遗传转化
以及改良百子莲种质奠定了技术基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
百子莲品种A.praecoxssp.praecox ‘Floribunda
种植在河北农业大学花卉温室,该研究以其饱满种子
为试验材料。
1.2 试验方法
1.2.1 无菌种子的制备与接种 将百子莲种子从成
熟果实中剥出,自然风干。将种子浸入70%酒精消毒
1min,然后用无菌水冲洗3~4次,随后用0.1%HgCl2
溶液处理(1、3、5、8min),期间不断用玻璃棒搅拌,最
后用无菌水冲洗5~6次,将种子直接接种在以下培养
基上:(1)不含任何激素的 MS培养基;(2)MS+6-BA
0.5mg/L。观察其生长状态,并记录数据。待试管苗
生长至3.0~4.0cm时自基部切下,移至生根培养基,
接种在培养基上在光照条件下进行预培养,待无菌苗
长至4片真叶以上时,切去根部,以上部作为外植体。
1.2.2 接种种子培养基及培养方法 采用 MS培养
基和 MS+6-BA 0.5mg/L,蔗糖30g/L,琼脂7g/L,
pH调整为5.8~6.0。每个三角瓶中接入百子莲种子
10~15个,从接种之日起,接种2周后统计污染率,4
周后统计死亡率、存活率。
1.2.3 试管苗的增殖培养 将无菌幼苗去除根部,接
种到增殖培养基上,以 MS为基本培养基,附加不同浓
度的6-BA、NAA。30d后统计结果。
1.2.4 不定芽的再生 将切掉根系的小苗及叶段(长
1cm),接种到含不同植物激素浓度及组合的 MS培养
基上(激素配比见表2)。每个处理最少接种50个外植
体,3次重复。接种6周后统计不定芽分化率及外植
体平均不定芽个数。
1.2.5 叶片愈伤组织诱导 将叶片切成长约1cm的
小段接种在 MS附加不同浓度2,4-D(1、2、4、8mg/L)
的培养基上,以诱导愈伤组织。
121
·生物技术· 北方园艺2011(13):121~124
1.2.6 再生苗的生根培养 当不定芽长到3cm左右
时,从基部切割下来,转接到附加不同浓度的生根培养
基中进行生根培养。统计其生根率并观察其根系的生
长状况。
1.2.7 培养条件 所有培养均在以下条件下进行:
(25±2)℃,光照强度:1 500~2 000lx,光照时间:14h
光照,10h黑暗。
1.2.8 组培苗训化与移栽 当组培苗生根后,于组培
室中去掉三角瓶的瓶塞,晾瓶7d后,用自来水洗去幼
苗根部的琼脂,移栽于泥炭与蛭石等量混合的营养土
中,先在人工气候箱中缓苗7d,然后置于温室中进行
训化锻练,15d后正常管理。统计成活植株数量,计算
成活率。
2 结果与分析
2.1 不同消毒处理的消毒效果
对于有果实外皮严密包裹的未成熟种子,经过消
毒处理污染率为0,比成熟种子更易获得无菌材料。
而对于成熟的种子,由于果实已经开裂,种子缺乏外界
保护层,部分暴露于空气中,受污染的几率大大增高,
因而消毒处理需要重视。为降低百子莲成熟种子的污
染率,同时又不伤害或杀死种子,设计了以下成熟种子
消毒处理方案,即单纯用酒精消毒和用酒精表面杀毒
后再用升汞进行不同时间的消毒2种不同的消毒处
理。从而选择适宜的灭菌剂,确定该灭菌剂最佳的处
理时间。
由表1可知,方法1中只用酒精做消毒处理
3min,污染率很高,说明只用酒精消毒不能够达到消
毒的效果。方法2中的70%酒精1min+0.1% HgCl2
溶液振荡3min处理使种子污染率较低而萌发率较高
(93.3%),有助于提高初次接种的数量和质量。其余
的处理方法有的由于消毒处理时间过短,导致消毒不
彻底,污染率高;有的由于消毒处理时间过长,导致消
毒过度,污染率虽然为0,但是萌发率偏低,致使种子死
亡。
表1 不同消毒处理方法对种子污染率及萌发率的影响
消毒处理方法 接种数 污染数 污染率/% 萌发数 萌发率/%
70%酒精3min 30 21 70 - -
70%酒精1min+HgCl2 HgCl2/% 处理时间/min
0.1 1 81 30 37 45 55.6
0.1 3 90 3 3 84 93.3
0.1 5 81 0 0 9 11.1
0.1 8 80 0 0 0 0
2.2 不同的接种培养基对种子萌发的影响
将百子莲的种子消毒后无菌条件下接入2种培养
基中,观察其生长情况,记录种子的生长情况(表2)。
从表2可看出,不加任何激素的 MS基本培养基较
MS+6-BA 0.5mg/L的培养基更有利于幼胚的生长
成苗。在不含任何激素的 MS培养基上,该品种的发
芽率比较高,但发芽不整齐,接种的第7天,只有少量
的种子萌发(图1),随着发芽时间的延长,发芽率逐渐
提高,当接种3周左右时,其发芽率达到最高,为88%
(图2)。出现此种情况可能和种子的饱满度有一定的
关系,在以后的试验中还需加强对种子整齐度的进一
步筛选。
表2 2种激素组成对未成熟种子幼胚生长的影响
天数 幼胚生长情况
/d MS MS+6-BA 0.5mg/L
1 接种 接种
5 种子开始膨大 种子开始膨大
7 部分种子开始萌芽 种子膨大而畸形
21
幼苗发芽率达88%,幼苗生长
正常
少数种子萌发,但其幼苗不能正常
生长
2.3 激素及其配比对芽增殖的影响
当幼苗达20~30d时,将幼苗的根系切除,将以
上部分外植体接种于 MS培养基上,附加6-BA、NAA,
图1 接种后7d种子萌发情况(MS)
图2 接种3周后种子的萌发情况(MS)
激素浓度配比及结果见表3。由表3可知,6-BA对百
子莲增殖有重要影响,当6-BA浓度为1.0mg/L,
NAA为0.05、0.1mg/L时,其增殖系数分别为2.2和
3.4,二者差异不明显。但随着6-BA浓度的上升,其增
殖系数逐渐增大,当6-BA浓度为4mg/L,其增殖系数
最大,分别为10和12(图3)。但当6-BA浓度再升高
时,其增殖系数又开始下降。可见6-BA对百子莲的增
221
北方园艺2011(13):121~124 ·生物技术·
殖起着重要作用,而NAA的影响不太显著,但各组合
中0.1mg/L NAA的增殖效果略好于0.05mg/L。因
此百子莲的最佳增殖体系为 MS+6-BA 4mg/L+
NAA 0.1mg/L。
表3 植物生长调节剂组合对芽增殖率的影响
处理
生长调节剂
/mg·L-1
芽增殖的情况
6-BA NAA 接种数/个 增殖苗总数/个 增殖系数
1 1.0 0.05 30 36 2.2
2 1.0 0.1 30 102 3.4
3 2.0 0.05 30 30 5.0
4 2.0 0.1 30 78 6.6
5 4.0 0.05 30 30 10
6 4.0 0.1 30 135 12
7 6.0 0.05 30 30 3.0
8 6.0 0.1 30 45 4.5
图3 接种6周后百子莲的增殖
2.4 不同外植体、不同激素及浓度配比对不定芽形成
的影响
将百子莲根颈和叶片接种于附加不同植物生长调
节物质的培养基上进行愈伤组织和不定芽的诱导。由
表4可知,不同外植体的不定芽再生能力有很大差异,
在相同的培养条件下,以叶片为外植体均没有愈伤组
织及不定芽的形成。以根茎为外植体,不同细胞分裂
素对愈伤组织及不定芽的形成也有很大区别。当根茎
外植体接种2周后,其基部开始膨大,接种3周时有大
量白色愈伤组织形成,接种4周时,有少量不定芽开始
出现(图4),继续培养至6周时,有大量不定芽开始形
成(图5)。该研究中不同浓度的KT和NAA组合均
没有不定芽的形成。不同浓度的6-BA与0.1mg/L
NAA结合,均有愈伤组织及不定芽的形成,当6-BA浓
度为1.0mg/L时,其不定芽再生率仅为40%,外植体
表4 不同外植体、不同浓度及组合的植
物激素对百子莲不定芽再生的影响
处理/mg·L-1 再生率/%
外植体平均
不定芽数目/个
细胞分裂素 生长素 根颈 叶片 根茎 叶片
6-BA NAA
1 0.1 40 0 3 0
2 0.1 72 0 5 0
4 0.1 95 0 12 0
6 0.1 80 0 6 0
KT NAA
1 0.1 0 0 0 0
2 0.1 0 0 0 0
4 0.1 0 0 0 0
6 0.1 0 0 0 0
平均不定芽数只有3个,随着6-BA浓度的提高,其不
定芽再生率快速上升,当6-BA浓度为4.0mg/L时,
其不定芽再生率达到最高,为95%,外植体平均不定芽
数目也达到最多,大多在12个以上,当6-BA浓度再增
加时,其不定芽再生率及外植体平均不定芽数目均有
所下降,因此4.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA是百
子莲不定芽最佳的诱导体系。
图4 接种3周时不定芽的形成
图5 接种6周时大量不定芽形成
2.5 叶片愈伤组织诱导
不同的外植体对不定芽的再生有很大的影响。以
百子莲的叶片为外植体接种在含有不同浓度的细胞分
裂素和生长素的培养基上,没有不定芽的形成,也没有
出现愈伤组织。为了建立以叶片为外植体的再生体
系,试验中再次以2,4-D作为主要生长调节剂来诱导
愈伤组织的形成。2,4-D通常是用来诱导愈伤组织的
生长素,为了得到愈伤组织,该研究将细嫩的叶片切成
约1cm长的小段,接种到含不同浓度2,4-D(1、2、4、
8mg/L)的培养基中,但是各处理均没有任何反应(数
据略),可见百子莲的叶片对植物激素的反应极不敏
感,因此,还有必要进一步研究以叶片为外植体,其愈
伤组织和不定芽再生所需的最佳条件。
2.6 不定芽生根诱导(见表5)
表5 不同培养基对生根诱导的影响
编号 培养基 激素 生根率 均根数 均根长/cm
IBA/mg·L-1 IAA/mg·L-1 /%
r1 MS 0.1 0 54 2 8.2
r2 MS 0 0.1 36 1 5
r3 MS 0.1 0.1 28 2 5.5
R1 MS 0.5 0 33 1 1.5
R2 MS 0 0.5 0 0 0
r4 1/2MS 0.1 0 62 2 3.7
r5 1/2MS 0 0.1 60 2 6.7
r6 1/2MS 0.1 0.1 60 2 3.5
R4 1/2MS 0.5 0 70 2 5.4
R5 1/2MS 0 0.5 80 2 5.7
321
·生物技术· 北方园艺2011(13):121~124
图6 60d后不定芽在培养基上生根状况
2.7 组培苗训化与移栽
当组培苗形成完整根系以后,于组培室中去掉瓶
塞,敞口晾瓶7d,向培养瓶中倒入自来水,摇晃至琼脂
散块。倒入大烧杯,用玻璃棒轻轻搅拌,使再生苗根系
周围的琼脂全部脱落。最后用镊子轻夹小植株,涮洗
苗根部残留的琼脂,移栽到泥炭与蛭石等量混合的营
养土中(图7)中缓苗7d,然后移入温室中锻炼。控制
空气相对湿度从85%左右逐渐降低,开始时注意中遮
荫。移栽后2~3d不见光,以后逐渐增加光照强度和
时间。温度控制在24℃左右。移植后15d调查,再生
苗的平均成活率为90%。15d后移栽于土壤中,进行
正常管理。
图7 移栽成活的幼苗
3 讨论与结论
外植体的类型对组培快繁成功起着重要作用,选
择合适的外植体是成功建立快繁体系的重要前提[8]。
因此,选择带菌少、容易获得的外植体就显得尤为重
要。叶片是组织培养及植株再生常用的外植体,该研
究以叶片为外植体未能得到愈伤组织,分析原因认为
百子莲为单子叶植物,需要生长素浓度较高,其最佳的
诱导体系有待于进一步研究。但以百子莲成熟种子为
试材,能够快速地得到无菌苗。将无菌苗的根系切除,
以上部分作为外植体,获得了较高增殖率。激素是影
响植株再生的一个关键因素。激素的种类和比例对器
官发生起决定作用。该研究中采用了6-BA和 NAA
结合的方法,结果表明,6-BA对百子莲增殖有着显著
的促进作用,而当细胞分裂素采用KT时未能得到再
生植株,至于其它的细胞分裂素和生长素对百子莲增
殖效果如何还有待于进一步研究。
该研究首次建立了百子莲组织培养快繁及植株再
生体系,不仅丰富了自身的基础理论,为基因工程育种
研究提供快速而有效的平台,并且在实际生产中具有
繁殖系数大、繁殖速度快、苗木整齐一致的特点,从而
大大提高了生产效率和经济效益。
参考文献
[1] 张伟艳.百子莲属种子生物学和幼苗生长特性研究[D].哈尔滨:
东北林业大学,2007.
[2] Veale D J H,Havlik I,Oliver D W,et al.Pharmacholgical effects of
Agapanthus Africanus on the isolated rat uterus[J].Journal of
Ethnopharmacology,1999,3(66):257-262.
[3] Kamara B I,Manong D T L,Brandt E V.Isolation and synthesis of a
dimmeric dihydrochalcone from Agapanthus Africanus [J].Phytoc-
hemistry,2005,10(66):1126-1132.
[4] Suzuki S,Supaibulwatana K,Mi M,et al.Production of transgenic
plants of the Liliaceous ornamental plant Agapanthus praecox ssp.
Orientalis(Leighton)Leighton via Agrobacterium-mediated transformation
of embryogenic cali[J].Plant science,2001,1(161):89-97.
[5] Suzuki S,Oota M,Nakano M.Embryogenic calus induction from leaf
explantsof the Liliaceous ornamental plant,Agapanthus praecox ssp.
orientalis(Leighton)Leighton Histlogical study and response to selective
agents[J].Scientia Horticulturae,2002,95:123-132.
[6] 卓丽环,孙颖.百子莲的花部特征与繁育系统观察[J].园艺学报,
2009,36(11):1697-1700.
[7] 孙颖,卓丽环.百子莲的传粉昆虫及其访花行为研究[J].上海农业
学报,2009,25(1):87-91.
[8] 李浚明.植物组织培养教程[M].北京:中国农业大学出版
社,2002.
Tissue Culture and Plant Regeneration of A.praecoxssp.praecox‘Floribunda
LIU Fang-yi,GAO Yong-he,SHANG Ai-qin
(Colege of Horticulture,Agricultural University of Hebei,Baoding,Hebei 071001)
Abstract:The paper reported asepsis sowing,tissue culture,and adventitious bud regeneration of A.praecoxssp.
praecox‘Floribunda.The results showed that the mature seeds of agapanthus treated by 70%ethanol for 1min and
then treated by 0.1% HgCl2for 3min.The medium for the germination of seed was MS without any plant growth
regulators.The optimum medium was MS medium containing 6-BA 4.0mg/L+NAA 0.1mg/L.The shoot
regeneration medium was MS+6-BA 4.0mg/L+NAA 0.1mg/L.On the medium 1/2MS+IAA 0.5mg/L,the
elongated shoots rooted at the rate of 80%and the survival rate was 90%after transplant acclimatization.
Key words:A.praecoxssp.praecox‘Floribunda;asepsis sowing;tissue culture;plant regeneration
421