全 文 ：中国水产科学
Journal of Fishery Sciences of China
第16卷第6期
2009年11月
Vol.16 No.6
November 2009
收稿日期：2009-03-24；修订日期：2009-06-25.
基金项目：国家 863 计 划资 助 项目（2006AA10A413）；国家自然 科 学 基 金 资 助 项目（30571443）； 上 海 市 优 秀 学 科 带 头 人 项目
（07XD14028）；上海市教委重点学科建设项目（J50701）；宁波市重大科技攻关委托项目（200702C1011026）；温州市科技局科技兴海项
目（S20070046）.
作者简介：张鹏（1982-），男，硕士，主要从事海洋生物生理生态学研究 .
通讯作者：严兴洪（1958-），男，教授，博士生导师，主要从事海洋生物生理生态、海藻生物技术和遗传育种研究 . E-mail：xhyan@shou.edu.cn
坛紫菜不同品系亲缘关系的 SSR 标记分析
张鹏 1，2，张源 1，王铁杆 2，3，严兴洪 1
（1. 上海海洋大学 水产与生命学院，上海 201306；2. 浙江省海洋水产养殖研究所，浙江 温州 325000；3. 浙江省近岸水域生物资
源开发与保护重点实验室，浙江 温州 325000）
摘要：利用 SSR 标记对 9 个坛紫菜（Porphyra haitanensis）品系（2 个野生品系，2 个优良品系，2 个杂交品系，3 个色素突变
品系）的丝状体进行了亲缘关系分析。结果表明：从 52 对微卫星引物中筛选出 7 对引物，它们的反应稳定并且其 PCR 产
物具有多态性。9 个品系的平均有效等位基因数（Ne）为 1.716 6，平均期望杂合度（He）为 0.407 4，平均多态信息含量（PIC）
为 0.330 8，Shannon 多样性指数（I）为 0.623 9。用 Nei 氏法计算出这 9 个品系的遗传距离和遗传相似性系数，再用 UPMGA
和 Neighbor-joining 2 种方法所获得的系统学关系图，其结果均基本上反映了各品系间的亲缘关系。在引物 PC-40 界定的
遗传座位上，2 个优良品系申福 1 号和优质 6 号（以申福 1 号为母本选育出来的品系）的丝状体和叶状体均出现了区别于
其他品系的等位基因，显示对这 2 个优良品系进行 SSR 特异性标记是可能的。[ 中国水产科学，2009，16（6）：842-849]
关键词：坛紫菜；品系；亲缘关系；SSR 标记；种质鉴定
中图分类号：Q94　　　　　　　文献标识码：A　　　　　　 文章编号：1005-8737-（2009）06-0842-08
紫菜（Porphyra）属有 130 多个种 [1]，其中的数种
紫菜已被大规模人工栽培，成为海水养殖的重要对
象之一。紫菜的经济价值很高，仅中、日、韩 3 国的紫
菜年产值就超过了 20 亿美元 [2]。在中国大陆被大规
模栽培的紫菜有南方的坛紫菜（Porphyra haitanen-
sis）和北方的条斑紫菜（P. yezoensis）。坛紫菜是中国
特有的种，主要栽培在福建、浙江和广东 3 省。近 5
年来，坛紫菜的年产量约占全国紫菜产量的 75%，所
以，它在中国的紫菜产业中占有十分重要的位置。
近年来，坛紫菜的遗传育种研究取得了长足的进
步，相继建立了人工诱变育种 [3-5]、单性育种 [6] 和杂交
育种等技术 [7]，大大缩短了优良品系的筛选周期，数个
坛紫菜优良品系已在生产中得到了一定规模的应用，
取得了显著的经济效益 [8]。不同的坛紫菜品系，尽管
在体形和颜色上表现出一些差异，但这些差异易受栽
培密度和栽培水域生态因子的影响，所以单靠形态学
特征很难将它们准确地区分开来 [9]。SSR 标记因具有
共显性好、重复性高、多态性丰富等优点，在高等植物
中已成为遗传连锁图谱构建、群体遗传学研究、分子
标记辅助育种、系谱分析、指纹图谱绘制和品种纯度
鉴定等的理想工具 [10]。尽管RFLP [11]、RAPD [12]、AFLP [13]
和 ISSR [14-15] 等分子标记技术已在紫菜不同种或品系
的种质鉴定中得到了初步尝试，但有关紫菜的 SSR 标
记研究并不多 [16-17]。本研究利用 SSR 标记，对已培育
出来的数个坛紫菜品系进行遗传差异和亲缘关系分
析，期望获得部分优良品系的特异性分子标记。
1　材料与方法
1.1　实验材料
所用的 9 个坛紫菜品系名称和代码如表 1 所示，
它们的来源与特性如下：FD 品系为野生型品系，是
从采自福建省福鼎海区的野生叶状体的体细胞再生
第6期 843张鹏等：坛紫菜不同品系亲缘关系的 SSR 标记分析
体中分离而得；XC、SF-1、Q-1 和 SPY 等 4 个品系是
从经诱变处理后的野生型品系（Wt，PT-001）的叶状
体的体细胞再生体中分离得到 [4]；SPY-1 品系是从
SPY 品系里再次分离得到，Y-6 品系是从 SF-1 品系
后代中选育而得。这 7 个品系均是利用叶状体的单
性生殖获得的遗传纯合品系。Z4 品系和 Z7 品系分
别是通过野生型（Wt，PT-001）与红色色素突变体杂
交后获得的杂合品系 [7]。
表 1　本实验所用坛紫菜品系、代码和特性
Tab. 1　Names，codes and characters of Porphyra haitanensis lines used in this experiment
品系序号
Line no.
品系代码
Line code
品系名称
Line name
品系特性
Characters of lines
丝状体
Conchocelis
叶状体
Gametophytic blade
1 Q-1 浅色突变体 纯合 颜色比野生色更浅，早成熟
2 SF-1 申福 1 号 纯合 颜色与野生色相似，晚成熟
3 Z4 杂交 4 号 杂合 亲本色块与重组色块嵌合体
4 Z7 杂交 7 号 杂合 亲本色块与重组色块嵌合体
5 FD 野生型 -FD 纯合 野生色，正常成熟
6 XC 野生型 -XC 纯合 野生色，细长型，正常成熟
7 SPY 红色突变体 纯合 颜色比野生色红，早成熟
8 SPY-1 红色突变体 -1 纯合 颜色比野生色红，早成熟
9 Y-6 优质 6 号 纯合 颜色与野生色相似，晚成熟，耐高温
上述品系的丝状体培养条件：温度为（23±1） ℃，
光照密度为 15∼ 30 μmol·m-2·s-1，光周期为 10L：14D，
培养基为 MES [18]，每 2 周更换 1 次，各品系的叶状体
培养方法同于文献 [4]。
1.2　基因组DNA的提取
采用改进后的 LiCl 法 [19-20] 提取坛紫菜丝状体
和叶状体的基因组 DNA，用 BioPhotometer 生物分光
光度计测定 DNA 的 OD 值和浓度，并在 1.0% 琼脂
糖凝胶上电泳，用凝胶成像系统拍照。
1.3　微卫星引物筛选
用于 9 个坛紫菜品系丝状体遗传多样性分析的
微卫星引物共 52 对（表 2）：12 对引自刘必谦等 [16，21]
发布的微卫星引物，26 对引自 Sun 等 [17] 发布的微卫星
引物，3 对引自胡则辉等 [22] 发布的微卫星引物，以及根
据 GenBank 中的坛紫菜微卫星序列设计的引物 11 对
（引物以 GenBank 注册号命名）。以上引物均由上海生
物工程技术服务有限公司合成。先以 4 个不同品系
的丝状体（Q-1、SF-1、Z4 和 Z7）DNA 样品为模板，对所
有的微卫星引物进行 PCR 筛选（重复 2 次），从中选择
扩增稳定且条带清晰的微卫星引物，然后对 9 个坛紫
菜品系的丝状体进行微卫星 DNA 的遗传多样性分析。
1.4　PCR扩增及电泳
PCR 反应在 PCR 仪（德国，Eppendorf Mastercycler ep）
上进行。PCR 总反应体系为 15 μL，内含 10×PCR
buffer （1.5 μL），2.0 mmol/L MgCl2，0.15 mmol/L dNTP
（每种），20 ng 的 DNA 模板，1U Taq DNA 聚合酶，微
卫星正反向引物各 40 pmol。
PCR 反应程序为：94 ℃变性 8 min；接 35 个循
环为 94 ℃ 30 s，退火 35 s（退火温度因引物而定），
72 ℃ 45 s；72 ℃ 最后延伸 8 min，4 ℃保存。在 PCR
扩增产物中加入 2 μL 加样缓冲液，混匀后吸取 5 μL，
在 8% （W/V）非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，电泳缓
冲液为 1×TBE，250 V 恒电压下电泳约 2.5 h。电泳
结束后，进行银染检测 [23]，统计条带并拍照。
1.5　数据统计分析
根据电泳图谱，并参照引物设计时预期片段的
大小统计条带，应用软件 POPGENE 1.32 进行分析，
并统计以下参数：遗传相似性系数（GS）、遗传距
离（GD）、有效等位基因数（Ne）、期望杂合度（He）和
Shannon 多样性指数（I）。
844 第16卷中 国 水 产 科 学
1.6　聚类分析
根 据 计 算 得 出的 遗 传 距 离，应 用 UPMGA 和
Neighbor-joining 2 种方法对 9 个品系的坛紫菜进行
亲缘关系聚类，使用的软件为 MEGA 4.0。
2　结果与分析
2.1　坛紫菜丝状体和叶状体的DNA提取
如图 1 所示，由 LiCl 法提取的坛紫菜丝状体和
叶状体基因组 DNA，经 1.0％的琼脂糖电泳检测，分
子量大约为 23.1 kb，OD260/OD280 在 1.7∼ 1.9 之间，可
满足 SSR-PCR 扩增的需要。
2.2　引物的选择和扩增结果
从 52 对 微 卫 星 引 物 中 筛 选 出 PC11、PC21、
PC24、PC28、PC40、Ph148a 和 DQ831196 等 7 对反
应稳定、多态性较好且杂带较少的引物，其扩增结果
如图 2 所示。7 对引物在每一个品系中均可扩增出
稳定的条带，扩增片段大小在 100∼ 350 bp 之间。
23 130
bp M 1 2 3 4 5 6 7
A
23 130
bp M 1 2 3 4 5 6 7
B
图 1　用 LiCl 法提取的坛紫菜丝状体和叶状体基因组 DNA 在 1.0％的琼脂糖电泳检测结果
M：DNA/Hind III 分子量标准；A：丝状体基因组 DNA；B：叶状体基因组 DNA
Fig. 1　Agarose gel photograph of total DNA extracted from conchocelis and blades of Porphyra haitanensis with LiCl
M：DNA/Hind III Ladders；A：Genomic DNA extracted from conchocelis；B：Genomic DNA extracted from blades
bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
300
200
100
Ph 148A
bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
300
200
100
DQ 831196
bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
PC28
300
200
100
PC 11
bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
300
200
100
bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
400
300
200
PC 21
bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
300
200
100
PC24
bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
300
200
100
PC40
PC40-265
图 2　7 对 SSR 引物在 9 个坛紫菜品系丝状体中的扩增结果
M：DL100 分子量标准；1-9 泳道：Q-1，SF-1，Z4，Z7，FD，XC，SPY，SPY-1，Y-6；图中以“ ] ”标注统计条带的范围
Fig. 2　Electrophoresis results by 7 microsatellite primer-pairs in 9 lines of Porphyra haitanensis conchocelis
M：DNA maker DL100；Lanes 1-9：Q-1，SF-1，Z4，Z7，FD，XC，SPY，SPY-1，Y-6. The range of statistic bands is marked by “ ] ”
第6期 845张鹏等：坛紫菜不同品系亲缘关系的 SSR 标记分析
表 2　52 对 SSR 引物序列和特异退火温度
Tab. 2　Sequence of 52 pairs of microsatellite marker primers used in this study and specific annealing temperature of PCR amplification
基因座位
Locus
上游引物（5′-3′）
Forward primer sequence（5′-3′）
下游引物（5′-3′）
Reverse primer sequence（5′-3′）
退火温度 /℃
Annealing temperature
AU188905 CGTCGTCAACTTCCTCTTCC CCTCCCACTCAGTCTGCGTA 56
AU196122 TGCTCTTGTCCTAAACCCAT CGTGTTGATGCTCGTCGTGC 55
AU195385 TCCAGCAGACGGGAGAAAGA CCGATACACCTGTTACGCCT 58
AU192492 GGCACAGGCTCAGCAAGTA TATGCCACGGATGTAAGGAGG 56
AU192094 CGTCGCTTCCGTCGCTGTCT TAGTTGGTGTTGTGCGTTGA 57
AU187410 AGCCCGTTGGCGAAATCC TACTGGGTTGCTGTGCTCTGTT 61
AU191289 TTCCAGCAGACGGGAGAAAGAC CCGATACACCTGTTACGCCTC 59
AU196400 TATCCGAAACACTATCGCTCCC CCCAGACGCCGCCAATGCT 59
AU193408 GGTGTCAGCGGTGGTGTTGG TAGAGGTFFFCTTAGTGGCAG 61
AU194267 GCCCACGCAAGTGTTTACCC GGAAAGTATGTTGTCGGTCGGG 58
AV435669 TCTTGTTCCTTGACGACTGG GATGGTGGCAGTGGCAGATG 57.9
AV432452 CCAACGATGGGTTTCTTCAA ACTTCATGCCCCTGCCGATG 57
PC01 TTCGCTGCGTTTCACCTTACATTT ACAAGGCCAACCCGAACACA 61
PC02 GGCTGCGGCTGAGTCACAGA GTCGCTCCAACTCCTCCTGCT 63
PC03 GAAGATGCCGGTGCCAAGATT GTCCATGTCCTCCTTGAGCG 60
PC04 TGGTGCTGTCTTCCAACGAGT CGGCTGTCGCACCTCGTTATA 60
PC05 CCCGTGGAGCTCCTTCATCA TCTCCCATGACAGGTTGCCA 60
PC06 CCGTGGAGCTCCTTCATCAT CTCCCATGACAGGTTGCCA 58
PC07 GCTGCCATGGATGCGGAA A TACCCAGCATTGGCCTTGCT 60
PC08 GTGTGGTAATTGGACGAGGAC AGCGACAACGAGGGCAGA 59
PC11 CGCTCAACCACTTCGTCAG CATTGTTGGCGTTGTTGTCATA 57
PC13 CCGTCGTCAGCAGGAGCA ATGTGAGAAGCCAGTAGGGAAAGT 60
PC15 GCCTCA AATGCTTTCTCCACAG CCTTGTTTCGTGTTCTTGCTGC 60
PC16 GCCTCTGACAAGACCTTCAC TCACGGTCACTGTCTTGGT 57
PC18 CGGATGGTGACTTTGGTGGCTA GACGCAAACGCAGCCACTATTAT 61
PC19 CATTGGTTCCATCTACTCCTTT TCTTTTGATCAGACAGCACCTT 55
PC21 TGACTTCCTCATCGACATTGT GCCATAGTACATTTGTTGCTG 57
PC23 CGGACATGATGTTTAGTGACGA GGCAAGCTGAGACGATGAC 58
PC24 GGAAATCCGTTTGACACCCTT TTGGACGTGAAAGACTGAGCA 58
PC27 GCCAGCAACAAATGTACTATG CCGTCAGGCAGAAGAGAAT 56
PC28 GTAGGGGGCGTCGATAGGTA CATGGCACGAGCAAGATGAA 58
PC34 ACGGGCTTCTACGACTACAAT GACGACTTGTGCAGGTTGTT 58
PC36 GCTACGCGTTTGGCTACGAG CGGTGGACGTTGTTCTGCTG 61
PC37 CGTGCTACTACGGCTACAAGG GATGTTGCTCGCGTTCTCGTA 60
PC38 CGTGCTACTACGGCTACAAGGA CTCGCGTTCTCGTAGCCAAAC 61
PC39 CGTGCTACTACGGCTACAAGGA GACGACTTGTGCAGGTTGTTCT 60
PC40 CCGTGCTACTACGGCTACAA GTCCGGTGCAGGTTGTTCT 60
PC41 GCTACGCGATGGGCTTCTA GACCGGTGCAGGTTGTTCT 58
Ph026 ATCGCCGCCGCAATGAG GTCTGGACTATGGCGGCATCA 54
Ph148a CCACTGGCTCAATGATGCGGTAA TCCACCCCTGCCTTGACTGC 55
Ph148b TGCGGACGGACCACGAGAA GCCCACCGAGACACGCAAAC 50
DQ831196 CGAACGGTGCCACCATCA CGCACGCTTGAGGCACAT 58
DQ831197 TGTCCCATCCGTGGCTGTT CGAGCATCAGGCGGAGAT 59
DQ831194 CGTGCGAGTCATAGTCTGC CAGCCAGTGCAAGAACACCTCA 58.5
DQ831185 CTTGCACCTGGGAAGTCAGA TCGCCCGTGCTTCTGCTA 58
DQ831174 CATCAGGCGGAGATGGCTAG CCGTCACGGAACCGATTGT 58
DQ831164 TTGGACGGACGGTGTCGT GCGGTAAGGAGTGCTGGTG 58
DQ831162 CAGTGAGAAATGCAGCAAGGC CAGGACCAGTGGTGACAGGACA 59
DQ831155 AGTGGCGACAGGACAAGGG ACAGTGAGAAATGCAGCAAGG 58.5
DQ831191 CAGCTCGTTGCGGCAGAT CGCACGCTTGAGGCACAT 59
DQ831163 AAACTTCCTGGGTGTTCC GTCTTGTCAAAGCCAAATACTG 58
DQ831165 CTCGTTGGACGGACGGTGTC TCGGCGGCAAAGTGATGG 59
846 第16卷中 国 水 产 科 学
2.3　有效等位基因数、遗传杂合度和多态信息含量
9 个坛紫菜品系间的平均有效等位基因数为
1.716 6，平均期望杂合度为 0.407 4，Shannon 多样
性指数指数为 0.623 9。从位点来看，多态信息含
量最高的微卫星座位为 DQ831196（0.371 9），最低
为 PC21（0.239 2）。7 个微卫星座位的 PIC 平均为
0.330 8，中度多态性座位（0.5>PIC>0.25）占总遗传座
位的 85.7%，低度多态性座位（PIC<0.25）占总遗传座
位的 14.3%。上述结果表明，所选微卫星座位基本处
于中度多态性，遗传变异较小。
2.4　遗传距离、遗传相似指数和聚类分析
9 个坛紫菜品系的遗传相似指数在 0.206 7 至
0.958 5 之间，平均为 0.700 5；遗传距离在 0.042 4 至
0.898 3 之间，平均为 0.391 1（表 3）。
根据各品系间的遗传距离进行 UPGMA 聚类分
析（图 3A），这 9 个品系可聚成 3 个大群，SF-1 和 Y-6
聚合为一群，Z4 和 Z7 聚合为一群，在剩下的一群中
SPY 和 SPY-1 以及 XC 和 FD 分别聚为一群，然后与
剩余的 Q1 聚为一群。对该遗传距离进行 Neighbor-
joining 聚 类 分 析（图 3B），除 Q-1、FD、XC、SPY 和
SPY-1 之间的关系发生了变化外，其余的结果与前面
相似。Z4 和 Z7 聚为一群，SF-1 和 Y-6 聚为一群，剩
余的 Q-1 和 SPY 首先聚为一群，然后再与 SPY-1、FD
和 XC 聚为一群。
表 3　9 个坛紫菜品系的遗传距离（GD）
Tab. 3　Genetic distances （GD） among nine lines of Porphyra haitanensis
品系 Line Q-1 SF-1 Z4 Z7 FD XC SPY SPY-1 Y-6
Q-1
SF-1 0.7985
Z4 0.6920 0.2400
Z7 0.8923 0.4581 0.1003
FD 0.2863 0.3404 0.2827 0.6131
XC 0.2719 0.6202 0.2624 0.2192 0.0567
SPY 0.0645 0.6444 0.4407 0.8328 0.0527 0.1293
SPY-1 0.1965 0.6020 0.3312 0.6828 0.0638 0.1252 0.0424
Y-6 0.8983 0.0527 0.1873 0.2336 0.2877 0.4133 0.7458 0.6828
图 3　9 个坛紫菜品系的聚类分析图
A：UPGMA；B：NJ
Fig. 3　Cluster dendrogram of 9 lines of Porphyra haitanensis based on genetic distances
A：UPGMA；B：NJ
A
0.25 0.20 0.15
FD
XC
SPY
SPY-1
Q-1
SF-1
Y-6
Z4
Z7
0.10 0.05 0.00
B
Q-1
SPY
SPY-1
FD
XC
SF-1
Y-6
Z4
Z7
0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00
第6期 847张鹏等：坛紫菜不同品系亲缘关系的 SSR 标记分析
2.5　特异性标记
如图 2 所示，在 PC-40 引物界定的遗传座位上，
申福 1 号（SF-1）以及优质 6 号（Y-6）均出现了区别
于其他品系的等位基因（PC40-265）。为了证明这一
条带的稳定性和可靠性，重新用 PC40 引物对 2 个品
系的丝状体和叶状体进行了分析（图 4A），结果显示，
这一特异等位基因分别在这 2 个品系的丝状体和 16
个不同的叶状体个体中出现且较稳定。另外，为了
进一步验证该标记的应用价值，用 PC40 引物分别对
野生品系（Wt，PT-001）的丝状体和不同的叶状体个
体也进行了分析（图 4B），结果显示在 Wt 品系中没
有出现与 PC40-265 相同的等位基因。
3　讨论
SSR 标记因具有共显性好、重复性高、多态性
丰富等优点，已被广泛应用到拟南芥、烟草、水稻、玉
米、小麦、白杨、松树、苹果、桃等模式生物和主要农
作物的研究中，并取得了很多研究成果。但是，在紫
菜的相关研究中还未得到广泛的应用，其主要原因
在于紫菜 SSR 引物的开发还处在一个较为初级的阶
段。刘必谦等 [16，21] 最先从条斑紫菜 EST 数据库中
筛选出微卫星位点，并对 8 个坛紫菜品系的丝状体
进行了微卫星 DNA 指纹扩增。SUN 等 [17] 用类似的
方法，用 SSRIT 软件分析了总共 20 799 个紫菜 EST
序列，发现了 391 条 SSR 序列，并设计了 48 对 SSR
引物，根据得到的 SSR 数据建立了 22 个紫菜品系的
进化系统树和 DNA 指纹。胡则辉等 [22] 先用 Sau3AI
限制性内切酶消化坛紫菜基因组 DNA，然后用构建
坛紫菜小片段基因组文库的方法，进行了微卫星序
列的初步筛选。
本研究利用 SSR 标记，对 9 个不同坛紫菜品系
的遗传变异和亲缘关系进行了分析。9 个品系的遗
传相似指数平均为 0.700 5，说明品系间的亲缘关系
较为接近，而个别品系之间的遗传相似指数达到了
0.9 以上，说明它们之间总体的变异程度不是很明显。
多态信息含量（PIC）和杂合度（H）都是表示遗
传变异程度的大小，当 PIC>0.5 时该座位为高度多态
bp M SC 1 2 3 4 5 6 7 8 SB 9 10 11 12 13 14 15 16
PC40-265
B
bp M SC 1 2 3 4 5 6 7 8 YC 9 10 11 12 13 14 15 16
300
200
100
A
PC40-265
图 4　引物 PC40 对坛紫菜 SF-1、Y-6 和 Wt 品系的丝状体和叶状体的扩增结果
A：引物 PC40 对 SF-1 和 Y-6 品系的扩增结果 . M：DL100 分子量标准；SC 和 YC 泳道分别为 SF-1 和 Y-6 品系的丝状体 DNA 扩增结果；
1-8 泳道：SF-1 品系的不同叶状体个体的扩增结果；9-16 泳道：Y-6 品系的不同叶状体个体的扩增结果 .
B：引物 PC40 对 SF-1 和 Wt 品系的扩增结果 . M：DL100 分子量标准；SC 和 SB 泳道分别为 SF-1 品系的丝状体和叶状体个体 DNA 扩增结果；
1-8 泳道：Wt 品系的丝状体扩增结果；9-16 泳道：Wt 品系的不同叶状体个体扩增结果 .
Fig. 4　The electrophoresis results by primer PC40 in lines of SF-1，Y-6 and Wt in Porphyra haitanensis
A :The electrophoresis results by primer PC40 in SF-1 and Y-6 lines. M：DNA maker DL100；Lanes SC and YC：the electrophoresis results of conchocelis of
SF-1 and Y-6 lines，respectively；Lanes1-8：the results of different blades of SF-1 line；Lanes 9-16：the results of different blades of Y-6 line.
B：The electrophoresis results by primer PC40 in SF-1 and Wt lines. M：DNA maker DL100；SC and SB Lanes：the results of SF-1 line of conchocelis and
different blades，respectively；Lanes 1-8：the results of conchocelis of Wt line；Lanes 9-16：the results of different blades of Wt line.
848 第16卷中 国 水 产 科 学
座位，当 0.5>PIC>0.25 时该座位为中度多态座位，当
PIC<0.25 时该座位为低度多态座位 [24]。在本研究
中，7 个微卫星座位的 PIC 平均为 0.330 8，属于中度
多态性，期望杂合度平均为 0.407 4；PIC 较低、杂合
度较小说明品系间遗传变异较小，9 个品系在相应的
微卫星座位上的杂合子比例较小，基因座位的纯度
较高。造成这一结果的原因可能有两个方面：1） 选
用的 9 个品系中除野生型 -FD 品系外，其余的品系
均是从同一个野生品系利用人工诱变的方法直接分
离或再将获得的突变体与原来的野生型杂交后获得
的，所以尽管它们是经诱变后被选育出来的，但基因
的同源性可能还是很高的；另外，它们中的 6 个品系
均是经过单性生殖获得的纯系，即使 Z4 和 Z7 两个
杂交品系也是 2 个纯系间的杂交品系，这样就大大
地减小了品系自身遗传基因的差异程度。2） 由于实
验中大部分的引物来自紫菜的 EST 序列，也可能造
成了相应的微卫星位点的 PIC 较低 [20]。聚类分析的
结果较真实地反映了这些品系间的亲缘关系，反过
来也说明利用这些微卫星位点进行的亲缘关系分析
结果，其真实性是较高的。
在引物的筛选过程中，发现很多引物的扩增结
果并不能让人满意，一些引物扩增出了期望片段以
外的条带，这些条带一般认为是由 PCR 反应中常见
的非特异性扩增产生的，也有报道认为它们是与微
卫星相关的非特异扩增假阳性带，即影子带（Shadow
band）和异源核酸双链分子（Heteroduplex）[25]。
影子带总是伴随特异带型一起出现，形成原因
虽然有多种不同的解释，一般认为是由于在聚合酶
延伸反应过程中发生与模板链脱离，形成滑动错位
所致 [25]。Heteroduplex 条带的出现一般认为是由于
等位基因之间的同源性，在退火过程中等位基因间
彼此复性，形成异质核酸杂交分子，非精确配对的部
位形成突环，导致电泳迁移率低于正常配对产物而
产生的 [26-28]。一般采用降低 Mg2+ 浓度以及改变反
应延伸的温度等技术手段来减少以上条带的出现。
除以上情况产生的多条带外，紫菜微卫星侧翼
序列是否保守也是一个不容忽视的因素。例如，刘
必谦等 [29] 用条斑紫菜 EST-SSR 引物在坛紫菜上进
行种间扩增时，出现的假阳性带经回收测序确定为
非微卫星片段。因此，可以认为部分紫菜微卫星侧
翼序列存在不保守的可能性，进而造成了假阳性条
带的出现，对于此类条带是应当排除在统计之外的。
Y-6 品系是从 SF-1 品系的无性克隆系里筛选出
来的，所以这 2 个品系的丝状体和叶状体在 PC40 座
位上都很稳定地出现了特异的等位基因；同时用野
生品系进行验证试验发现，在野生品系的丝状体和
叶状体中均没有出现此等位基因，这说明它是一个
较为可靠的分子标记，有可能成为 SF-1 和 Y-6 品系
的特异分子标记，这对它们的种质鉴定和产权保护
均具一定的价值。另外，由于这个 SSR 标记来源于
EST 序列，因此很有可能与特殊的功能基因相关，其
分子序列等有待进一步研究。
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Phylogenetic relationship of the lines of Porphyra haitanensis （Rhodophyta，
Bangials） determined by microsatellite DNA markers
ZHANG Peng1，2，ZHANG Yuan1，WANG Tie-gan2，3，YAN Xing-hong1
（1. College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；2. Zhenjiang Marineculture Research
Institute，Wenzhou 325000，China；3. Zhejiang Key Laboratory of Exploitation and oreservation of Coastat Bio-resource,Wenzhou 325000，
China）
Abstract：Molecular analysis of nine different lines （2 wild-type，2 improved varieties，2 hybrid and 3 pigmentation
mutants） of Porphyra haitanensis with microsatellite markers was performed. Results showed that 7 SSR primer-pairs
selected from a total of 52 SSR primer-pairs gave good amplification patterns. Effective number of alleles，expected
heterozygosity and Shannon’s Information index was 1.617 4，0.377 6 and 0.523 1，respectively. Genetic distances
and genetic similarity were calculated using Nei’s matching coefficient. Phylogenetic relationship analysis of UPMGA
and Neighbor-joining based on Nei’s genetic distance showed a good truly relationship among these lines. Samples
of conchocelis and gametophytic baldes of both SF-1 and Y-6 （isolated from SF-1 line） lines had a unique allele on
PC40 locus，indicating that it can be used as a marker to distinguish these two lines from the others. [Journal of Fishery
Sciences of China，2009，16（6）：842-849]
Key words：Porphyra haitanensis；SSR；genetic analysis；germplasm identification；line
Corresponding author：YAN Xing-hong. E-mail：xhyan@shou.edu.cn