全 文 ：2006年　　　　　　　 海 洋 湖 沼 通 报
Transactions of Oceanology and Limnology
№ 3
文章编号:1003-6482(2006)03-0067-06
长菱形藻(Nitzschia longissima)和新月细柱藻
(Cy lindrotheca closterium)分子分类研究*
李海涛 ,杨官品* ,石媛嫄 ,吴岁寒 ,孙　颖
(中国海洋大学海洋生命学院 ,山东 青岛 266003)
摘要:本研究自胶州湾分离了两种底栖硅藻 ,形态学初步鉴定为长菱形藻和新月细柱藻。对
其 18S rDNA 和 rbcL 基因进行了测序并用邻接法构建了系统树。结果表明 ,两藻在 18S rD-
NA和 rbcL 基因序列上均存在较大的差异 , 基于 DNA 序列的分类结果与形态学分类结果一
致。在依据形态指标难以确定藻类分类地位的情况下 , 18S rDNA 和 rbcL基因序列是有用的
鉴定工具。
关键词:长菱形藻;新月细柱藻;18S rDNA;rbcL基因;分子鉴定
中图分类号:Q949. 27+1　　　　文献标识码:A
硅藻(Diatom)的种类鉴定主要依据形态学特征 ,如硅质外壳的构造和对称方式 、外壳上
突起的类型 、数量和排列方式 、有性生殖方式以及壳缝的有无等 。近年来 ,随着分子生物学技
术的发展 ,核糖体 RNA 基因(ribosomal RNA gene , rDNA)和核酮糖 1 ,5 -二磷酸羧化 /氧化
酶大亚基基因(ribulose - 1 , 5 - bisphosphate carboxylase /oxygenase la rg e subuni t g ene ,
rbcL)等已广泛用于藻类系统发育学研究[ 1-4] 。在确定有争议的种类分类地位时 ,仅依靠形态
学指标有时会非常困难 ,而核糖体 RNA 基因 、rbcL 等基因的序列在种内变异很小或没有变
异 ,因而成为种类鉴定的有力工具[ 5] 。
长菱形藻(N itzschia longissima)和新月细柱藻(Cy l indrotheca closterium)是胶州湾近岸
长年均可采集到的底栖单细胞硅藻 ,也是进行贝类苗种培育的重要饵料生物[ 6-8] 。然而在光镜
下区分新月细柱藻和长菱形藻这两种在形态上非常相近的种十分困难[ 9] 。由于形态上的相似
性 ,也有人将新月细柱藻划分到菱形藻属[ 8-10] 。此外 ,环境条件变化会引起形态变异 ,藻生活
史不同时期形态上也存在差异 。本文以分离自胶州湾的长菱形藻和新月细柱藻为材料 ,在形
态鉴定的基础上 ,我们依据 18S rDNA 和 rbcL 基因的序列信息对其进行了分子鉴定。形态和
分子两方面的鉴定结果一致。
1　材料和方法
* 基金项目:国家自然科学基金项目(40176028;30471318)
*通讯作者:Tel:0532 - 82031636 , E-mail:yguanpin@m ail. ou c. edu. cn
第一作者简介:李海涛(1981-),男 ,硕士生 ,研究方向为分子生态学
收稿日期:2005-04-07
DOI牶牨牥牣牨牫牴牳牬牤j牣cnki牣cn牫牱牠牨牨牬牨牣牪牥牥牰牣牥牫牣牥牨牥
1. 1　实验藻株分离及培养
于 2004年 8月 ,采集青岛栈桥附近潮间带泥沙 。将少量泥沙与海水充分混合搅拌 ,弃去
泥沙 ,用密筛绢滤除杂质即获得藻液。吸取所得藻液于培养液中进行预备培养 。待藻类开始
大量繁殖时 ,将培养液稀释到约每微升一个藻细胞 。取 1μL 稀释藻液 ,滴加在盖玻片上 ,在显
微镜下确定细胞数。若只有一个细胞 ,则将该滴藻液连同盖玻片放入盛有培养液的培养瓶中
培养 。用相同方法进行第二或第三次纯化 ,建立起新月细柱藻藻株 MGB0501和长菱形藻的
单克隆培养体系 。实验所用培养液采用 f /2 营养盐配方 ,同时添加 Na2SiO 3(终浓度 10mg /
L)。培养用天然海水经脱脂棉过滤并煮沸 15min ,冷却后添加营养物质 。培养温度为(21±
1)℃,光照 4 000 lx ,光暗比(L ∶D)14h∶10h 。
1. 2　DNA提取及 PCR扩增
离心收集处于指数生长期藻细胞 ,用 CTAB法提取基因组总 DNA ,酚 、氯仿抽提纯化[ 11] 。
PCR反应体系为 50μL ,其中含有 2. 0U T aq DNA 聚合酶 、0. 2mM dNT P(每种)1μL 、10μmo l/
L 正 、反向引物各 1μL 、1xPCR缓冲液和 25mmol /L MgCl24μL。热循环条件为:95℃预变性
3min;接 94℃变性 1min , 55℃复性 1min , 72℃延伸 1. 5min 共 30 个循环;再在 72℃延伸
10min 。用于扩增 18S rDNA 的引物序列为:SSUF 5′-CTG G TT GA T CCT GCC AG-3′和
SSUR 5′-C(C /T)G CAG G TT CAC CTA C-3′[ 12] 。用于扩增 rbcL 基因的引物序列为 rbcLF
5′-CG(G /T) TAC GAA TCT GG(A /T)G-3′和 rbcLR 5′-CCA AT(A /T)GTA CCA C CA
CC(A /G)AA T -3′。
1. 3　18S rDNA及 rbcL基因 PCR扩增产物的克隆与测序
割胶回收 PCR扩增产物 ,与载体 pMD18-T(大连宝生物)连接 ,转化感受态 JM109 ,获得
18S rDNA 及 rbcL 基因的克隆文库 。随机挑选克隆子 ,由上海博亚生物技术有限公司测序 ,
测序使用 3730自动测序仪。测序结果提交 GenBank ,获得收录号:N. longissima 18S rDNA
gene , AY881968;N. long issima rbcL gene , AY881967;C. closterium 18S rDNA gene ,
DQ019446;C. closterium rbcL gene , DQ019445。
1. 4 序列的系统学分析
用在线 BLAST(http:/ /www . ncbi. nlm. nih. gov /BLAST)对所测序列进行分析的基础
上 ,选取 GenBank中近缘藻序列与所测得序列一起用 DAMBE 软件 (version4. 1. 19 , ht tp:/ /
www . aix l. uot taw a. ca /)进行多序列对位分析 ,用 MEGA(version 2. 1 , ht tp:/ /www . Megas-
o f tw are. net /)软件以邻接法(Neighbor-Joining , NJ)分别依据 18S rDNA 和 rbcL 基因序列构
建系统树 。重复 1000次计算靴带值(boo tst rap value)。
2　结果与分析
2. 1　形态学描述
长菱形藻和新月细柱藻均为长形 ,可运动 ,细胞两端具较长的突出 ,叶绿体两个(图 1)。
长菱形藻长 83 ～ 85μm ,宽 5 ～ 6μm ,正面观突出呈 S型弯曲 ,侧面观细胞突直且突出较宽 。新
月细柱藻藻株 MGB0501长 48 ～ 51μm ,宽 3 ～ 4μm ,突出向同一方向弯曲成弓形 。
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图 1　长菱形藻和新月细柱藻在显微镜下的形态特征(A , N. longissima 正面观;
B , N. longissima 侧面观;C , C. closterium S train MGB0501)
F ig . 1　Light microscopic images o f N. longissima and C. clo ste rium (A , N. longissima in v alv ar view;
B , N. longissima in g ir dle view ;C , C. closterium St rain MGB0501)
2. 2　序列测定结果与分析
长菱形藻和新月细柱藻的 18S rDNA PCR扩增片段连同引物区分别为 1777bp 、1775bp ,
在四个位置上发生了碱基插入 /缺失 ,49个位置发生碱基替换。两藻的 rbcL 基因扩增片断连
同引物区长 1190bp ,有 93个位置发生碱基变异 ,其中 75个(占 80. 65%)发生在密码子的第三
位碱基上 。两藻的 rbcL 基因序列在碱基组成上均为 T >A>G>C ,具有较高的 A+T 含量 ,
长菱形藻和新月细柱藻的 A +T 含量分别达到 62. 18%、62. 52%。密码子第三位的碱基组成
亦为 T >A >C >G ,具有更高的 A +T 含量 , 密码子 NNA 、NNT 在两藻株中分别达到
79. 04%和 81. 06%。将长菱形藻和新月细柱藻 MGB0501的 rbcL 基因翻译成蛋白质序列后
比较发现 ,两者共有 15个氨基酸位点不同 ,其氨基酸变异程度明显小于核苷酸变异 。
rbcL基因还存在非常明显的密码子使用偏好性 ,根据藻株 MGB0501的 rbcL 基因序列推
导出的 396个氨基酸残基中有 36个亮氨酸 ,其中有 35个(97. 22%)由 UUA 编码 ,编码甘氨
酸的 38个密码子中 GGU 占 35 个(92. 11%),编码精氨酸的 23 个密码子中 CGU 占 21个
(91. 30%)。长菱形藻 rbcL基因的密码子使用情况与之大致相似。
2. 3　系统学分析
依据 18S rDNA 序列通过邻接法构建的系统树(图 2)能够很好地反映长菱形藻和新月细
柱藻的系统分类学地位。 N. longissima与菱形藻属的其它种聚为一组 ,靴带支持率为 86%。
所有的细柱藻聚为另一类群 , 靴带支持率为 98%。细柱藻明显分为两个支系(lineage):
MGB0501与 C. closterium(AY866417),C. closterium(M87326),C. closterium(AY866418)
形成一个支系 ,靴带支持率为 100%;N. closterium(=C. closterium , AY485455)与 C. f usi-
formis形成另一支系 ,靴带支持率也高达 100%。
依据 rbcL 基因序列构建的系统树见图 3 ,新月细柱藻 MGB0501与 GenBank 中的另外三
株细柱藻具有很近的亲缘关系 ,支持率分别达到 100%、99%和 98%。GenBank中还没有来
源于菱形藻属的 rbcL基因序列存在 , N . longissima在系统树上仍与细柱藻聚为一支 ,但支持
693 期 长菱形藻(Nitzschia longissima)和新月细柱藻(Cy lindrotheca closteri um)分子分类研究
率较低(59%)。
图 2　以 Hasle crucigera(AY485482)为外族群 ,基于 18S rDNA 基因部分序列用邻接法
构建的系统树(1000 次重复计算靴带值)
Fig. 2　NJ tree based on partial sequences of 18S rDNA genes (H asle crucigera w as selec ted as the
out-g roup. Boo tstrap values we re ca lculated w ith 1000 repeats)
图 3　以 Bolidomonas paci f ica(AF372696)为外族群 , 基于 rbcL基因部分序列用邻接法构建的系统树
(1000 次重复计算靴带值)
Fig. 3　NJ tree based on partial sequences of rbcL genes (Bolidomonas paci f ica w as selec ted as the
out-g roup. Boo tstrap values we re ca lculated w ith 1000 repeats)
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3　讨论
物种形态特征除了受遗传物质控制外 ,还受到环境的影响。自然水域或人工培养的硅藻有
时会发生形态上的变异 ,水域中硅元素的含量 、pH 值 、温度 、水流等理化因素都有可能造成硅藻
的形态变化 ,水质污染还会导致硅藻细胞的畸形[ 13-14] 。区分有些硅藻种需要依据非常精细的形
态学指标 ,如点条纹的密度等[ 15] ,这些形态指标在光学显微镜下很难观察到 ,需要进一步借助于
电子显微镜 。物种鉴定还极大地依赖于研究者的经验。因此 ,十分有必要将形态描述和 DNA序
列信息相结合 。特定的核苷酸序列是传统分类的重要补充。在细菌的分类上 ,通过对其 16S rD-
NA的同源性比较 ,其结果一方面对传统的分类结果给予证实并提供了更多的分类依据 ,另一方
面 ,其结果有时也与传统的分类产生冲突 ,从而导致了一些新的种属的发现[ 16] 。
Neg riso lo等人[ 5] 的研究结果表明黄藻中的 Botrydiopsis callosa , Botrydiopsis constricta
和Chlorel lidium tetrabotry 不同株系之间 18S rDNA 和 rbcL 基因序列完全相同 ,甚至于不同
的地理株系间也没有核苷酸变异发生 ,即 18S rDNA 和 rbcL 基因在种内具有高度的保守性 。
GenBank中已有不同来源的新月细柱藻的 18S rDNA 和 rbcL 基因序列存在 ,藻株 MGB0501
的序列与之相比具有较大的差异 ,依据 rbcL 基因推导的蛋白质序列还氨基酸残基差异 。这种
变异程度已经超出种内变异的范围 ,因而在新月细柱藻中可能存在种复合体(species com-
plex)或者是在分类上存在同名异种的现象。但这尚需分离更多的藻株 ,通过比较 DNA 序列 ,
精细形态学指标或者是有性生殖试验来加以验证 。
rbcL基因是一种高效表达的叶绿体基因 ,其编码产物参与构成了地球上最丰富的蛋白
质。在许多物种中高效表达的基因普遍具有密码子使用偏好性 ,这类密码子的存在大大提高
了 mRNA 的翻译效率 ,因为与这些高频率使用的密码子所对应的 tRNA 在细胞质中是最丰
富的。此外 ,由于选择压力的作用 ,使 rbcL 基因和其它大多数叶绿体基因一样 ,碱基 A 和 T
占有很高的比例 ,这种作用也导致了在基因组的非编码区碱基 A 和 T 的含量也较高[ 17] 。氨
基酸的编码主要由密码子的前两位碱基决定 ,密码子第三位碱基的进化速度明显高于前两位 ,
因此 Daugbjerg 等人[ 18]建议用 rbcL 基因构建系统树时将密码子第三位碱基删除 ,以便更准确
反映物种进化关系。本研究中构建系统树时所选取的藻种进化关系很近 ,密码子第三位核苷
酸变异更能反映它们之间的系统学关系 。因此 ,在通过 rbcL 基因序列构建系统树时未删除序
列上该位置上的碱基 ,也未通过蛋白质序列来构建系统树。
参考文献:
[ 1] 　Meldlin L K , Koo istr a W H C F , Gersonde R , et al . Evolution o f the dia toms (Bacilla riophy ta):Ⅲ .
Mo lecular evidence for the o rigin of the Thalassiosir ales[ J] . NOVA H EDWIGIA , 1996 , 112:221-234.
[ 2] 　Kooistra W H C F , Mario D S. Phylog enetic po sitio n of tox arium , a pinnate-like lineage within centric
diatom s [ J] . J. Phycol. , 2003 , 39:185-197.
[ 3] 　Kooistra W H C F , Gandi F , Frithjo f A S S , et al . Mo lecular phylogeny and mo rphology of the ma rine
diatom Talaroneis posi doniae gen. et sp. nov. (Bacillariophy ta) advocate the teturn o f the P lagiogram-
maceae to the pinna te diatoms[ J] . Phycologia , 2004 , 43(1):58-67.
[ 4] 　Meldlin L K , Kooistra W H C F , Gersonde R , et al . Evolution o f the dia toms(Bacillariophy ta):Ⅱ . Nu-
clear-Encoded Small-Subunit rRNA Sequence Comqarisons Confirm a Paraphyle tic O rigin fo r the Centric
713 期 长菱形藻(Nitzschia longissima)和新月细柱藻(Cy lindrotheca closteri um)分子分类研究
Dia tom[ J] . Mo l. Bio l. Evol. , 1996 , 13(1):67-75.
[ 5] 　Neg risolo E , M aistro S , I ncarbone M , et al . Mo rpho lo gical converg ence char acte rizes o f Xanthophyceae
(Heterokontophy ta):evidence f rom nuclear SSU rDNA and plastidial rbcL gene s[ J] . Mo lecular Phylo-
genetics and Evo lution , 2004 , 33:156-170.
[ 6] 　Robe rts R D , Ca roline L. Effect of starv ation on the g row th and survival of po st-lar val abalone[ J] . Aq-
uaculture , 2001 , 200:323-338.
[ 7] 　Rober ts R D , Caro line L. Effect of delayed metamo rpho sis on la rval competence , the post-la rval survival
and g row th , in the abalone Halio tis iris Gemlin[ J] . J. Exp. Mar . Biol. Ecol. , 2001 , 258:1-13.
[ 8] 　Ba rillí L , Haure J , Pales-Espinosa E , et al. F inding new diatoms for rearing o f the pacific oy ster:ener-
gy budget as a selective tool[ J] . Aquaculture , 2003 , 217:501-514.
[ 9] 　Vardy S , Uwins P. Fourier tr ansfo rm infrar ed micro spectr oscopy as a to ol to differentiate Nitz schia
closterium and Nitz schia longissima[ J] . Applied Spect roscopy , 2002 , 56(12):1545-1548.
[ 10] 　Pablo F , Staube r J L , Buckney R T . Tox icity of cy anide and cyanide comple xes to the marine dia tom
Nitzschia closterium . Water Resear ch , 1997 , 31(10):2435-2442.
[ 11] 　Polne-Fulle r M . A tw o-hour method fo r e xt raction o f DNA from seaweeds[ J] . Phycolog ical New slet-
ter , 1991 , 23:2.
[ 12] 　Ló pez-Garcí a P , Rodrí guez-Vale ra F , Pedr-AlióC , et al. Unexpected diver sity of small euka ryo tes in
deep-sea Antarctic plankton[ J] . N ature , 2001 , 409:603-607.
[ 13] 　曹吉祥 , 潘震球 ,卞伯仲 ,等. 偏心海链藻形态变异的观察及原因的初步研究[ J] . 海洋科学 , 1994:50-
52.
[ 14] 　Dickman M D. Benthic marine diatom defo rmities a ssocia ted with contaminated sediments in Hong
Kong[ J] . Envir onment International , 1998 , 24 (7):749-159.
[ 15] 　金德祥 ,程兆弟 , 林均民 ,等. 中国海洋底栖硅藻类(上卷)[ M] .北京:海洋出版社 , 1982.
[ 16] 　焦振泉 , 刘秀梅. 16S rRNA 序列同源性分析与细菌系统分类鉴定[ M ] . 国外医学卫生学分册 , 1998 ,
25(1):12-16.
[ 17] 　Morton B R , So rhannus U , Fox M . Codon adapta tion and synonymous substitution ra te in dia tom pla s-
tid g enes[ J] . Mo lecular phylog enetics and evolution , 2002 , 24:1-9.
[ 18] 　Daugbjerg N , Ander son R A. Phy log ene tic analysis o f the rbcL sequences fr om Haptophy tes and het-
er okont alg ae suggest their chlor oplasts are unrelated[ J] . Mol. Biol. Evo l. , 1997 , 14(12):1242-1251.
STUDIES ON MOLECULAR IDENTTIFICATION OF NITZSCHIA
LONGISSIMA AND CYLINDROTHECA CLOSTERIUM
LI Hai tao , YANG Guanpin ,SHI Yuanyuan ,WU Suihan , SUN Ying
(College o f Marine Life Sciences , Ocean University of China , Qingdao 266003 , China)
Abstract:Tw o isola tes of benthic diatoms w ere obtained from Jiaozhou Bay. M orphological-
ly , they w ere identi fied as N itzschia longissima and Cy lindrotheca closterium respectively .
The sequences o f the nuclear-encoded 18S ribo somal RNA gene (rDNA) and the chlo roplast-
encoded rbcL gene w ere cloned and sequenced and used to construct neighbo r-joining(NJ)
phylo genetic t rees. The results indicate that sequence divergence is g reat betw een the tw o
species. Phy log enetic analy ses based on 18S rDNA and rbcL gene cor robo rate the placement
acco rding to mo rpholo gical features. 18S rDNA and rbcL genes are valuable marke rs for the
identification o f specie s that are dif ficul t to distinguish morphologically.
Key words:Nitzschia longissima;Cy l indrotheca closterium ;18S rDNA;rbcL gene
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