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2008 年 第 53 卷 第 2 期: 197 ~ 202


www.scichina.com csb.scichina.com 197
《中国科学》杂志社
SCIENCE IN CHINA PRESS 论 文
对小新月菱形藻(Nitzschia closterium f. minutissima)
分类地位的重新认识
石娟①, 潘克厚①*, 王晓青②, 陈放②, 周蜜②, 朱葆华①, 卿人韦②*
① 中国海洋大学水产学院, 青岛 266003;
② 四川大学生命科学学院, 成都 610064
* 联系人, E-mail: qingrw@email.scu.edu.cn, khpan@ouc.edu.cn
2007-06-28收稿, 2007-12-03接受
国家重点基础研究发展计划(编号: 2005CCA02400)资助项目

摘要 小新月菱形藻是一种海洋真核单细胞硅藻, 是水产养殖中应用广泛的饵料之一. 先前
认为, 该藻属于硅藻门, 硅藻纲, 硅藻目, 硅藻科, 菱形藻属. 本文对小新月菱形藻进行了微
分涉相差(differential interference contrast microscopy, DIC)显微镜形态观察; 分别用高效液相
色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)和气相色谱(gas chromatography, GC)分
析了该藻及三角褐指藻(舟形藻目)的色素、脂肪酸组成; 应用简并性引物策略、PCR 或结合
RACE技术分别得到了小新月菱形藻的 18S rDNA部分序列、全长 5.8S rDNA、ITS1和 ITS2
序列、部分 28S rDNA序列、actin基因、一个类似 ∆5脱饱和酶全长 cDNA, 并在转基因酵母
中鉴定其具有Δ5 脱饱和酶功能. 从生化及分子水平系统比较了小新月菱形藻、三角褐指藻
和新月细柱藻(硅藻目)的亲缘关系, 揭示小新月菱形藻18S rDNA与三角褐指藻株系相似性为
99.9%以上; 小新月菱形藻 5.8S rDNA序列与三角褐指藻的相似性为 100%, 而与新月细柱藻
的相似性为 96.2%; 小新月菱形藻 ITS1和 ITS2序列与三角褐指藻的相似性均为 98.6%, 而与
新月细柱藻的相似性分别为38.2%和37.04%; 小新月菱形藻 actin蛋白质序列与三角褐指藻的
相似性为 100%; 小新月菱形藻的Δ5脱饱和酶氨基酸残基序列与三角褐指藻相关酶序列的相
似性为 99.4%. 因此, 本研究认为, 小新月菱形藻在系统分类上应不属于硅藻目, 硅藻科, 菱
形藻属, 而应该属于舟形藻目, 褐指藻科, 褐指藻属, 并极有可能是三角褐指藻的一株.
关键词
小新月菱形藻
三角褐指藻
新月细柱藻
分类


小新月菱形藻 (Nitzschia closterium f. minutis-
sima)是一种真核海洋单细胞硅藻, 因富含蛋白质、碳
水化合物及多不饱和脂肪酸而被作为优良饵料广泛
应用于水产养殖, 是多种软体动物、甲壳类幼体和浮
游动物(如轮虫)的主要食源[1~4].
小新月菱形藻的形态特征为: 细胞纺锤形, 中央
膨大, 两端渐尖, 朝同一个方向弯曲似月牙形; 细胞
长 12~23 µm, 宽 2~3 µm; 细胞核位于细胞中央; 色
素体黄褐色, 2 片, 位于细胞核两侧[3~6]. 其分类鉴定
最早由 Allen 和 Nelson 于 1910 年完成, 主要根据该
藻的形态特征将其归入硅藻门, 硅藻纲, 硅藻目, 硅
藻科, 菱形藻属 [4~7]. 然而近年来对小新月菱形藻的
分类地位和学名确定也引起了一些藻类学工作者注
意, 我们在克隆该藻的脱饱和酶基因时得到一个与
三角褐指藻的Δ5-脱饱和酶基因几乎完全一致的序
列, 这使我们意识到小新月菱形藻目前的分类地位
的确值得进一步探讨 . 国外也有实验室认为小新月
菱形藻其实是硅藻门, 硅藻纲, 舟形藻目, 褐指藻科,
褐指藻属的三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)
的一株, 如美国的 CCMP (National Culture Collection
of Marine Phytoplankton), 但研究资料未见发表. 由
于仅依据传统的形态学特征分类并不可靠 , 容易出



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现错误[8]. 本文在生化水平上分析了小新月菱形藻和
三角褐指藻的色素及脂肪酸组成, 在分子水平上对小
新月菱形藻、三角褐指藻及属于硅藻门, 硅藻纲, 硅
藻目, 硅藻科, 细柱藻属的新月细柱藻(Cylindrotheca
closterium)[9]作了比较系统的亲缘关系研究.
1 材料和方法
(ⅰ) 材料培养. 小新月菱形藻和三角褐指藻都
取自中国海洋大学微藻种质库(Microalgae Culture
Collection, MACC), 编号分别为 B228和 B253. 实验
藻种进行抗生素平板筛选(f/2固体培养基 + 50 µg/mL
链霉素 + 50 µg/mL氨苄青霉素), 所得单克隆培养至
指数末期, 培养条件为 f/2 培养基, (20±1)℃, 光照
60~80 µmol·m−2·s−1, 光暗比 12 h:12 h, 离心收集藻
细胞用于实验或经液氮速冻后于−80℃保存备用.
(ⅱ) 藻细胞形态观察. 使用微分涉相差显微镜
(differential interference contrast microscopy, DIC)观察
藻细胞, Axiocam MRc 相机(Zeiss)拍摄照片, 图片用
Axiovision4.1处理(Carl Zeiss S.A.S, LePecq, France).
(ⅲ) 色素分析. 小新月菱形藻和三角褐指藻的
色素分析方法参见文献[10].
(ⅳ) 脂肪酸分析. 小新月菱形藻的脂肪酸分析
参见文献[11].
(ⅴ) DNA 和 RNA 提取及 RNA 反转录. 采用
CTAB法[12]提取基因组 DNA. 用植物 RNA提取试剂
盒(Watson, 上海)提取总 RNA, 用 Rneasy Mini Kit
(Qiagen)和 RNase-free DNase set (Qiagen)纯化 RNA,
−80℃储存. 用 first-strand cDNA Synthesis kit (Ta-
KaRa, 大连)合成 cDNA第一链.
(ⅵ) 小新月菱形藻相关功能基因及 rDNA 克隆.
(1) 小新月菱形藻∆5-脱饱和酶基因克隆. 根据已
知的三角褐指藻∆5 -脱饱和酶 (Ge n Ba nk 登录号 :
AX951581)和海链藻(Thalassiosira pseudonana)∆5-脱
饱和酶(CS160915)设计简并引物 Ncfmd-1 (5′-CA(C/T)
CA(C/T)GC(T/G)TA(C/T)ACCAATCAC-3′)和 Ncfmd-
2 (5′-TG(G/A)TG(T/C)TC(A/C)AC(C/T)TGAAAGTTG-
AG-3′), 以 cDNA为模板做 PCR, 所得片段亚克隆到
载体 pMD18T (TaKaRa, 大连)中测序. 根据测序结果,
用 GeneRacer TM kit (Invitrogen)分别做 5′和 3′ RACE
得到全长 cDNA, 称为 NcfmDesA.
(2) 小新月菱形藻 18S rDNA, ITS1 (internal
transcribed spacer 1), 5.8S rDNA, ITS2 (internal tran-
scribed spacer 2)和 28S rDNA的克隆. 首先, 根据已
知硅藻的 18S rDNA 序列设计引物 Ncfm18S1
(5′-GCTCGTCTCAAAGATTAAGCC-3′)和 Ncfm18S2
(5′-GTTACGACTTCACCTTCCTCT-3′), 以 基 因 组
DNA 为模板 PCR 扩增, 所得片段亚克隆测序, 即得到
18S rDNA 序列 ; 根据测序结果设计上游引物
Ncfm18S3 (5′-GTTGGTTGCGAGAACTTGTC-3′), 根
据已知硅藻的 28S rDNA序列设计下游引物 Ncfm28S4
(5′-GACTGTGCAGCCATTGCTG-3′), 以基因组 DNA
为模板做 PCR, 所得片段亚克隆测序, 即得到全长的
ITS1, 5.8S rDNA, ITS2, 部分18S rDNA序列和部分28S
rDNA序列.
(3) 小新月菱形藻 actin 基因克隆. 根据 Nitz-
schia thermalis 和三角褐指藻的 actin 基因序列
(GenBank 登录号分别为 AY713395, AY713398)设计
简并引物 Nactjb1 (5′-C(T/C)TGAC(C/G)GAGCGTGG-
TTACTC-3′)和 Nactjb2 (5′-GC(C/G)A(A/G)AAT(A/T)G-
A(T/C)CCTCCAATCCA-3′), 以 cDNA为模板做 PCR,
所得片段亚克隆测序, 根据测序结果做 5′和 3′ RACE
得到全长 cDNA.
(ⅶ) NcfmDesA 的功能鉴定 . 用于在酵母 S.
cerevisiae Invsc1株 (Invitrogen)异源表达 NcfmDesA
的全长引物分别为 NcfmdNK (5′-GCGGTACCA-
TGGCTCCGGATGCGGATAAGCT-3′, 下画线表示
KpnⅠ酶切位点, 黑体字碱基表示翻译的起始密码子)
和 NcfmdCE (5′-GCGAATTCTTACGCCCGTCCGG-
TCAAGGGATT-3′, 下画线表示 EcoRⅠ酶切位点, 斜
体示翻译框的终止密码子), 用高保真酶(Vent, New
England Biolabs, USA)进行 RT-PCR, 所得片段克隆
于 pYES2 (Invitrogen)的相应多克隆位点, 得到的新
质粒称为 pYNcfmd, 处于启动子 Gal1 的控制之下.
分别把新构建的 pYNcfmd质粒和空载 pYES2质粒用
醋酸锂方法转化酵母 , 所得转基因酵母用不含尿嘧
啶的基本培养基培养[13]. 诱导表达用含 2% (质量体
积比)半乳糖的诱导培养基, 同时在培养基中添加多
不饱和脂肪酸 20:3∆8,11,14和 20:4∆8,11,14,17至 50 µmol/L,
在 20℃下培养转基因酵母 3 d, 收集酵母, 按 Tonon
等人 [11]方法用气相色谱(gas chromatography, GC)测
定所得酵母的总脂肪酸 , 所得结果与 37 FAMEs
mixture (Supelco)标准品比较, 鉴定转基因酵母所含
脂肪酸种类, 进而确定脱饱和酶的类型.
(ⅷ) 其他相关基因和 DNA 序列的获得. 三角




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褐指藻的相关基因和 DNA 序列直接来源于 NCBI 或
三角褐指藻 CCAP 1055全基因组数据库(http://genome.
jgi-psf.org/). 新月细柱藻的相关序列直接来源于
NCBI数据库.
(ⅸ) 序列分析. 用软件Clustal X 1.83进行序列
的比对分析[14].
2 结果
2.1 藻体形态观察
小新月菱形藻和三角褐指藻形态见图 1, 实验所
用小新月菱形藻细胞形态与文献[4~6]报道的一致.

图 1 小新月菱形藻(a)和三角褐指藻(b)的形态特征
标尺示 3 µm
2.2 色素分析结果
小新月菱形藻和三角褐指藻的色素组成见图 2,
由图可知, 二者色素组成没有差异.
2.3 脂肪酸分析结果
小新月菱形藻和三角褐指藻的脂肪酸组成见图
3, 由图可知 , 二者脂肪酸组成没有明显差异, 都属
于含长链多不饱和脂肪酸 EPA(二十碳五烯酸 , ei-
cosapentaenoic acid, 20:5∆5,8,11,14,17,)的海洋微藻 , 且
小新月菱形藻 EPA的相对含量略高于三角褐指藻.
2.4 小新月菱形藻脱饱和酶基因鉴定及与三角褐指
藻∆5-脱饱和酶基因比较
本研究克隆得到的小新月菱形藻∆5-脱饱和酶基
因全长 1410 bp, 编码 469 个氨基酸残基 , 申请
GenBank 号为 EF553462. 所构建的转基因酵母用外
源二高γ-亚麻酸(dihomo-γ-linolenic acid, 20:3∆8,11,14)
和二十碳四烯酸(eicosatetraenoic acid, 20:4∆8,11,14,17)
饲喂后 , 在转基因酵母的脂肪酸中检测到了相应新
峰的存在, 通过与标准品比较, 新峰分别为多不饱和
脂肪酸 20:4∆5,8,11,14和 20:5∆5,8,11,14,17, 其结果见图 4,
说明转基因酵母具有把 20:3∆8,11,14和 20:4∆8,11,14,17分
别转变为 20:4∆5,8,11,14和 20:5∆5,8,11,14,17(EPA)的能力,
因此, 本研究所克隆的脱饱和酶 cDNA, NcfmDesA鉴
定为∆5-脱饱和酶基因. 与三角褐指藻CCAP1055 ∆5-
脱饱和酶基因序列(AX951581)的相似性为 99.0%, 蛋
白序列的相似性为 99.4%.


图 2 小新月菱形藻和三角褐指藻的色素组成
1, 植基叶绿素 a; 2, 叶绿素 c2; 3, 叶绿素 c1; 4, 甲基脱植基叶绿素 a; 5, 岩藻黄素; 6, 硅甲藻黄素; 7, 硅藻黄素; 8, 叶绿素 a



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图 3 三角褐指藻(a)和小新月菱形藻(b)的脂肪酸组成
(a)的有关数据来源于文献[15]


图 4 转基因酵母的脂肪酸 GC分析
(a) 带有质粒 pYNcfmd的转基因酵母; (b) 带有质粒 pYes2的
转基因酵母

2.5 小新月菱形藻与三角褐指藻 18S rDNA的比较
本研究克隆得到的小新月菱形藻 18S rDNA 长
1776 bp (EF553459), 接近全长, 仅缺失 5′端, 与三角
褐指藻 CCAP 1055 (EF553458)和 CS-29 (EF140622)
的相似性为 100%, 与三角褐指藻 CCAP 1052
(DQ402479)的相似性为 99.9%.
2.6 小新月菱形藻与三角褐指藻、新月细柱藻 5.8S
rDNA的比较
本研究克隆得到了小新月菱形藻 5.8S rDNA 的
全长序列 , 共 168 bp (EF553459), 与三角褐指藻
CCAP 1055 (EF553458)的相似性为 100%, 与新月细
柱藻(AF289049)的相似性为 96.2%(图 5).
2.7 小新月菱形藻与三角褐指藻、新月细柱藻 ITS1
比较
本文研究得到了小新月菱形藻 ITS1的全长序列,
共 288 bp (EF553459), 与三角褐指藻 CCAP 1055
(EF553458)的相似性为 98.6%, 而与同为菱形藻科的
新月细柱藻(AF289049)的相似性仅为 38.2%(图 6).
2.8 小新月菱形藻与三角褐指藻、新月细柱藻 ITS2
比较
本研究克隆得到了小新月菱形藻 ITS2的全长序列,
共 439 bp (EF553459), 与三角褐指藻 CCAP 1055
(EF553458)、CCAP1052 (DQ085802)、CCMP630 (DQ-
085805)和新月细柱藻(AF289049)的 ITS2 序列比对结
果见表 1. 小新月菱形藻与三角褐指藻 CCAP 1055的
相似性为 98.6%, 与 CCMP630 的相似性为 100%, 而
与同为菱形藻科的新月细柱藻的相似性仅为 37.04%.
2.9 小新月菱形藻与三角褐指藻 actin基因比较
本研究克隆到了小新月菱形藻 actin 基因 cDNA
全长, 共 1134 bp (EF553460), 编码 377个氨基酸残基,
与三角褐指藻 CCAP 1055 的 actin 基因(EF553461)序
列相似性为 99.6%, 蛋白质序列相似性为 100%.
3 讨论
海洋微藻种类繁多 , 最初的分类鉴定主要依据
形态特征 , 但仅从形态对其进行分类并不可靠 [8,16].
需进一步从生理生化甚至分子水平进行系统研究 [8].
目前, 海藻的色素组成、脂肪酸组成都是研究分类的
重要依据 [17,18]. 我们测定并比较了小新月菱形藻和
三角褐指藻的色素组成及脂肪酸组成, 结果表明, 二
者的色素及脂肪酸组成一致 , 仅个别成分的相对含
量有所不同, 说明二者亲缘关系很近.
为了进一步验证这一推论 , 我们又在分子水平
上进行了探索. 已知核糖体 RNA基因和 actin基因在
进化上是高度保守的 , 它们作为分类的重要依据已
得到广泛应用[19,20]. 而 ITS1 和 ITS2 及功能基因, 如
∆5-脱饱和酶基因, 在同种生物中具有较高的保守性,
而在不同物种间具有较大的差异性 [21,22]. 因此如果
将这两类基因结合起来进行比较分析, 能够更加充地
反应物种间的进化关系. 本实验克隆了小新月菱形藻
的 18S rDNA, ITS1, 5.8S rDNA, ITS2 和 actin 基




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图 5 小星月菱形藻与相近藻株的 5.8S rDNA比较
Ncfm, 小新月菱形藻; Pt, 三角褐指藻; Cclosterium, 新月细柱藻


图 6 小星月菱形藻与相近藻株的 ITS1序列比较

表 1 小新月菱形藻与相近藻株的 ITS2序列相似性
NcfmB228 PtCCAP1055 PtCCAP1052 PtCCMP630 Cclosterium
NcfmB228 100% 99.32% 99.32% 100.00% 37.04%
Cclosterium 37.04% 39.44% 39.44% 37.04% 100%




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因, 克隆并鉴定了一个∆5-脱饱和酶基因, 然后将这
些序列分别与三角褐指藻(舟形藻目)和新月细柱藻
(硅藻目)的相关序列进行比较, 结果显示, 小新月菱
形藻与三角褐指藻的 18S rDNA, 5.8S rDNA和 actin
基因的相似性均在 99.6%以上, 甚至达到 100%, 而
与新月细柱藻 5.8S rDNA的相似性为 96.2%; 小新月
菱形藻与三角褐指藻的 ITS1, ITS2的相似性均在 98%
以上, 而与新月细柱藻的相似性均不到 40%; 此外,
小新月菱形藻与三角褐指藻的∆5-脱饱和酶基因序列
相似性达到 99.0%, 蛋白序列相似性为 99.4%. 可见,
在分子水平上小新月菱形藻与新月细柱藻存在较大
差异, 而与三角褐指藻有很高的同源性.
综上所述 , 我们认为小新月菱形藻在自然分类
系统中并不属于硅藻目, 硅藻科, 菱形藻属, 而应属
于舟形藻目, 褐指藻科, 褐指藻属, 并且极有可能是
三角褐指藻的一个藻株.
致谢 感谢中国海洋大学于志刚教授实验室在对海藻色素测定和分析上提供的帮助; 感谢法国 Laboratory of Diatom Signal-
ling and Morphogenesis的 Chris Bowler博士拍摄了小新月菱形藻和三角褐指藻的微分涉相差显微镜照片.
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