全 文 ：广盐性硅藻披针舟形藻在高盐
和低盐胁迫下的抗氧化响应
焉婷婷 ,周亚维 ,李朋富 ,刘志礼
(南京大学 生命科学学院 ,江苏 南京　210093)
　　摘　要:　有关藻类耐盐的抗氧化响应机制的研究报道很少 , 披针舟形藻(Naviculalan-
ceolata)是从盐场分离到的广盐性硅藻 , 文章研究了其在长期高盐及低盐胁迫下的抗氧化响
应。与对照组(1.6% NaCl)相比 , 在低盐(0%, 0.5%, 0.8%, 1.0% NaCl)及高盐 (3.2%,
4.8%, 6.4%, 8.0%, 9.6% NaCl)胁迫条件下 ,披针舟形藻的生长受到抑制 ,胞内膜氧化产物
丙二醛的含量显著升高 , 表明藻细胞内出现了氧化损伤。在高盐及低盐胁迫下 , 胞内的抗氧
化酶超氧化物歧化酶 、抗坏血酸过氧化物酶 、过氧化氢酶和谷胱甘肽还原酶的活性均增强 ,非
酶抗氧化剂抗坏血酸和还原型谷胱甘肽含量均增加。上述研究结果显示 ,披针舟形藻通过提
高抗氧化酶的活性及非酶抗氧化剂的含量来应对长期盐胁迫下的氧化损伤 ,细胞抗氧化系统
的响应是藻耐受长期盐胁迫的机制之一。
关键词:　披针舟形藻;广盐性;抗氧化;盐胁迫
中图分类号:Q949.2　文献标识码:A　文章编号:1673-6850(2010)05-0015-05
收稿日期:2010-04-28
基金项目:国家自然科学基金项目(30670400)
作者简介:焉婷婷(1985 -),女 ,山东人 ,在读硕士 ,从事海洋藻类研究。
AntioxidantResponsestoHyposaline
andHypersalineStresesintheEuryhaline
DiatomNaviculaLanceolata
YANTingting, ZHOUYawei, LIPengfu, LIUZhili
(SchoolofLifeSciences, NanjingUniversity, NanjingJiangsu210093, China)
Abstract:　Themechanismsofantioxidantresponseinsalttoleranceinalgaearepoorlyun-
derstood.Naviculalanceolataisaeuryhalinediatomfromsalterns.Efectsoflong-termhypersa-
lineandhyposalinestressesontheantioxidantdefensesystemwerestudiedinthisstudy.Compared
tocontrolsalinitycondition(1.6% NaCl), along-termexposuretohyposaline(0%, 0.5%, 0.
8%, or1.0% NaCl)orhypersaline(3.2%, 4.8%, 6.4%, 8.0%, or9.6% NaCl)stressin-
hibitedthegrowthofN.lanceolata.Significantincreasesincelularmalondialdehydecontentunder
bothsalinitystressesindicatedintracellularoxidativedamages.Bothstressessignificantlyinduced
theactivitiesofantioxidantenzymes:superoxidedismutase, ascorbateperoxidase, catalaseandglu-
tathionereductase.Thelevelsofthetwonon-enzymaticantioxidants, ascorbicacidandglutathi-
one, werealsoincreasedsignificantlyunderbothsalinestresses.Ourdatasuggestthatunderboth
long-termhyposalineandlong-termhypersalinestresses, theproductionofbothenzymaticand
non-enzymaticantioxidantsweresignificantlyincreasedtocounteracttheoxidativedamageinN.
lanceolatacells, andtheinductionofantioxidantdefenseswasoneofthetolerancemechanismsof
N.lanceolatatolong-termsaltstress.
Keywords:　Naviculalanceolata;euryhaline;antioxidant;saltstress
15
第 39卷　第 5期
2010年 9月
盐业与化工
JournalofSaltandChemicalIndustry
DOI :10.16570/j.cnki.issn1673-6850.2010.05.001
　　不管是陆生还是水生生物 ,盐胁迫都会影响新
陈代谢和抑制生长 [ 1] 。研究发现在高等植物中盐
胁迫能够增加活性氧化物 (ROS)并导致氧化损
伤 [ 2-3] 。活性氧化物包括超氧化物阴离子(O-2 ),过
氧化氢(H2O2),单线态氧(1O2),羟自由基(OH· )
及氧自由基(O·)[ 4] 。未受胁迫的植物及藻细胞内
也产生 ROS,但过量的 ROS会损伤 DNA,蛋白质及
脂质[ 5] 。为了清除过量的 ROS,细胞启动抗氧化机
制来保护自身免受氧化破坏[ 6] 。超氧化物歧化酶
(SOD;E.C.1.15.1.1)是抗氧化酶系统中的第一个
酶 ,它将 O-2 转化为 H2O2 , 后者被过氧化氢酶
(CAT;E.C.1.11.1.6)及抗坏血酸过氧化物酶
(APX;E.C.1.11.1.11)直接清除掉 [ 7 -8] 。另外 ,谷
胱甘肽还原酶(GR;E.C.1.6.4.2)通过抗坏血酸
-谷胱甘肽循环间接性参与了 H2O2的清除 [ 9] 。
CAT催化 H2O2分解为水和氧气 [ 4] ,而 APX在减少
H2O2的含量的过程中伴随着抗坏血酸(ASA)的氧
化 [ 10] ,随后脱氢抗坏血酸还原酶利用还原型谷胱甘
肽作电子接收者将氧化的抗坏血酸还原 [ 11] ,而被氧
化的谷胱甘肽在 GR的作用下还原为还原型谷胱甘
肽 [ 12] 。非酶抗氧化剂包括还原型谷胱甘肽(GSH),
ASA,生育酚及胡萝卜素等 [ 4] 。
在潮涧带 、江河入海口及盐田中 ,盐度波动是限
制藻生长的主要因素之一 [ 13] 。已有报道表明:耐盐
绿藻杜氏藻(Dunalielatertioleca)及海洋绿藻石莼
(Ulvafasciata)在高盐及低盐胁迫下的抗氧化反应
与其耐盐性有关 [ 7, 12] 。但是 ,对有关藻类耐盐的抗
氧化响应机制仍了解不足。披针舟形藻(Navicula
lanceolata)是从盐田中分离到的广盐性硅藻 [ 15] ,文
章旨在研究披针舟形藻在长期盐胁迫下的抗氧化响
应 ,以及细胞抗氧化系统在耐盐机制中是如何起作
用的。
1　材料与方法
1.1　藻的培养
披针舟形藻分离自江苏省台南盐场 [ 15] ,培养温
度为 25℃,光强为 4 900lx,光周期为 12 D:12L,培
养基为 f/2[ 16] 。为了避免硅藻细胞粘附在三角瓶瓶
壁上 ,培养时在瓶底上铺一层砂 , 250 mL三角瓶加
入 150mL培养基静置培养 。每天手摇 3次 。
1.2　实验设计
将藻分别在 NaCl浓度为 0%、0.5%, 0.8%,
1.0%, 1.6%, 3.2%, 4.8%, 6.4%, 8.0%, 9.6%的
无菌 f/2培养基中培养 2周 ,然后再接种至对应
NaCl浓度的新培养基中进行培养 ,起始藻细胞密度
为 104 /mL,在第 4d分别取样分析抗氧化酶和非酶
抗氧化剂 。实验中每个 NaCl浓度下培养藻时设 3
个平行。
1.3　生长的测定
藻液摇匀后 ,在无菌条件下取 1mL藻液 ,加入
1mL2%戊二醛固定后 ,在光学显微镜下用血球计
数板法检测藻细胞密度 [ 15] 。
细胞生长速率(μ)计算公式 [ 17] :
μ=(lnAn-lnA0)/(tn-t0)
式中:A0———实验起始时间 t0的藻细胞密度;
An———至对数期末各时间点 tn的藻细胞密
度。
1.4　丙二醛含量的测定
摇匀后取 80 mL藻液 ,用 0.45 μm滤膜抽滤 ,
将藻细胞从滤膜上刮下并转移到 2mL提取液中 ,提
取液含 10%TCA及 1mmol/LEDTA,冰浴中用振幅
为 14 μm的超声处理 3 min,进一步分析前细胞匀
浆置于冰中保存。
MDA的含量用南京建成生物工程研究所的试
剂盒测定 。测定方法为 TBA法 ,其测定原理为:脂
质过氧化物中的 MDA可与硫代巴比妥酸(TBA)缩
合 ,形成的红色产物在 532 nm处有最大吸收峰 。
1.5　抗氧化酶活性的测定
将上述方法收集到的藻细胞悬浮于等渗的甘油
溶液中 ,用 0.45 μm滤膜抽滤 。收集到的藻细胞转
移到 2 mL的提取液中 , 提取液中包含 50 mmol/L
KH2PO4 (pH 7.0), 0.1 mmol/LEDTA及 0.1%
Triton-X (测 APX活 性 的 提 取液 还 包 含
0.5 mmol/L抗坏血酸), 冰浴中超声处理 3 min,
10 000 g离心 20 min(4 ℃),上清液置于冰上待测。
酶活性表示为 Umg-1蛋白质 。
SOD和 GR的活性用南京建成生物工程的试剂
盒测定。测定 SOD的原理为:通过黄嘌呤及黄嘌呤
氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基(O2-),后
者氧化羟胺形成亚硝酸盐 , SOD作用下使超氧阴离
子自由基减少 ,从而形成的亚硝酸盐减少 ,亚硝酸盐
在显色剂的作用下呈现紫红色 ,用分光光度计检测
亚硝酸盐量的变化 。测定 GR的原理为:在 GR的
催化下 , 由 NADPH供氢 , 还原氧化型谷胱甘肽
(GSSG)生成 GSH, NADPH减少 ,在 340 nm处检测
16 盐业与化工　　　　　　　　　　　　　 第 39卷第 5期
NADPH的改变。
APX活性的测定参照 Nakano与 Asada的方
法 [ 18] 。反应体系为 3mL,内含 50mmol/L磷酸缓冲
液(pH7.0), 0.1mmol/LH2O2 , 0.5mmol/L抗坏血
酸及 0.1 mL细胞提取液 。加入细胞提取液后 ,在
290nm波长下检测 3 min内吸光值的变化。一个
APX酶活单位定义为:室温下每分钟氧化 1μmol/L
ASA所需要的酶量 。APX在 290 nm下的分子消光
系数为 2.8L/(mmol· cm)。
CAT活性的测定参照 Moreli与 Scarano的方
法 [ 19] 。反应体系为 3mL,内含 50mmol/L磷酸缓冲
液(pH7.0), 10 mmol/LH2O2和 0.2 mL细胞提取
液 。H2O2加入后 ,在波长为 240 nm下检测反应体
系一分钟内的吸光值变化 。一个 CAT酶活单位定
义为:室温下每分钟氧化 1 μmol/LH2O2所需要的
酶量。 CAT在 240 nm下的分子消光系数为 40 L/
(mmol·cm)。
1.6　非酶抗氧化剂含量的测定
同上述方法通过抽滤收集藻细胞后 ,转移到 2
mL提取液 A(5%磺基水杨酸)或 B(0.25 mmol/L
草酸 , 1mmol/LEDTA)中 ,冰浴中用振幅为 14 μm
的超声处理 3 min, 6 000 g离心 20 min。获得的上
清液分别用来测定 GSH或 ASA的含量。
GSH和 ASA的含量用南京建成生物工程公司
试剂盒测定 。测定 GSH的原理为:二硫代二硝基苯
甲酸与巯基化合物反应时能产生一种黄色化合物 ,
可进行比色定量测定 。测定 ASA的原理为:用 Fe3 +
与还原型抗坏血酸迅速作用生成 Fe2+ ,后者再与啡
罗啉显色反应。
1.7　蛋白质含量的测定
提取物中可溶性蛋白质含量用南京建成生物工
程公司的试剂盒测定(考马斯亮兰法)。
1.8　数据统计分析
采用单因素方差分析(one-wayANOVA)进行
数据统计分析。
2　结果与分析
2.1　盐度胁迫对硅藻生长的影响
由图 1可以看到 ,披针舟形藻在 1.6% NaCl浓
度下 ,生长速率最大 ,低于 1.6%或高于 1.6% NaCl
浓度下 ,生长速率减慢 。实验中 , 1.6%NaCl浓度作
为对照组 ,低于 1.6%盐度为低盐胁迫 ,高于 1.6%
盐度为高盐胁迫 。
图 1　盐度胁迫对披针舟形藻生长速率的影响
2.2　盐度胁迫对硅藻 MDA含量的影响
在低盐及高盐胁迫下 , MDA含量上升(图 2)。
高盐胁迫下 ,与对照组相比 , 3.2%, 4.8%, 6.4%,
8%和 9.6% NaCl浓度中硅藻的 MDA含量分别增
加了 54%, 75%, 73%, 103%和 146% (P<0.05)。
与对照组相比 , 低盐胁迫下 1.0%, 0.5%和 0%
NaCl浓度中硅藻的 MDA含量分别增加了 110%,
173%和 343% (P<0.05)。
图 2　盐度胁迫对披针舟形藻 MDA含量的影响
2.3　盐度胁迫对硅藻抗氧化酶活性的影响
在高盐及低盐胁迫条件下 ,藻细胞的 SOD活性
增强(见图 3a)。在 3.2%, 6.4%和 9.6%NaCl浓度
的高盐胁迫下 , SOD活性分别增强了 31%, 37%和
78%(P<0.05)。在 0.8%, 0.5%和 0%NaCl浓度
的低盐胁迫下 , SOD活性分别增强了 12%, 40%和
43%(P<0.05)。
盐度胁迫导致硅藻细胞的 CAT活性明显增强
(见图 3b)。高盐胁迫下 CAT活性随着盐度升高而
增强 ,在 9.6%NaCl浓度达到最高 , 为对照组的
327%(P<0.05)。在低盐胁迫下 , CAT的活性也一
直增强 ,在 0%NaCl浓度下达到对照组的 503%(P
<0.05)。
盐度胁迫下 , 硅藻 APX活性明显增强(见图
3c)。高盐胁迫下 ,在 4.8%, 6.4%, 8.0%和 9.6%
NaCl浓度时 , APX活性分别显著增加到对照组的
172010年 9月 焉婷婷等:广盐性硅藻披针舟形藻在长期高盐
132%, 160%, 204%及 227%(P<0.05)。低盐胁迫
下 ,在 0%, 0.5%及 0.8%NaCl浓度下 APX活性分
别增强到对照组的 128%, 123%及 107%(P<
0.05)。
盐度胁迫也导致了硅藻 GR活性增强(图 3d)。
在 NaCl浓度为 3.2%至 9.6%的高盐胁迫下 , GR活
性分别增强到对照组的 107%至 448% (P<0.05)。
在 1.0%至 0%NaCl浓度的低盐胁迫下 , GR活性分
别为对照组的 117%至 159% (P<0.05)。
图 3　盐度胁迫对披针舟形藻 SOD
(a), CAT(b), APX(c)及 GR(d)活性的影响
2.4　盐度胁迫对硅藻非酶抗氧化剂含量的影响
如图 4a所示 ,在低盐胁迫下 ,硅藻 GSH含量随
着盐度升高而增加 ,在 0%NaCl浓度下 GSH含量达
到对照组的 292%(P<0.05)。高盐胁迫下 , GSH
含量上升 ,在 3.2%, 4.8%, 6.4%, 8.0%和 9.6%
NaCl浓度下 , GSH含量分别增加到对照组的
117%, 130%, 131%, 139%和 165%(P<0.05)。
ASA的含量在高盐及低盐胁迫下都有明显增
加(图 4b)。在 1.0%, 0.8%, 0.5%和 0% NaCl浓
度的低盐胁迫下 , ASA含量分别增加了 29%, 18%,
68%和 218% (P<0.05)。在 3.2%, 4.8%, 6.4%,
8.0%和 9.6% NaCl浓度的高盐胁迫下 , ASA含量
分别增加到对照组的 198%, 258%, 384%, 420%及
489%(P<0.05)。
图 4　盐度胁迫对披针舟形藻 GSH(a), ASA(b)活性的影响
3　讨论
与其他的非生物胁迫因素相似 ,盐胁迫可以导
致过量的 ROS生成 ,从而造成细胞的氧化损伤。
ROS导致脂质过氧化 ,伴随产生 MDA, MDA的含量
增大可以反映 ROS含量的上升 [ 20-21] 。因此 MDA
被用作为氧化损伤的标志化合物[ 22] 。实验中 ,与
1.6%的最适生长盐度相比 ,在低盐及高盐胁迫下 ,
披针舟形藻细胞内 MDA的含量均大幅度升高 ,并
且升高的程度与盐胁迫的程度相关 ,这可以间接说
明 ,盐胁迫导致藻细胞内 ROS含量上升 ,受到氧化
损伤 。与对照组相比 ,高盐胁迫下 ,硅藻的 MDA含
量增加了 16% ～ 73%,而低盐胁迫下则增加了 36%
～ 138%,这说明披针舟形藻对低盐胁迫更敏感。
18 盐业与化工　　　　　　　　　　　　　 第 39卷第 5期
SOD被认为是主要的抗氧化酶 , 用于清除
O-2 [ 20] ,所产生的 H2O2在 CAT与 APX的作用下被
清除[ 7-8] 。本实验中 ,盐胁迫下披针舟形藻 ROS含
量上升 ,细胞中 SOD的活性随之升高以清除 O-2 ,
SOD的清除作用使得其反应产物 H2O2增多 , CAT
及 APX活性的增强可以随之清除升高的 H2O2。
已有研究报道显示 ,细胞中 GR通过抗坏血酸
-谷胱甘肽循环间接参与 H2O2 的清除 [ 9] , 并将
GSSG还原为 GSH[ 12] 。本实验中 ,披针舟形藻 GR
活性的增强 ,间接参与清除细胞中增加的 H2O2 ,并
使得总的 GSH含量增加。
已有报道表明 ,细胞中 APX参与清除 H2O2的
过程中产生的氧化型抗坏血酸 ,在脱氢抗坏血酸还
原酶作用下利用 GSH将氧化的抗坏血酸还原 [ 11] ,
因此 ,本实验中 ,披针舟形藻 ASA含量增加与 GSH
含量增加密切相关 , GSH含量增加使得氧化的抗坏
血酸被更多地还原为 ASA。 GSH与 ASA是抗氧化
系统中的非酶抗氧化剂 [ 4] 。 GSH参与清除羟自由
基 ,维持胞内氧化还原状态 [ 22] 。ASA能够清除一系
列的 ROS,包括超氧化物阴离子 、氧自由基及过氧
化物等 [ 23] 。本实验中 ,含量升高的 ASA和 GSH参
与消除披针舟形藻细胞内升高的 ROS。
在低盐与高盐胁迫下 ,披针舟形藻胞内抗氧化
酶活性及抗氧化剂含量呈现相似的变化趋势 ,随着
胁迫程度的增大 ,四种抗氧化物酶的活性和两种抗
氧化剂的含量都协同增加 ,这与报道的其他藻在盐
胁迫下抗氧化系统的变化不同。海洋绿藻石莼的
SOD活性只在 12%及 15%的高盐胁迫下有显著增
强 ,而在低盐胁迫下无明显变化;CAT的活性在低
盐及高盐胁迫下都有增强;而 APX的活性在高盐胁
迫下增强 ,在低盐胁迫下减弱;ASA含量在高盐胁
迫下下降 ,在 1.5%的低盐胁迫下上升;而 GSH的含
量只在低盐胁迫下有所增加[ 14] 。耐盐绿藻杜氏藻
在长期盐胁迫下 SOD, CAT和 GR活性没有明显的
变化;而 APX只在高盐胁迫下活性增强;高盐胁迫
下 ASA含量增加 ,低盐胁迫下有些许减少;而 GSH
含量只在高盐胁迫下有所增加 [ 1] 。
本研究显示 ,在长期低盐和高盐胁迫下 ,广盐性
硅藻披针舟形藻四种抗氧化酶活性和两种抗氧化剂
含量协同增加 ,这说明细胞内抗氧化系统在披针舟
形藻耐盐机制中可能发挥了重要作用 ,与藻细胞能
够耐受广盐性环境密切相关。
另外 ,硅藻作为饵料生物 ,其营养价值的决定因
素是藻类的生化组成(脂肪酸 、固醇类 、氨基酸 、糖
类 、矿物质及维生素)[ 24] ,影响硅藻生化组成的胁迫
因素会影响其作为生物饵料的营养价值 [ 25] 。实验
发现在盐胁迫下披针舟形藻 ASA和 GSH等含量明
显增加 ,这些生化组成的变化会影响其营养价值 。
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(下转第 24页)
192010年 9月 焉婷婷等:广盐性硅藻披针舟形藻在长期高盐
的反共变特征 ,模态 2则为负值区 ,仅在莱州湾部分 区域出现少数正值;
　　4)模态 1和模态 2的时间系数曲线是不一致
的;模态 1的系数曲线变化较平缓有明显的年际周
期和年内振荡 ,而模态 2的时间系数曲线开始变化
较平缓 ,至 2007年振荡剧烈 ,系数绝对值达到最大。
5)95%置信限的离散功率谱方法分析第 1模态
的显著性变化周期表明:曲线明显的波峰波谷 ,但只
有 3个位置超过置信限的水平 , 分别位于横坐标
11 , 12, 13,其代表的周期为 10个月 ～ 12个月。
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