全 文 ：第 3 1卷 第 l 期
19 .3年 a月
山 东 海 洋 学 院 学 报
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r a。 , 19 83
两种绿藻一长石纯和袋礁膜原生质体
的制备 、 培养和融合的研究 `
张大力
(陕西师范大学 )
原生质体是研究植物遗传工程的好材料 [ ’ 〕。 自从 C oc ik n g L 2 1 ( 1 9 6 0 ) 首次用酶解
法从蕃茄根尖分离出大量原生质体以来 , 高等植物原生质体的研究 已经开展得比较广泛 ,
但由于技术上的原因 , 目前从原生质体诱导出完整植株的还只限于烟草 、 矮牵牛 、 石刁
柏 、 油菜和马铃薯等十余种工“ l 。 而藻类方面的工作则报道甚少 。 M i or sl a v[ 碑 I ( 19 70) 用蜗
牛消化腺提取液处理尾丝藻 ( U r 。解 m a g ￡g郎 ) 得到了原生质体 。 用含有葡萄糖和果胶
的培养基培养 , 观察到了细胞壁的再生和细 胞 分 裂。 R i et e m a[ ” l ( 1 9 73) 由枝 丝藻
(刀er be : ia t o n iu : : i m 。 ) 挤压出原生质体 , 并得到了再生植株。
近年来 , 植物原生质体已被广泛地用来研究体细胞融合 。 C a lr s o n[ “ 1 ( 1 9 72 ) 首次
获得了烟草种间的体细胞杂种植株 , 为 体 细 胞 融 合 的研究开辟了新的纪元 。 K a ol 7 1
(1 9 7 4) 创建了 P E G 高 频率融合法 。 从此这方面的工作发展十分迅速 , 目前已有二十多
个体细胞杂种植株工“ l。 但其中大部分都是茄科植物 , 藻类方面 尚未见报道 。
本实验的 目的在于探索分离 、 培养和融合绿藻原生质体的方法 , 为海藻遗传的研究
开辟一个新的领域 。
材 料 和 方 法
1
. 培养基
本实验所用 M P E S 培养基是在 P E S L ” l配方的基础上外加 N a H C 0 3 4血M 、 N o N o 3
s p mP 和 N a H Z P O 4 IP pm而成 。 用 G 6 砂芯漏斗过滤除菌 。 高渗培养基用万a CI 调制 , 低
渗则用蒸馏水调制 。
1
、 材料的采集及预处理
两种绿藻一长石苑 ( U 乙。 a L ￡n z a L ) 和袋礁膜 ( M 0 0 0 s 亡r o 摊a a ,“ ￡c a ” a K了e 乙艺胜 )
均采自·青岛沿海潮间带的礁石上 。 长石苑在元月 、 三月 、 四月和五月进行 , 袋礁膜在三
月 、 四月和五月进行 。 采集到的材料用培养基反复冲洗直至镜检无附着杂藻时为止 。 然
后置于含抗菌素 (青霉素 62 iu 加 1 , 双氢链霉素 S O iu 加 1 , 红霉素 2 01 。 m/ 1四环素 2 i0 u m/ 1
和氯霉素 0 . 0 4m s/ m l) 的培养基中 , 在常规条件下培养 。 五天后 , 换无抗菌素的培养基
塔养备用 。 为检验藻体是否无 菌 , 每个叶状体撕下一小块 , 放到固体培养基 (含琼脂
G %
、 酵母提取液 Zm l / I Om l 和葡萄糖 2 % ) _七培养 。 三天后 , 检查有无菌落发生 。 如
本文于 1。日2年 2月 10 日收到 ,
釜本文系山东海洋学院 19 7 8届 研究生毕业论文 , 由方汤拙叹教授指导 .
5 5山 丈二 、李 宁羊 守七 院 学 报 19 3 5年
果一次处理不能做到无菌 , 可再用抗菌素处理一次 。
l
、 原生质体的制备
将无菌材料切成小块 (约 Zm m ) , 取两小块测其渗透压 , 再 取两小块用不同浓度的
高渗葡萄糖溶液保温处理四小时 , 放入海水中恢复半小时 , 以确定最适的高渗浓度 。 将
材料放入用高渗葡萄糖溶液配制的纤维素酶 ( o on z u ka R 一 10) 和果胶酶 ( s g im a 公司生
产 ) 的混合液中 , 温箱中保温培养。 待叶状体小块中央的细胞开始松动 ,边缘放出原生质
体时 , 停止保温 , 加入一定量的低渗培养基并迅速混合 , 使其最终渗透压比等渗略低 。
轻微振荡数次 , 立 即加入一定量的高渗培养基 , 使最 终渗透压比等渗略高 。 用 4 0 目筛
绢滤去未解壁的细胞团块。 5 0 转 /分离心 3 一 5 分钟 , 去上清液 。 再用高渗培养基洗涤
离心三次 , 收集原生质体备用 。
少 、 原生质体 的鉴定
为检查去壁是否完全 , 采用了三种方法 : l ) 用含等渗葡萄糖的 0 . 1% 荧光增白剂
染原生质体 , 置荧光显微镜下观察有无荧光产生 , 以确定纤维素的有无 。 名 ) 用相差显
微镜直接观察 。 3 ) 取一小滴原生质体滴于载玻片上 , 加一滴蒸馏水 , 在普通光学显微
镜下观察原生质体破裂后有无残壁 。
V
、 原生体质的培养
将一滴原生质体 (约 50 lt[ ) 滴于培养皿中的小玻片上 ( 2 ) ; Z Cm ) 静置数分钟 , 待原
生质体沉淀于玻璃片上以后 , 缓缓加入等渗的培养液 Z o m l , , 在常规条件下培养 。 二十
四小时后换不加 N a CI 的培养液 , 以后每星期更换一次 。 肉眼可 以看见小植株时 , 将玻
片置于 5 0 m l 三角瓶中培养 。
为 了找出最佳培养菇 , 本实验 以 M P E S 培养基 为基础 , 运用 L 6 ; 4 “ ` 正 交 表设计
了 6 4种培养基 [ ’ ` ] I ` 2 1 , 对细胞激动素 ( K T ) 、 p引噪 乙酸 ( I A A ) 、 亚铁离子 ( F e 十 + ) 和
维生素 C ( V i t . c) 分四个水平进行考察 (表 1 ) 。
表 1 L 6 4 4 : ’ 正交试验的因素和水平
少度 p p m 囚水 平 人K l , BI A A 夕F e DV i t C
510
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硕 、 原生质体的融合
将袋礁膜原生质休与二倍体积的 0 . 0 1 % 巾性红溶液 (含葡萄糖 1 . 4 M ) 育昆合 , 10 分
钟后用加有 1 . 75 % N a cl 的培养液洗涤离心三次以除去多余染料 。 染好的原 生 质 体 按
2 : 1 的比例与 长石苑原生吹体混合于 小 培 弃 皿 中 , 加 入含有 1 . 4纬 N a cl 的培养液
10 m l
。 静 10 分 钟后用注射器将 _ [ 面 的培养液吸去 。 原 生 质体的密度以盖满皿底为宜
缓缓加入 P E G 融台 i夜 5 m l , 适文旅荡 , 温 滚 , i ,保溢一定时间 , 加入洗涤液 15 m l 。 睁置
1 5分钟后吸去上清液 , 反夏三次 。 用外加 1 . 1% N a CI 的培养液适度稀释 。 用分离海带
1 期 两种绿藻一长石苑和袋礁膜原生质体的制备 、 培养和融合的研究 5 9
配子体的方法 [` 。 ( l方宗熙等 , 1 9 7 8 ) 将异质粘连的 细胞分离于小玻片上 , 加一滴培养
液 , 于常规条件下培养 2 4 小时 , 换等渗培养液继续培养观察 。
结 果
I
、 影响原生质体质量与产量的因素
材料的年龄和生理状况是影响原生质体质量和产量的首要因素 。 长石纯 以元月至三
月份的材料为最好 。 此时藻体为管状或很窄的带状 , 细胞质较浓 , 色暗 绿 , 细 胞 壁 较
薄 。 以后随着材料年龄的增大 , 不仅原生质体的产量降低 , 而且活性也差 。 及至七月以
后 , 藻体老化 , 很难得到有活力的原生质体 。 袋礁膜则以三月至四月初的材料为好 。 此
时藻体为幼小的膜状 , 色绿 、 质浓 、 壁薄 。
第二个因素是酶液的渗透压 。 处理前测得长石药细胞的渗透压为 1 . 4M 糖浓度 , 袋
礁膜为 1 . 3M 糖浓度 。 但从表 2 可以看出 , 石毙的最适酶解渗透压为 ZM ,礁膜为 1 . 75 M 。
高于或低于此渗透压 , 成活率都明显下降 。在此渗透压下 , 细胞质浓缩 ,放出的原生质体
仍为正常的绿色 。 酶液渗压高于等渗而低于最适渗透压时 , 原 生质体发黄 。 渗透压过
高 , 原 生质体发黑 。 这两种原生质都不能成活 。
表 2 酶液渗透压对原生质体成活率的影响乖…二}二〕泣卜令二适当提高酶的浓度对原生质体成活是有益的 。 表 3 的数据表明 , 以纤维素酶 4 写和
果胶酶 2 %最好 。
酶解的温度与原生质体成活率也有着密切的关系 。 从表 4 可以看出 , 在 3 ℃ 以下原
生质体成活率随着温度的升高而提高 , 而超过这一温度就要下降。
表 3 酶液浓度对原生质体成活 率的影响
酶液号
滋维素酶浓度多
果胶酶浓度拓 _
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石铆子体 , . … ` . .… “ 二 ` 2 3 {. ’ 。 `二石纯配子体多
6O
表 4
山 东 海 洋 学 院 学 川 1 0 8 3年
酶解温度对原生质体成活率的影响
醉 解 温 度 ℃ . 2 : 1 2。 … 3。 ` 。。 1 37
石 纯 抱 子 体 转 { 2 4 { 3 1 } ` 0 1 6了 { 2 1 { 3
石 纯 醉 子 休 终 { 20 37 { 49 { “ 18 9
礁 膜 , } ’ “ ; 3 5 { 5 0 、 7 2 . , 3
实验表明 , 酶解后的低渗透压冲击对提高原生质体的产量是完全必要的 , 有时甚至
会关系到实验的成败 。 冲击液的渗透压要视酶解情况而定 。 过低则原生质体大量破裂 ,
过高则效果不明显 。 在本实验中冲击渗透压均比等渗液低 。 . IM 糖浓度 。
制备原生质体的一般程序可总结如下 :
1) 测定实验材料的渗透压 , 以确定冲击液浓度 (以低 0 . IM 糖浓度为宜 ) 和洗涤液
浓度 (以高 O . I M 糖浓度为宜 ) 。
2) 测定材料耐高渗透压的能力 , 以确定酶解液的渗透压 。
3) 高渗酶解 , 适当提高酶的浓度及温度 。
4) 低渗透压冲击 。
5) 高渗透压洗涤 , 收集备用 。
遵 此程序 , 作者还对碎苔进行了实验 , 亦得到了大量有活力的原 生 质体 。 可以设
想 , 只要有了合适的酶 , 此法可能也适于其他潮间带海藻 。
I
、 促进细胞分裂
表 5 列出了长石茹原生质体在 64 种培养基中培养三夭时的细胞分裂百分率 。 表 6 是
表 5 长石药原生质体在不同培养墓 中的分裂率
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1 2 一 4 1 」 3 7
对这些数据进行的方差分析 。 不难看出 , A 、 B 和 C 所代表的 K T 、 I A A 和 F e 土` 对细胞
分裂有显著作用 。 K T与 I A A 之间 , K T与 eF ` + 之间都有显著的交互作用 , 这与 rP o v a -
5 01 1 ` 3 J ( 1 9 5 8) 的实验结果相吻合 。 为了找出最好的搭配 , 计算了 A B 、 A C 各种搭配的
平均细胞分裂百分率 , 列于表 7 。 从表中可以看出 , A B 以 A 3 B , 的搭配 ,即 K T 0 . l p , 的
和 I A A 0 . 05 pmP 为最好 。 A C 则以 A 3 C : 、 A 3 C 3和 A Z C 3的搭配为最好 。
1 期 两种绿藻一长石纯租袋礁膜原生质体的制备 、 培养和融合的研究
表 6 L 6 4 4“ 1正交试验的方差分析
方 差 来 源 平 方 和 自 由 度 { 均 方
F 值 显 著 性
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总 计 1 16 39 6 3 { 一
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表 7 A B 、 A C 各搭配 的平均细胞分裂百分率
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1 3 , i “ 7 }
维生素 C 的作用不显著 。 但后来的单因子实验表明它对第二次和以后的分裂却有显
著的促进作用 (表 8 ) 。 因此 , 这并不意味着 vi t . c 不起作用 ,而只能说明在第一次分裂
时细胞内可能已有足够的 v it . c 。
综上所述 , 长石茹原生质体的最佳生长培养基 可 能 是 A 3 B 3 C Z D : 、 A 3B 3 C 3 D : 或
A Z B Z c 。 D :
。 表 9 是对这三种培养基进行的补充实验和这些培养基对袋礁膜细胞分裂的
影响 。 从表中可以最终确定 : 石苑原生质体的最佳生长培养基是 A 3B 3 C ZD : , 即 K T 0 . 1
p , 口 , IA A 0 . 0 5 p pm , F e 十 十 s p , 口和 V i t .哎 i o op脚 ; 礁膜为 A Z B : C 3 D 3 , 即 K T o . 0 5p p m ,
I A A O
。
0 1 P Pm
, F e 十士 I Op Pm和 V i t c . 1 0 0p Pm 。
表 8 V i t 。 c对促进细胞分裂的作用
V i t
.
e 浓度 P Pm
表 9
培 界 基
三种培养基对细胞分裂的促进作用
对 照 A : B 3C : D , A , B a C o D s A * B a C s D s
长石纯细胞分裂率多
委确膜细脑分裂本终 一卜一二立一一卜共{ e 3 1 . }
山 东 海 洋 学 院 学 乎陡 一 9 8 几年
I
、 促进植株再生
用上述6 4种培养基对长石茹和袋礁膜原生质体进行再生株诱导 , 发现只有 3号 、 」号
和 2 号培养基最好 。 一长石药的诱导率分别是 42 % , 42 % 和 36 % , 袋礁膜的诱导率分别为
5 1%
,
5 % 和 59 % 。 这三种培养基都不含 K T和 I A A , 只含有 F e ` ” 和 v i t . c 。 方宗熙等 [ ’ 4 1
( 19 74 ) 的实验表明 , v it . c 对海带配子体的发育有明显抑制作用 。 对石药和礁膜的植株再
生有无抑制作用 ? 进一步的实验表明 , 这种抑制作用是存在的。 只要用不含 v i t . c 的 2
号 、 3 号和 4 一号培养基 , 即只有 F e ` 十 s p pm , 1o p pm 和 i s p p m , 植株再生率可显著提
高。 长石药为 40 % 、 51 %和 57 % , 袋礁膜为 5 4% 、 60 %和 62 % 。 由此可以认为 , 15 P m
的 F e 十 + 对于诱导植株再生是有效的 。 以后对渗透压的实验表明 , 若将细胞团先后在低
渗的培养基中 (长石茹 : 培养基 : 蒸馏水为 7 : 3 , 袋礁膜 : 6 : 4) 处理 24 小时 , 再用
F e + 十 诱导 , 植株再生率可显著提高 (长石茹 71 % , 袋礁膜 85 % ) 。
VI
、 对原生质休生长和植株再生的观察
长石苑原生质体 ( 图片 1 ) 在培养 24 小时后即长出新的细胞壁 , 经过莹光增 白剂染
色后 , 在紫外线激发下 , 有明显的莹光产生 (图片 2 ) , 而且在低渗溶液中不破裂 。 48 小
时后色素变浓 。 培养 72 小时开始出现第一次分裂 (图片 3 ) 。 以后每两天分裂一次 。 前
三次分裂在水平方向进行 。 从第四次开始出现不规则的分裂。 继续培养 15 天 ,开始形成细
胞团 (图片 4 ) 。 经诱导 , 细胞团由园变长 (图片 5 ) 。 5 一 10 天后 , 其一侧开始分化出假
根 (图片 6 ) , 另一侧继续延长轴分裂 。 此时植株的再生已经完成 , 可以停止诱导而转移
到生长培养基中促进其生长 。 约培养两个月 , 小植株长成管状幼苗 , 顶端开始变得扁平
(图片 7 ) 。 经一年的培养 , 再生植株已成熟 。 对生植细胞鞭毛的观察表明 , 来源于配子
体的原生质体 , 其再生植株仍为配子体 , 来源于抱子体的 , 其再生植株仍为抱子体 。
袋礁膜的原生质体 (图片 8 ) 培养 24 小时后长出新的细胞壁 (图片 9 ) , 且细胞中的
色素体由原来的侧位运动而成水平位置 [ ’ ” l 。 培养 72 小时 ,开始第一次分裂 (图片 10 ) , 15
天形成细胞团 ( 图片 1 1 ) 。 经诱导 , 下面外围的细胞伸长成 假 根 。 上部中间的细胞色素
变浓 , 并在长出假根 10 天后开始分裂进而长成管状幼苗 (图片 12 ) 。 但经一年的培养始终
是管状 (图片 1 3) , 而不建成正常的形态 , 也不成熟 。
V
、 影响原生质体融合的因素及杂种细胞的行为
原生质体质量的好坏 , 直接影响着融合率的高低 , 甚至决定着融合的成败 。 只有用
幼嫩新鲜的藻体制备的原生质体进行融合才有可能成功 。 这一点与高等植物的情形完全
相同 [ , 1。
从表 10 可以看出 , 融合液以 P E G 0 . ZM , 葡萄糖 。 . SM 最好。 在这种融合液中 , 原
生质体开始粘连 (图片 1 4) , 用洗涤液洗涤时即开始融合 (图片 1 5 、 1 6) 。
表 10 原生质体在不同融合液中的融合率
融 合 液 号 1 2
{
3 4 5 …6 . 二- 一 生 _ … 9 1 0 1 1 ! 1 2- -一 {- - - -P E G ( r ` 4 0 ) M O 0 1 0 . 2 0 . 4 } }— — } 一一 0 . 1 0 . 2于一书一 。 · 1 一 。 · 2 。 · 4 0 1 . 3筋萄德 M 0 。 5 0 . 5 0 . 5 0 . 5 1 . 0 一 1 . 3 1 . 3 1 . 31 . 0 1 . 0 1 . 0
融合率 筋 一
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1期 两种绿藻一长石药和袋礁膜原生质体的制备 、 培养和融合的研究
表 n为不同洗涤液对融合的影响 。 从表中可以看出 , p H 9 . 01 盐度 4 5 . 5筋 时融合
率最高 ; , 可达 、 6 2编 。
表 1 不同洗涤液对融合的影响
8 八 1 2
11
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融合率 汤
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虽然提高融合温度可以增加细胞膜的液性 ( n u i d it y) , 从而提高融合率 [ ` “ l , 但由
于原生质体在制备时已受过高温刺激 , 融合的温度不宜过高 , 时间也不宜过长 。 实验表
明 , 先在 3 ℃ 下保温 15 分钟 , 然后置室温下 (2 o℃ ) 效果最好。 如果在 3 ℃ 下保温 60
分钟 , 虽然可以提高融合率 ( 1 0 2编 ) , 但在以后的培养中全部死亡 。
用原生质体的生长培养基对分离出的异质融合的细胞进行培养 , 48 小时后长出新细
胞壁 。 四天后开始第一次分裂 (图片 1 7) 。 分裂过程比正常情况下缓慢得多 , 经过三天 ,
两个子细胞间的新壁才明显长成 。 以后的分裂逐渐正常 。 20 天后形成自养的细胞团 (图
片 1 8) 外观上看起来有些象礁膜 。 用前面提到的方法诱导 , 尚未得到再生植株 。
讨 论
绿藻的原生质体在制备方面和培养方面都具有一些与高等植物不同的特点 , 下面分
别加以讨论 :
1
. 酶解需要一定的高渗透压 ,低于此渗透压 , 即使在等渗以上细胞膜虽不破裂 ,但大
量死亡 。 这种现象似乎可以作如下解释 : 长石药和袋礁膜都属潮间带海藻 , 退潮以后即
暴露在阳光下 , 因而高温环境总是伴随着高渗透压而发生的 , 藻体由于高渗而失水 , 细
胞内的新陈代谢不能正常进行 。 此时藻体可能是处于一种休眠状态 , 顺利地渡过高温 ,
涨潮后继续进行正常的生命活动 。 渗透压较低时 , 细胞内仍有足够的水份 , 因而不能进
入休眠状态 , 经不住高温刺激而死亡 。 酶解时温度比较高 , 因此适当的高渗透压对保证
原生质体的成活是必不可少的条件 。
2
. 原生质体的成活率 ,在一定的范围内 , 随着酶浓度和酶解温度的提高而提高 。 而
高等植物则往往用降低酶浓度和酶解温度的办法来提高原生质体的成活率 。 这可能是由
于藻类细胞不能忍耐长时间的高浓度糖溶液环境所引起的。 因为在预实验中曾发现 , 即
使在不加酶的糖溶液中细胞也不能超过 6 小时 , 否则大量死亡 。 而酶浓度或酶解温度降
低时 , 时间就要延长 , 因而降低了成活率 。
3
. 无论是高等植物 I ` 7 ]还是尾丝藻 t ` l的原生质体 , 再生细胞壁均需外加碳源 , 而
本实验所用的两种绿藻则不需要 。 高等植物的原生质体一般是用叶片或根尖制备 的 [ ` ]。
由于组织分化程度很高 , 叶片和根尖一般不具贮藏功能 。 这样的原生质体没有足够的碳
源贮备 , 不能形成完整的细胞壁。 由于培养条件与自然条件差别太大 , 叶肉原生质体不
能进行正常有效的光合作用 。 因此 , 外加碳源就成为必不可少 的了 。 而藻类的分化水平
州6 4 山 东 海 洋 二犷 院 份
较低 , 叶状体细胞兼有光合作用与贮藏的功能 。 因此 , 无需外碳源 。 尾丝藻的原生质体
是用 蜗牛消化腺提取液制备的 , 之所以需要外加碳源 , 可能是由于提取液中的某种成份
使原生质体受了伤害 , 不能进行有效的光合作用 ; 贮存的碳水化合物又不足以用来形成
新壁 。
4
. 关于低渗冲击在高等植物方面尚未见报道 , 藻 类之所以需要低渗冲击是由于在
藻体的外表有一层胶质 , 其成份很复杂「 ’ 5 ] , 纤维素酶和果胶酶只能将其部分消化 , 这
样 ,在低渗的冲击之下 , 原生质体可以从叶状体小块的边缘放出 。 此法对于高等植物 ,特
别是对于一些制备原生质体比较困难的种类 (或组织 )是值得一试的 。
绿藻的原生质体具有制备方便 , 培养成活率高和再生能力强等优点 。 因此 , 为藻类
生理生化及染色体组型的研究 , 提供了良好的实验材料 , 并且进行融合和转化等遗传 I
程方面 的工作也要比高等植物为好 , 深入进行这方面 的研究有着极其重要的意义 。
参 考 文 献
〔 1 〕 eR i n e r t J . a n d aB j a i Y . P 5 . : P l a n t C e l l , T i s s u e a n d o r g a n C u l t u r e . S P r i n s e r -
V e r l a g B e r l i n
, 一9 7了 .
〔 2 ) C o e k z n g E . C . ( 1 0 6 0 ) : A m e t h o d f o r 15 0 ]a t i o n o f P l a n t p r o t o p l a s t s a n d v a e u o -
I e s
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N a t u r e
, 1 5了 , 6 2一 9 0 3 .
( 3 〕 李向辉 : 植物原生质体融合和遗传操作 《基因的天性繁殖 》 . 科学出版社 , 19 8 1 .
〔4 〕 M i r o s l a 丫 G . ( 1。 了。) : F o r m a t i o n , g r o w t h a n d r e g e n e r a t i o n o f P r o t o P l a s t s o f t h e
9 r e e n a l g a U r o 佗 e附 a g i g a s P r o t o P l a s扣。 a , 7 0 1 5 5一 3 5 .〔 5 ) 孙 e t e m a H . ( 29 7 3) : T h e I n f l u e n e e o f d a y l e n g t h o n t h e m o r P h o l o g y o n t h e H y -
1 i c y s t i s P o r v u 了a p h a s e o f D e r b e : i a t e n u f s , i附 a ( D e N o t . ) C r n , P五y e o l o g y 12 ( 一八 ) , -
1 1一 16 1 115 .
〔 6 〕 C a r l s o n P . 5 . o t a l ( 10 72 ) : aP r a s e x u a l 一n t e r s P e e i f i e P l a n t h y b r i d i s a t i o n P r o e .
N a t ]
.
A e a d
.
S e i
.
U
.
5
.
A
.
6 , 2 2 9 2一 22 9 4 .
( 7 〕 K a o K . N . (一。 74 ): A m e t h o d f o r h i名h 一 f r e q u e n e v i n t e r g e n e r i e f u s i o n o f p l a n t v r o -
t o P l a s t s
,
P l a n t a z x s 5 35一 3 5 了.
〔 8 〕 吴栋 ( 19 75) : 植物细胞杂交研究的现状 . 细饱生物学杂志 , 1 98 1 ( 1 ) 巧一 1 8 .
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g a m
a n P r e s s
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19 7 7
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〔一3〕 P r o v a s o l i L . ( 2 0 5 8 ) : E f f e e t s o f P l a n t h o r m o n e s o n U忿v a . B i o l . B u l l . 1 4 4 3了5一 3 8 4 .
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〔15〕 F i t s e h F . E . : T h e s t r u e t u r e a n d r e P r o d u e i t o n o f t h e a l g a e . V o ] . 1 C u p一
V i k a
s S t u d e n t s
’
E d d i t
o n x。 了7 .
〔一6〕 S e n d a M . e t a l ( 1 0 5 0 ) : E f f e e t o f t e m P e r a t u r e o n m e m b r a n e e f l u i d i t y a n d p r o t o -
p l a s t f u s i o n
.
T h e o r
.
A p p l
.
G e n e t
.
5了( l ) 5 3一 36 .
〔l 了〕 D e n n i s N . B u t u r e a n d D a v i d 5 . I n g r a m : P l a n t T i s s u e C u l t u r e E d w a r d A r n o l d . l o 7 6 .
山 1 {万种绿藻一眨石纯和袋礁膜原生质体的制备 、 培养和融合的研究 七; 6
电 S rf’ U D Y ( _) N ` rH E P R O T O P L 、气S T P R E P 八 R 八 T IO N ,
C U L T U R E A N D F U S I O N O F
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F R O M
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Z h a n g D a l i
( S h a 儿义 乞 N o r 机刀艺 U n i u e r s i t y )
A b s t r a e t
.
.
.
T h e P r e s e n t P a P e r d e s C r i b e s s o m e o f t h e e x P e r im e n t s o n t h e P r e P a r a t i o n
,
e u l t u r e a n d f u s i o n o f s o m a t i t c e l l s f r o m U
。
Zn z a a n d M
。 a 儿 g 乞e a 刃 a 。 T h e
m a i n r e s u l t s a r e a s f o l l o w s
:
( 1 ) P r o t o P l a s t s o f t h e t w o s P e c i e s w e r e o b t a i n e d b y m e a n s o f t r e a t i n g
t h e t h a l l i w i t h h y P e r t o n i c e n z y m e s o l u t i o n
, s h a k i n g t h e m b y a s u d d e n d e 一
e r e a s e o
sm
o t i e P r e s s u r e a n d w a s h i n g t h e川 w i t h h y P e r t o n i e s e a w a t e r m e d i u m .
T h e o P t加 n m c o n d i t i o n s o f P r e P a r i n g t h e P r o t o P l a s t s o f b o t h s P e c i e s w e r e
i n v e s t i g a t e d
.
( 2 ) A f t e r a 2 0 一 d a y , 5 c u l t U r e i n t h e M p E S m e d i-mU
a d d e d w i t h K T
,
IA A
, F e + + a n d V i t
.
C
, e a e h o f m o s t P r o t o P l a s t S u n d e rw e n t e e l l d i v i s i o n a r d
d e v e l o P e d i n t o a u t o t r o P h i e c e l l m a s s
。
T u b u l a r g e r m l i n g s w e r e i n d u c e d b y
t r e a t i n g t h e m a s s e s w i t h t h e M p E S m e d i u m d i l u t e d w i t h d i s t i l l e d w a t e r
f o r 2 4 h o u r s a n d t h e n c u l t u r i n g t h e m i n t h e M P E S m e d i u m a d d e d w i t h
F e
上 + .
N o r m a l U
.
Z乞n z a g r e w u p u n d e r a b a e t e r i a 一 f r e e e o n d i t i o n . l t w a s a l s o
o b s e r v e d t h a t t h e 了 r o t o P l a s t s i s o l a t e d f r o m t h e s P o r o P h y t e s o f U 。 忍葱儿 z a
e o u l d o n l y r e g e n e ar t e i n t o s p o r o p h y t e s a n d t h o s e f r o m g a m e t o p h y t e s o n l y
i n t o g a m e t o P h y t e s
。
( 3 ) T h e e f f e e t s o f d i f f e r e n t e o n c e r n t r a t i o n s o f K T
, I A A
, F e 十
+ a n d V i t
.
.
C o n P r o m o t i
r g e e l l d i v i s i o n a
: d i n d u s i n g P l a n t r e g e n e r a t i o n w e r e e x a 一
m i n e d n y t h e o rt h o n g o a l e x P e r i m e n t a l m e t h o d
.
T h e f r e q u e e i e s o f s u e e e s s i
-
g r e e n a l g a e w e r e o b i o s l y h i g h e r t h a n i n a n y h i g h e r
: , a n t s
.
( 4 ) T h e f u s i o n o f t h e P r o t o P a s t s o f U
.
Z乞n z a a n d M . a 儿 g 乞e a u a w h i e五
w a s l a b e
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e d w i t h o
, 0 1% n
e u t r a l r e d w a s i n d u c e d b y p E G
.
T h e i n t e r g e n e -
r i e h y b r i d e e l
, 5 w e r e i s o l a t e d a n d e u l t u r e d w h i e h f o r r o e d i n t o a u t o t r o P h i e
e e l l m a 邵 e s 。
两种绿藻一长石纯和袋礁膜原生质体的制备 、 培养和融合的研究 图板 I
图 版 说
1
. 新制备的长石药原生质体 艺
3
. 长石药原生质体分裂 4
5
. 长石药细抱团 伸长 6
7
. 长石苑的再生植株 8
9
. 荧光增白剂染色 , 示袋礁漠细咆壁再土 10
n
. 袋礁膜的自养细胞团 12
13
. 袋礁膜的管状幼苗 14
1 5
. 细胞的融合 16
17
. 杂种细胞分裂 18
明
. 荧光增白剂染色 , 示长石药细咆壁再生
. 长石药 的 自养细胞团
. 长石药细胞团分化出假根
. 新制备的袋礁膜原生质体
. 袋礁膜原生质体分裂
. 袋礁膜的分化
. 细月包粘连
. 融合的杂种细地
, 杂种细 at]J 团