全 文 ：第从卷 湾 扮理
, , 8 4年 6 月
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l 东 海 洋 学 院 学 报
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一 铭诱导孔石纯合成金属硫蛋白
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(me 饭lo hit on e i句的初步姗究
赵学武 王作芸
( 工洋子日犯于系)
金属硫蛋白是生物体中可由重金属 诱导而产 生的 一种 小分子蛋白质 , 与生物的重
会属中毒现象密切相关 , 井可能参与锌和铜在生物体中的正常 代谢过程 f ’ · 2 , ” 1 。 以往
在海生哺乳类 〔4 1 、 鱼类 t 5 1 、 甲壳类 工“ 1和贝类 L ’ 1等动物中曾发现此种蛋白质 , 其主要
特征均与 M a r g a s h e a n d v a 一l e e 一泞次在马肾皮 质部 发 现 的金 属硫 蛋 白 (m e t a 一10 -
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。 以后简称 M T . )相似 [ “ 1 。 但在海洋以及淡 水藻类 中的 情形如何 , 迄今仍无
报道 。
孔石苑是我国沿海广为分布的一种定生藻 , 杭污染能 力较 强 , 对它进行 M T . 的研
究 , 除能探讨重金属一般性的生理代谢规律及其中毒现象与解毒机理外 , 还可探索多年
生的定生藻体 内特殊蛋白质的含量 , 以作为监测海洋环境污染的生理指标之一 。
材 料 和 方 法
孔石珑采自青岛太平角湾 , 用人工海水 (配方见 H a r y 。 y . 1 9 5 . )充分洗净后 , 诱导
组用人工海水加 C d S O ` , 海水中 c d ’ ` 浓度为 SP mP , 对照组不加 C d “ , 在室内培养 ,
每夭更换一次培养液 。 四天后 , 再用人工海水将海藻洗净 , 放入 一 15 ℃冰 箱 中 冰冻 48
小时 , 在研钵中加石英砂研磨匀浆 ,加二份体积的 1%T r i ot n 一 10 0 、 0 . 1 %仔一 疏 基 乙 醉 的
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。
i M 碑酸缓冲液 , p H 7 。 6充分搅拌提取 , 先在 2 , 0 0 0 9 4℃ 离心 10分钟 , 再在 1 5 , 0 0 0 9 4飞:
离心 30 分钟 , 将上清液加热到 60 C保温 1分钟后 , 迅速放入冰浴中冷却 , 经 1 8 , 0 0 0 9 4℃离
心 3 0分钟 。 上清液加 ( N H ; ) : 5 0 ; 至 6 0% s , 放入冰箱中过夜 。 次日 , 2 0 , 000 9 4 rC 离心2 0
分钟 , 将滩液加入 3 . 8毫升 1%琉基 乙醇 0 . 0 1M T r ss 一 H e l 缓冲液 , p H S . 6 溶解 , 在 4 f ( ;
下放置一天后 , 1 8 , 0 0 0 9 4 ` C离 心 3 0分钟 , 经 s e p h a d e x o 一 7 5 层析柱 ( 2 . 7 x i 0 0 e m ,
用兰聚精标定 v 。 、 用细胞色素 C 和胰酶分别标定其 V e ) , 用 O . 01 M T ir s一 H cl 缓
冲液 , PH S . 6 , 洗脱 , 用分部 收集器 收集洗脱液 。 然后用上海仪器厂 751 型分光光 度计
测定 2 5O n m 和 2 8 On m 的消光曲线 , 用北京光学仪器厂 w Y Z原子吸收分光光度计测定
c d
千 干 浓度曲线 。 将 M T 分子量的收集液集中 , 经 D E A E 纤维素柱 ( 1 . 7 x 3 5 c m ) ,预先用
卞文于 1 , 8 ,年 1月 . 日收到 ,
竺 期 痛诱导孔石苑台成金属硫蛋白的初步研究 49
T r i s 一 He l 缓冲液 , PH S 。 6平衡 ,用 T : 15 一 H e l缓冲液 , pH S . 6和 0 一 0 . 6M N aC I线性梯度浓
度洗脱 , 测定25 0和 28 Omn 吸收曲线及 C d 千 十 浓度 , 并用考马斯兰 G 2 50 〔” 1 测定 C +d + 曲线的高峰处的蛋白质含量及用 5 . 5, 一二硫代二 ( 2 一 硝基苯甲酸 )测定 sH 基含量 t ` ” 1。
.
结 果 与 讨 论
加 c d 诱导之孔石鱿匀浆后 , 经 1 8 , 0 0 09 离心的上清液 C d 之含 量为了声 微 克 /每克
藻鲜重 。 加热至 60 ℃保温 l 分钟 ,再经 1 8 , 0 00 9 离心后 ,上清液的含 C d 的蛋白质 在此温
度下仍可保持溶解状态存留于上清液中 , 加硫酸铁 60 % s 之沉 淀重 溶后的 C d 含 量为
2
.
5微克 /每克藻鲜重 , 含量约为最初匀浆后的上清液之 13/ 。
c d 诱导孔石苑的 se p五ad e x G 一 75 分离图谱中 , 在相当于 分子量 为一万处 , 其25 0
纳米和 28 。纳米的吸收曲线均有一明显的吸收峰 (图 1 ) 。 此处的 峰与 c d 浓度 曲 线相一
致。 cd 在该分子量处也有一高峰 , 最高浓度为 1 。 28 m gm/ (I 图 2 ) 。 孔 石茹诱 导组的 c d
浓度曲线共有三个高峰 , 分别在分子量 5 万左右的大分子处 , 一万左右相当于 M T 的分
子量处和小分子量处。 据其 它 学者 对海 洋动物及陆生的哺乳动物的研究报道 , 多数的
c d 浓度曲线均只在相当于 M T 的分子量处 (一万左右 )有一个高峰 ,或是在大分子量也有
一吸收峰 , 但比 M T 分子量处明显降低 [ “ · “ I 。 此一明显差异是否反映出藻类的 M T 与
动物之间的不同 , 值得引起重视 。 石苑与 C d结合的 M T 与动物之 M T s 的差别可能因它
易被氧化成为大分子的双聚体特性 , 而动物与 c d 结合的 M T 一般比较稳定 , 只 有与Z n
或 c u 结合的 M T 易被氧化成为双聚体 , 因而其含 z n 或 c u 的 se p h ad e x G 一 75 分离图
普中 , 也同样出现三个浓度高峰 r ’ 2 · ’ ” 飞。 孔石苑诱导组的 c d 浓度 曲线 之第 一高峰可
能是 M T 氧化后成为双聚体 。 第二高峰是 M T 。 第三高峰是在分子量 5 , 00 以下 , 位于
多肤 、 氨基酸和核酸等的小分子量处 , C d 可能与此类小分子化合 物结合 , 或是以游离
状态存在 。
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洗脱体积数 (毫升 ) 洗脱体积数 (毫升 )
图 1 C d诱导之孔石豌的 s印 ha 此 x 压礼 图 2 C d 诱导之孔石魏的 S却五a de x .G 75
分离图谱一 25 0理 . .“ 280沙 分离图谱
注 : 2 . 7 x 趁o o e m ;流速 , o m l /,J’ 时 注 : 2 . 7又 10 o e m ; 流速 :咖 11小时
0 5山 东 海 洋 学 院 ` 1_ 98寸年
不加 “ 诱导的对照组的 e spha d e xG一 75分离图谱 , 在分子量一万 左右 处 , 不仅
25 。纳米和 2 80 纳米的吸收曲线没有高峰 , 而且 cd 浓度 也很 低 (图 3 , 4 ) 。 cd 的 浓度
曲践 , 大部分是零 , 只有在相当于 5 , 。 0 左右的小分子量处有痕量 c d 。 - . 一 一
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洗脱体积数 (范升 ) 洗脱体积数 (毫升 )
图 3 对照组之孔石药的 eS p h a d e x G 一 7 5 图 4 对照组之孔 石药的 S e p h a d e x G 一 7 5
分离图谱一 250 n m … 2 80n m 分离图谱
注 : 2 . 7 x l o o帅 ; 流速 , o m l l,] 、叶 注 : 2 . 7 x l o o咖 :流速 3 0 m l /小时
将诱导组的 S e p h ad e x G一 75 分离后 , 一万左右分子量的收集液 (洗脱体积 V e 2 4 Cm
一 28 Om l 处 ) , 用 D E A E 纤维素离子交换柱提纯 , 其2 50 纳米和 2 80 纳来的吸 收曲线与
C d 浓度曲线的高峰位置相重合 , 均在 v e 从 65m l 到 s o m l 处 (图 6 , 6 ) 。 C d 在 n E A E
分离图谱中比较集中 , 只有单一高峰 。 而 25 0纳米和 2 80 纳米的吸收曲线 , 除与 C d 高峰
重合处有一高峰外 , 在洗脱的前部也有一小峰 , 但比主峰显著低 。
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洗脱体积数 (毫升 )
图 5 孔石药之 M T 的 D E A E 一 C 分 离
图谱一 25 0呱 , … 28 0 n m
生 : 卜 石x 3` c m : 流速 20 m l I/ 、 叶
洗脱体积数 (毫升 )
图 6 孔石苑之 M T 的 D E A E 一 C分
离图谱 `
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.
7 x 3 5 em ; 流速 Z om l /小时
诱导组之相当于 M T 分子量处 的 A 2 8 o n m 和 A 25 o n m 之 最 高 值 分别 为 0 . 063 和
。 . 09 了, . 两者之比为 1 . .5 而对照组 A 2 8。。 m 和 A翔mn 之最高值分别为 0 . 0 40 和 0 . 05 3 ,
比值为 1 . 3 , 诱导组仅比对照组大约 20 % 。 诱导组的 M T 经 D E A B 离子交换柱提纯后 ,
A Zs o n m 和 ^ ,。。 n m 分别为 2 . 0 1和 2 . 2 0 , 此值为 1 . 1 0 。 而从动物 中分 离的 M T s , 因 其
2 期 隔诱导孔石药合成金属硫蛋白的初步研究 5 1
.
.
氨基酸的组成中芳香族氮基酸残基所 占比例很低 , 所以 A 25 。远 远 高于 A o sot 7 · ” 1 ,
与藻类的 M T 明显不 同 。 是否藻类的 M T 之氨基酸组成的种类和 比例与动物有所不同 ,
尚需通过氨基酸的测定验证 。
对诱导组的 D E A E 分离后的 M T 进行蛋白质和 S H 基的测定结果 , 蛋白质含 量为
7
. 邪 g /m l , s H 基 (以半恍氨酸残基计算 )含量为 1 . 7协g m/ I , 其含 s H 基的氨基 酸 比值
较高 , 符合 M T 的共同特性 。
根据上述结果 , 可以观察出经 c d 诱导后之孔石苑 , 能产生与重金 属有高度亲和力
的蛋白质 ; 分子量在过 s eP h ad e x G 一75 层析中相当于一万左右 ; 具 有 抗 热 性 能 , 在
60 ℃下一分钟不变性 , 并且富含有 s H 基 。 此类特性与目前已知的动物中所产 生 的 M T
相 同 , 由此 ,可证实真核藻类也同样具有能由重金属诱导而产生 M T 的机制 。 但也发现与
动物中 M T 相较之下有其特异之处 , 不仅在大分子处 (非 M T 蛋白质 )也 出现 c d 高 峰 ,
而且 A : 80 n m 偏高 , 因之 , 关于藻类一一孔石药的 M T 特性甚有必要进一步探 讨 。
参 考 文 献
〔 1 〕
〔 2 〕
〔 3 )
〔 4 〕
〔 5 {
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〔 8 〕
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m i e r o g r a m q u a n t i t i e s o f p r o t e i n u t i l i z i n g t h e p r i n e 豆p l e o f p r o t e i介 d y e b i n d i n g .
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s e n e e o f t h e s e P r o t e i n s 15 a l s o e s t a b l i s h e d i n m a r i n e a n im a l s
,
i n e l u d i n g
v e r t e b r a t e a n d 五n v e r t e b r a t e . B u t t h e er 15 n o r e P o r t c o n e e r n e d w 主t h e u -
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I n o u r l a b o r a t o r y m e t a l l o t h i o n e i n w a s i s o l a t e d a n d e h a r a e t e r i z e d
f r o m t h e C d
一 e x Po s e d U 落” a P e r 玄u s 口 。 T h e a l g a e w e r e k e P t f o r f o u r da y s i n
。 r t i f i e i a l s e a w a t e r e o n t a i n i n g o
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m o g e n i功 d a n d i s o l a t e d . T h e f i n a l s o l u b l e f r a c t i o n w a s a P l i e d t o S e P五a 一
d e x G一 7 5 e o l u m n . T h o s e e l u t e d f r a e t i o n s e o n t a i n i n g C d w e r e Po l e d a n d
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P l i e d t o D E A E e e l l u l o s e
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T h e e l u t e d f r a c t i o n s w e r e a n a l y se d
f o r a b s o r b a n e e a t 2 8 0 n m a n d 2 5 0 n m
, a s w e l趁 a s f o r t h e e o n t e 们 t o f e a d 一
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o l e e u l a r w e i g h t P r o t e i n s i t d u e e d b y C d z
` s h o w e d a l o t o f
e h a r a e t e r i s t i e s o f m e t a l l o t h i o n e i n
, s u c h a s t h e h i g h e o n t e n t o f S H
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m o l e e u l a r w e i g h t ( a PP r o x im a t e l y 1 0
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