全 文 ：第 24 卷第 2 期 烟台大学学报( 自然科学与工程版) Vol． 24 No． 2
2011 年 4 月 Journal of Yantai University ( Natural Science and Engineering Edition) Apr． 2011
文章编号: 1004 － 8820( 2011) 02 － 0121 － 05
收稿日期: 2010 － 12 － 10
基金项目: 山东省自然科学基金资助项目( Y2007D16) ; 国家自然科学基金资助项目( 30870199) ;中国农业大学植
物生理学与生物化学国家重点实验室开放课题基金资助项目( SKLPPBKF09008) ; 烟台大学博士基金资
助项目( HY07B16) ．
作者简介: 刘瑜( 1982 － ) ，女，山东蓬莱人，硕士研究生，研究方向:植物发育分子生物学; 通信作者:陈世华( csh-yantai
@ 163． com) ，博士，副教授;郭善利( gsl@ ytu． edu． cn) ，博士，教授．
中华补血草金属硫蛋白基因的克隆及
高盐处理下的表达模式分析
刘 瑜，陈世华，尹海波，李丽霞，赵吉强，张 莹，韩会玲，郭善利
( 烟台大学化学生物理工学院，山东 烟台 264005)
摘要: 以中华补血草叶片为材料，提取其总 RNA 并反转录 cDNA，并以 cDNA 为模板，克
隆得到包含该基因完整开放阅读框的 cDNA 序列，序列分析表明，该基因开放阅读框长
249 bp，编码 82 个氨基酸; 该蛋白含有 14 个半胱氨酸，主要分布在蛋白质的 N端和 C端，
呈 CC，CX，CXXC形式排列．预测该蛋白分子质量为 8 133． 1 D;等电点为 4． 72; 35 ～ 48 位
和 52 ～ 68 位氨基酸间有 2 个较强的疏水区．用 3% NaCl处理补血草植株 0、12、24、48、72
h，利用半定量 － PCR技术对该基因在盐胁迫下表达模式的分析表明，在 3% NaCl处理条
件下，随着盐处理处理时间的延长该基因的表达量逐渐升高，在盐处理 48 h 时表达量最
高，之后其表达量出现下降．
关键词: 中华补血草;金属硫蛋白;基因克隆; 表达模式;序列分析
中图分类号: Q945 文献标志码: A
金属硫蛋白 ( metallothioneins，MT) 是一类广
泛存在于生物界的小分子质量( 6 ～ 8 kD) 非酶蛋
白［1］．在动物中，该蛋白由 Margo shes 和 Vallee在
1957 年首次发现于蓄积镉 ( Cd) 的马肾中，植物
中的金属硫蛋白最早于 1977 年由 Casterline 和
Barnett在大豆根中发现．该蛋白富含 Cys，能结合
多种重金属离子降低或解除重金属毒害［2］; 并能
有效清除自由基［3 － 4］，调节生长作用，增强对外界
胁迫的适应性，参与微量元素储存、运输和代谢过
程．其研究和开发对农业、医药、保健、生物工程、
环境保护等多个领域具有重要意义［5］．
目前已经从 NCBI 数据库中搜索到车前、番
茄、花生、西瓜等多种植物的 MT 基因． 但在泌盐
盐生植物中的相关研究则相对较少，近年来，班巧
英等［6］进行的二色补血草金属硫蛋白基因
LbMT2 的研究，，获得二色补血草 LbMT2 基因全
长 cDNA序列，并分析了该基因分别在不同胁迫
下的表达情况，同时还研究了 LbMT2 基因在大肠
杆菌( Escherichia coli) BL21 中的表达．
中华补血草( Limonium sinense Kuntze ) 为白
花 丹 科 ( plumbagenaceae ) 补 血 草 属
( Limonium ) 多年生泌盐草本植物［7］． 该植物可
以使盐土脱盐，改善土壤结构，被誉为盐碱地改造
的先锋植物 ．本研究从中华补血草中克隆出了
金属硫蛋白基因，对该基因进行了序列分析和功
能预测，并分析了该基因在 3% NaCl 高盐胁迫下
的表达模式，为研究中华补血草 MT 参与的盐胁
迫相关生理过程及分子应答机制打下良好基础．
烟台大学学报( 自然科学与工程版) 第 24 卷
1 材料试剂和方法
1． 1 试剂
Trizol总 RNA提取试剂、逆转录合成试剂盒、
DNA片段回收试剂盒、TaqDNA 聚合酶、DL2000、
dNTP购自 TaKaRa( 大连) 公司; 其余常规药品均
为进口或国产分析纯级; 引物由上海生工生物技
术有限公司合成．
1． 2 材料
中华补血草种子在 MS 培养基上无菌培养 2
周至长出 2 片真叶，将幼苗转移到洗净的河沙中
在温室内培养至 6 ～ 7 片真叶期时，选取 15 盆长
势一致的幼苗用于实验，每个处理设置 3 盆重复，
用 3% NaCl浇灌处理，分别处理 72、48、24、12 h，
实验时保证在同一时间取材进行下一步的实验．
1． 3 基因克隆与序列分析方法
1． 3． 1 引物设计 利用 Primer premier 5． 0 设计
引物序列，引物序列如下．
特异引物 1 Specific -antisense primer 1: 5 ACG-
GAACTTCACGCACAAA 3
特异引物 2 Specific-sense primer 2: 5GGCTGCG-
GAGGATGCAAGATGTA 3
兼并引物 1 Sense primer 1: 5ATGTCTTGYTGYG-
GHGGWAASTGYGGHTGTGG 3
兼并引物 2 － 1 Sense primer 2 -1: 5 GGCTGYG-
GAGGRTGCAAGATGTA 3
兼并引物 2 －2 Anti-sense primer 2-2: 5GGGGTTG-
CAGBTGCAGYTRTCWCCRCAYTTGCABCC 3
1． 3． 2 中华补血草总 RNA的提取及目的基因的
克隆 取温室栽培的 6 ～ 7 片真叶的中华补血草
幼嫩叶片 100 mg 为实验材料，利用 Trizol 试剂提
取总 RNA，8 g /L 的琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA
的质量．用 1 μg的中华补血草总 RNA用于 cDNA
第一链的合成，作为 RT－PCR的模板．
利用兼并引物 2－1 和 2－2 进行 PCR 扩增金
属硫蛋白基因的中间保守片段． PCR 扩增条件:
95 ℃预变性，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35
个循环，最后 72 ℃ 10 min．
根据得到特异片段设计特异引物 2，利用该
引物和 Oligo－d( T) 进行 MT 基因的 3’扩增，PCR
扩增条件: 95 ℃预变性，94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72
℃ 30 s，35 个循环，最后 72 ℃ 10 min．
根据扩增得到 MT基因的 3’片段，设计特异
引物 1－1，利用特异引物 1－1 和兼并引物 1 扩增
金属硫蛋白完整读码框 ( ORF) ，PCR 扩增条件:
95 ℃预变性，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35
个循环，最后 72 ℃ 10 min．
PCR扩增得到的目的条带经切胶回收纯化
后，连接到 pMD18 －T 载体上，转化大肠埃氏菌
DH5α感受态细胞，37 ℃培养过夜，挑单菌落扩
增培养，提取质粒委托北京六合华大基因科技股
份有限公司进行测序．
1． 3． 3 基因的序列分析方法 用 NCBI 的 ORF
( http: / /www． ncbi． nlm． nih． gov /gorf /gorf． html) 软
件寻找这个金属硫蛋白基因的开放读码框．用 Pro-
tParam( http: / / au． expasy． org /cgi-bin /protparam) 计
算蛋白的分子质量及等电点． Pfam17． 0 ( http: / /
pfam． wust． ledu /hmmsearch． shtml) 程序对该基因进
行蛋白家族预测，确定该基因所属蛋白家族; 用
SignalP3． 0Server ( http: / /www． cbs． dtu． dk /serv-
ices /SignalP / ) 检测其有无信号肽序列;利用 BlastP
( http: / /www． ncb． inlm． nih． gov /BLAST / ) 进行同
源性搜索，选择了 5种与其相似性高的植物的金属
硫蛋白基因氨基酸序列，用 clusalX1． 83 程序进行
多序列比对; 应用 ProScale ( http: / /www． expasy．
org /cgi-bin /protscale． pl ) 以默认算法 ( Hphob． /
Kyte＆ Doolittle) 进行疏水性分析．
1． 4 3%NaCl处理不同时间条件下 MT基因表
达模式分析方法
用 3%NaCl浇灌全植株 0、12、24、48、72 h，分
别取材提取总 RNA，反转录后以中华补血草
18sRNA作为内标，对 MT基因的表达量进行半定
量 PCR分析．
2 结果分析
2． 1 MT基因 PCR扩增片段及测序结果
利用兼并引物 Sense 2－1 和 Anti-sense 2－2 进
行金属硫蛋白基因中间保守编码片段 PCR 扩增，
获得约 200 bp的 DNA 片段，Blast 分析表明该片
段为编码金属硫蛋白的核苷酸片段．
根据得到的特异片段设计特异引物 2，利用
该引物和 Oligo－d( T) 进行 MT基因的 3’扩增，得
到约 500 bp的 DNA 片段，Blast 分析表明该片段
为编码金属硫蛋白基因的 3’端核苷酸片段． 根
据扩增得到 MT 基因的 3’片段，利用特异引物 1
和兼并引物 1 扩增得近 500 bp 的 DNA 片段．
DNAman分析获得的MT基因的全长 cDNA序列，
221
第 2 期 刘 瑜，等: 中华补血草金属硫蛋白基因的克隆及高盐处理下的表达模式分析
cDNA全长分别为 608 bp． NCBI ORF founder分析
表明，中华补血草 MT基因 ORF区 249 bp，3非翻
译区为 359 bp，共编码 82 个氨基酸( 图 1) ．
图 1 中华补血草 MT基因序列及推导氨基酸序列
Fig． 1 The nucleotide acids sequence and induced amino acids sequence of MT from Limonium sinense Kuntze
2． 2 MT基因的蛋白质家族预测及同源性分析
用 Pfam程序对克隆的 MT 基因进行蛋白质
家族预测，N末端结构域 Cys 残基有 3 种形式为
CC、CXC和 CXXC［16］，证明实验获得的 MT 蛋白
属于 MTⅡ蛋白家族． 用多序列比对程序 ( clu-
salX1． 83) 将获得的 MT 蛋白与其他 5 种植物的
MT蛋白氨基酸序列进行比对分析． 结果显示，各
植物的 MT基因在氨基酸数目上保守性差，仅有
37%的氨基酸( 30 个) 在位置上保守，且中部序列
保守性更低．但 Cys 残基位置和数目都具有很高
的保守性，并且都集中于蛋白质的 N 端和 C 端，
其排列方式为典型的 CC、CXC 和 CXXC 排列方
式，表明 Cys残基的数量对 MT 蛋白的功能非常
重要( 图 2 ) ． 其中中华补血草的 MT 蛋白氨基酸
序列与 LbMT2( EU039828) 蛋白氨基酸序列一致，
说明该蛋白在补血草属的同源性很高．
番茄( Solanum) ACF10396． 1;花生( TSA) AAZ20290． 1;车前( Plantago) CAH59436． 1;二色补血草( Limonium ) ABL10085． 1b;
二色补血草( LbMT2) ; EU039828 中华补血草( bxc) ;灰色背景代表氨基酸序列保守区．
图 2 5 种植物的MT蛋白多序列比对
Fig． 2 Alignment of MT gene amino acids sequence from five plants
321
烟台大学学报( 自然科学与工程版) 第 24 卷
2． 3 MT蛋白疏水性预测
ProScale程序对金属硫蛋白疏水性预测结果
( 图 3) ．从疏水区预测结果可以看出，金属硫蛋白
的 35 ～ 48 位点和 52 ～ 68 位点有 2 个较强疏水
区，而疏水区的两侧为明显亲水区．
图 3 中华补血草MT蛋白疏水性分析
Fig． 3 Hydrophobicity profile of MT from Limonium sinense
Kuntze
2． 4 MT蛋白的等电点和分子质量预测
以 SignalP 3． 0Server软件检测发现该序列中
没有信号肽序列，而信息肽是引导前体蛋白通过
细胞膜分泌到胞外的一段序列，这说明该金属硫
蛋白为非分泌性蛋白( Non－secretory protein) ，Pro-
tParam预测中华补血草 MT 蛋白的分子式为 C317
H512N96O120S17，分子质量为 8 133． 1 D，理论等电
点为 4． 72，不稳定系数为 48． 88%，属于不稳定的
酸性蛋白．
2． 5 3%NaCl处理对植株生长状态的影响
用 3% NaCl 处理中华补血草 12、24、48、72
h，与对照组相比，随着处理时间的增加，补血草叶
片出现失水萎蔫卷曲、叶绿素含量降低叶片变黄
的现象也随之加重．
2． 6 3%NaCl处理不同时间条件下 MT基因表
达模式分析
半定量 PCR 分析表明: MT 基因表达量随处
理时间的延长而增加，高盐处理早期及 48 h 该基
因表达量显著上调，72 h呈现下降趋势( 图 4) ．
M1 ～ 5 为内标( 18S) RNA; M1．对照; M2．盐处理 12 h; M3．盐处理
24 h; M4．盐处理 48 h; M5．盐处理 72 h; M6． DL2000 分子质量标
记; M7 ～11 为 MT基因表达量，顺序同内标 RNA．
图 4 半定量 PCR分析MT表达情况
Fig．4 Analysis expression of MT by Semi-quantitative RT-PCR
3 讨 论
中华补血草是能在高盐环境正常生长的泌盐
盐生植物，在该植物中，MT 基因的结构组成特
点、该基因在中华补血草应答高盐及耐受重金属
胁迫过程中的作用及分子应答机制等相关研究未
见报道．
本实验克隆获得了中华补血草的 MT 基因，
对其 cDNA 序列及推导出的氨基酸序列分析表
明，该基因编码的蛋白质含有 14 个 Cys 残基，占
该蛋白总氨基酸数的 17． 1% ． 多序列比对结果
( 图 2) 表明，来自不同植物的 MT 蛋白序列两端
保守性高，中部保守性低，而且半胱氨酸残基都集
中于蛋白质的 N端和 C端，这说明 N端和 C端序
列对 MT 蛋白的结构和功能具有重要作用． 已有
研究表明，高半胱氨酸残基含量是 MT 基因的典
型特征，该结构是金属硫蛋白应答重金属胁迫的
结构基础，同时该结构也是许多参与抗氧化胁迫
应答蛋白因子的结构特征． 本实验中克隆得到的
中华补血草 MT基因其 N 端具有 C－C－x( 3)－C－x
－C－x( 3)－C－x－C－x( 3)－C－x( 2)－C，C 端为 C－x－C－x
( 3)－C－x－C－x( 2)－C－x－C结构( x 为除半胱氨酸外
的其他氨基酸) ，符合典型的 MT2 蛋白特征［8］，说
明本实验中克隆获得 MT 基因属于编码 MTⅡ的
基因．
盐处理是研究植物耐盐机理的基本方法，自
然环境中，一般盐土含盐量在 30 ～ 80 mmol /L
NaCl 时就已对植物生长不利，当土壤表层 NaCl
含量超过 100 mmol /L 时，大多数植物已不能生
长．本实验用 3% ( 约 500 mmol /L) NaCl处理中华
补血草，对 MT2 基因在高盐应答中的表达模式进
行了初步研究，研究表明，高盐处理的中华补血草
幼苗，金属硫蛋白基因的表达随高盐处理、及处理
时间的延长表现出明显的变化，说明该基因参与
了中华补血草盐胁迫应答，并且该基因的表达受
盐胁迫诱导．该基因参与中华补血草高盐应答的
分子机理则有待深入研究．
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Cloning and Analysis of Metallothionein Gene from Limonium sinense Kuntze
LIU Yu，CHEN Shi-hua，YIN Hai-bo，LI Li-xia，ZHAO Ji-qiang，ZHANG Ying，
HAN Hui-ling，GUO Shan-li
( School of Chemical and Biological Science and Engineering，Yantai University，Yantai 264005，China)
Abstract: The metallothionein gene，with an open reading frame of 249bp and encodes a protein of 82 amino
acid residues，is cloned from Limonium sinense Kuntze． This protein has 14 Cys residues ( Cys) and a con-
served sequence of C-C，C-X-C，C-X-X-C at the end of both C-and N-terminal． There are two strong hydropho-
bic areas at 35 － 48 and 52 － 68 amino acid residues． Expression analysis of MT by semi-quantitative-PCR
technology showes the expression level is increasing gradually when Limonium sinense Kuntze is treated with
3% NaCl for 0，12，24，48，72 h． It reaches the highest levels at 48 h，then decreases． This study lays a foun-
dation for the deep research of MT from Limonium sinense Kuntze in response to salt stress．
Key words: Limonium sinense Kuntze; metallothioneins; gene colne; sequence analysis; expression analysis
( 责任编辑 周雪莹)
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