全 文 ：农业生物技术科学
Chinese Agricultural Science Bulletin Vol.24 No. 12 2008 December
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大花蕙兰植株强健，花大花多，花色艳丽，花期又
长，是观赏价值极高的花卉植物之一，享有“兰花皇后”
的美誉[1]。但是随着大花蕙兰作为商品的全球流通，大花
蕙兰的经销商和消费者无不希望传统的兰花品种能增
加更为实用的商业性状。比如说，若能增加其抗寒性，大
花蕙兰在亚热带地区的生产成本就可降低 50%左右，
而消费者的接受度和消费欲望指数则可能提高 2~3
倍。但常规育种有一定的局限性，育种周期漫长，性状选
育程序复杂，特别是栽培者和经营者希望得到的目的性
状选择育种，可以说是收效甚微，甚至无能为力。基因工
程技术的发展，为解决和实现大花蕙兰商业性状改良提
供了可能。近年来，大花蕙兰转基因方面的研究有较大
的进展，但是利用农杆菌介导的方法将外源基因导入大
花蕙兰花并成功获得基因工程植株的研究未见公开报
道。该研究的目的就是针对黑龙江省冬季异常寒冷的气
候条件建立一个大花蕙兰耐寒基因 ICE1受体转化系
统，用这一方法来培育耐寒的大花蕙兰新品种，减少温
室取暖成本，以满足北方的市场需求，所以该研究具有
基金项目：黑龙江省大庆市资助项目：“名贵花卉快速繁殖与万寿菊高产栽培体系的研究”（SGG04-064）。
第一作者简介：张瑜，女，1981年出生，黑龙江人，硕士，研究方向：遗传育种，通信地址：154007 黑龙江省佳木斯市黑龙江农业职业技术学院，Tel：
0454-6881186，E-mail：zhangyu7992@163.com。
通讯作者：殷奎德，1964年出生，男，教授，黑龙江人，硕士生导师，研究方向：生物化学及分子生物学，通信地址：163319黑龙江省大庆市黑龙江八一农
垦大学生命学院，Tel：0459-6819291，E-mail：yinkuide@sohu.com。
收稿日期：2008-07-04，修回日期：2008-07-30。
农杆菌介导的大花蕙兰转 ICE1基因
张 瑜 1，向殿军 2，殷奎德 3
(1黑龙江农业职业技术学院，佳木斯 154007；2黑龙江农业经济职业学院，牡丹江 157032;
3黑龙江八一农垦大学生命科学学院，大庆 163319；)
摘 要：大花蕙兰属热带植物，在北方组培成本很高，从拟南芥的 RNA中克隆到耐寒基因（COR）的转录
激活因子 ICE1，连上 CaMV35S 启动子构建成植物表达载体 pCAM BIA1300-35S-ICE1-poly，通过农杆
菌介导的方法转化大花蕙兰。经过抗性筛选、诱导生芽、诱导生苗、诱导生根等过程，获得了 70多棵潮霉
素抗性植株，PCR鉴定 12.9%为阳性，且部分 PCR阳性植株通过了 Southern检测，确定为转基因植株。
关键词：大花蕙兰；ICE1基因；农杆菌介导
中图分类号：S332.5 文献标识码：A
Transformation of ICE1 Gene into Cymbidium grandiftorium Mediated by Agrobacterium
Zhang Yu1, Xiang DianJun2, Yin Kuide3
(1Heilongjiang Agricultural College of Vocational Technology, Jiamusi 154007;
2Heilongjiang Agricultural Economy Professional College, Mudanjiang 157032;
3School of Life Science and Biotechnology, Heilongjiang August First Land Reclamation University, Daqing 163319)
Abstract: Cymbidium grandiftorium is tropical plant, the price of plant tissue culture is high in the
northeast. This research cloned cold tolerance gene ICE1 which is a transcriptional active factor of cold
tolerance gene (COR) from Arabidopsis’s RNA, connected to CaMV35S and constructed into the plant
expressing vector pCAMBIA1300 -35S -ICE1 -poly. Cymbidium grandiftorium was transformed by
Agrobacterium Tumefaciens. This research got over 70 hygromycin resistant plants by resistance choice, inducing
bud, inducing plant and inducing root. PCR identification showed that about 12.9% were positive and a part
of PCR positive plants were positive by Southern analysis, finally these plants was determined for transgenic
plants.
Key words: Cymbidium grandiftorium, ICE1gene, Agrobacterium Tumefaciens transforming
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中国农学通报 第 24卷 第 12期 2008年 12月
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较好的研究基础和广泛的应用前景，同时也为通过基因
工程手段改良大花蕙兰建立一个技术平台。
1 材料与方法
1.1 试验时间与地点
试验于 2006年在黑龙江八一农垦大学生物技术
实验室进行。
1.2 试验材料和方法
1.2.1 供 试 材 料 拟南芥 (Arabidopsis thaliana L.,
Columbia ecotype)。受体为大花蕙兰（Annabelle）原球
茎，由黑龙江八一农垦大学生物化学与分子生物学实
验室提供。
1.2.2 农杆菌菌株和质粒 农杆菌菌株为 LBA4404，大
肠杆菌菌株为 DH5α。中间载体为 pRT104、pBlue-
script、pCAMBIA1300。试验所构建成的植物表达载体
命名为 pCAMBIA1300-35S-ICE1-polyA（图 1），ICE1
cDNA片段和 HPT基因分别插入到 CaMV35S启动子
的下游，利用 BamHⅠ和 SalⅠ可切下 2200 bp的片段，
利用 EcoRⅠ则可切下 1800 bp的片段。
图 1 植物表达载体 pCAMBIA1300-35S-ICE1-polyA
注：ICE1基因；35S-启动子；HPT-潮霉素磷酸转移酶基因；LB-左臂；RB-右臂。
polyA HPT 35S 35S ICE1 polyA
BamHⅠ EcoRⅠ XbaⅠ EcoRⅠ SalⅠ
LB RB
1.2.3 培养基和培养条件
（1）原球茎继代培养基为：MS+6-BA1.0 mg/L+
NAA0.5 mg/L+蔗糖 30 g/L+琼脂 8 g/L，pH5.7。
（2）原球茎分化培养基为：MS+6-BA2.0 mg/L+
NAA0.5 mg/L+蔗糖 30 g/L+琼脂 8 g/L，pH5.7。
（3） 生根培养基为：MS+NAA0.2 mg/L+ 蔗糖
30 g/L+琼脂 8g/L，pH5.7。
培养温度 25~28℃，光照强度 1500~2000 lx，每天
光照 12~14 h。
1.2.4 基因克隆与植物表达载体的构建 将苗期 10 d
的拟南芥幼苗 0 ℃处理 12 h，按试剂盒说明提取总
RNA，以 Olig(dT)18 为引物、用 Reverse Transcriptase
(M-MLV)进行反转录，再以反转录的 cDNA为模板、
以 ICE1f& ICE1r 为引物、用 Taq DNA 聚合酶进行
PCR操作，程序为：94℃下预变性 3 min，94℃下变性
30 s，56℃下退火 45 s，72℃下延伸 90 s，共 35个循
环，72℃下再延伸 10 min。PCR产物经酶切和测序验
证正确后，用 EcoRI & XbaI酶切 ICE1 的 PCR 产物
后，连接到 pRT104质粒的 CaMV35S启动子和 polyA
中间，并保证 ICE基因的正确读码框。用 PstI酶切将
CaMV35S-ICE1-polyA片段转入 pBluscript载体中，再
用 BamHⅠ&SalⅠ酶切将 CaMV35S-ICE1-polyA片段
转入 pCAMBIA1300载体中，每次的连接产物要导入
DH5α感受态中[2]，筛选阳性克隆，最后的连接产物导
入 LBA4404感受态中，验证正确后，用于转化大花蕙
兰原球茎。
1.2.5 大花蕙兰遗传转化方法 选生长旺盛、大小均匀
一致的原球茎，用解剖刀的刀尖在每个原球茎上刺数
下，置于 OD600为 0.5~0.8 的菌液中浸泡 30 min，将其
转到含 500 μM乙酰丁香酮的继代培养基中，25℃暗周
期共培养 3天，共培养之后的原球茎转接到含 500 μM
的乙酰丁香酮和 200 μM头孢霉素的继代培养基中进
行二次共培养，30天后将原球茎接种到含 15 mg/L潮
霉素的继代培养基上进行筛选试验。考虑大花蕙兰对
抗生素具有天然的抗性，所以将筛选的时间延长为
100~150天，此间每 20天换一次培养基。最后将新生
的原球茎接种到分化培养基上，待其长出 3~5个叶片
时，再将其转接到生根培养基中生根出苗。
1.2.6 转基因植株的检测
（1）转基因植株的 PCR检测 取大花蕙兰植株叶
片 0.2 g左右，提取基因组 DNA[3]，同时以未转基因大
花蕙兰 DNA作为阴性对照，表达载体质粒为阳性对
照，对所获得的 70株转基因植株进行 PCR检测。
（2）转基因植株的 Southern检测 提取 PCR检测
阳性的大花蕙兰植株 DNA，进行酶切、电泳、转膜、固
定。同时以未转基因大花蕙兰 DNA为阴性对照，以植
物表达载体（EcoRⅠ能切下 ICE1-polyA 1800 bp）为阳
性对照。以目的基因 ICE1为摸板，按照 DIGDNALa-
beling and Detection Kit说明进行探针合成和检测。将固
定的膜用杂交液预杂交后，加入合成的探针进行杂交。
2 结果与分析
2.1 RT-PCR扩增目的基因 ICE1
利用 Trizol 试剂盒提取拟南芥总 RNA，用于
RT-PCR的模板，用 ICE1的上下游引物进行 RT-PCR扩
增，扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳与标准分子量比较，其
大小约为 1500bp，电泳结果如图 2，扩增产物与GenBank
中 ICE1（1485bp）的序列大小相一致，并且 PCR产物经酶
切和测序验证无误，证明已经克隆到了 ICE1基因。
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2.2 植物表达载体 pCMBIA1300-35S-ICE1-polyA 的
鉴定
将所克隆到的 ICE1基因按图 1.5中叙述的方法
构建载体，最后将片段 35S-ICE1-polyA（约 2200bp）与
质粒 pCMBIA1300的连接产物导入 DH5α，菌落 PCR
筛选出阳性重组质粒（用单菌落做为模板、ICE1的上
下游引物，PCR反应可扩增出 1500 bp左右的片段，图
3）命名为 pCMBIA1300-35S-ICE1-polyA，进一步用
BamHⅠ、SalI双酶切，酶切产物经 1%琼脂糖凝胶电泳
与标准分子量 1kb ladder比较，可切下约 2200 bp片段
（图 3），与预期效果一致，说明 ICE1基因已经被成功
地构建到植物表达载体 pCMBIA1300上。
2.3 大花蕙兰转化植株的 PCR检测
PCR结果表明，7株转基因植株有 6株能扩增到
1500 bp左右的片段（图 4），与目的基因 ICE1大小相
一致，呈阳性反应，而阴性对照却没有扩增到目的条
带，从而说明目的基因 ICE1已经整合到部分大花蕙兰
基因组中，转化率为 12.9%。
ICE1 1kb ladder
1500bp
ICE1 1kb ladder
0bp
图 2 RT-PCR 扩增目的基因 ICE1
图 3 植物表达载体 pCAMBIA1300-35S-ICE1-polyA 的菌落 PCR 和双酶切鉴定
图 4 部分转基因植株的 PCR 检测结果
注：M:D2000 Marker；+:质粒阳性对照；-:负对照(未转基因大花蕙兰植株)；1~7:转基因植株。
2.4 大花蕙兰转化植株的 Southern检测
杂交结果见图 5，部分 PCR检测阳性的大花蕙兰
植株和阳性对照均能杂出 1800 bp大小的条带，呈阳
性反应，而阴性对照却没有杂出目的条带，从而在
PCR基础上进一步说明目的基因 ICE1已经整合到大
花蕙兰基因组中，同时也发现 PCR检测出现了假阳
性。
3 讨论
3.1 共培养方式对原球茎转化的影响
原球茎在农杆菌菌液中的侵染只是将农杆菌附着
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到细胞壁和细胞膜等细胞的表面结构，而真正实现
T-DNA整合到受体细胞基因组则主要是在侵染后的
共培养过程中。笔者发现在进行第一次共培养时，原球
茎表面和培养基上只有少量的农杆菌菌落出现，所以
笔者采用了二次共培养的方式来增加农杆菌侵入的几
率，研究证明侵染后的原球茎在进行二次共培养后，转
化率具有明显的提高。
3.2 筛选标记基因对转化率的影响
基因的表达可使其携带者对特定的抗生素产生抗
性，可以作为转化受体的筛选剂。如何选择适当的筛选
标记基因是转化的关键一步。筛选剂筛选浓度过高容
易使本来可能成功转化的细胞迅速死亡，而且死亡细
胞也会分泌大量的有毒物质，影响转化细胞的生长，降
低转化效率；而过低的筛选浓度又不能有效地筛选掉
大量的非转化细胞，假阳性率高，后期检测工作量太
大。一般认为能在附加一定种类、一定浓度的抗生素的
选择培养基中存活下来的细胞可初步断定为转化细
胞，而不能存活生长的则为非转化细胞。这里对抗生素
浓度的要求是：既能有效地抑制非转化细胞的生长，使
之缓慢地死亡，又不影响转化细胞的正常生长。该研究
所使用的质粒有两种标记基因 NPT-II和 HPT，因此可
以用卡那霉素或潮霉素作为筛选剂。Yang[4]报道兰花
对普遍使用的一些抗生素如卡那霉素存在天然抗性，
因此常需要高于 500 mg/L的 Kana来筛选转化细胞。
因此在该试验中笔者使用潮霉素作为筛选剂。根据大
花蕙兰对潮霉素的敏感性试验结果，选 15 mg/L为筛
选浓度。又因为长时间高浓度的潮霉素筛选对细胞生
长造成抑制，出现了细胞几乎停滞生长的现象，所以为
利于细胞分化，在分化刚开始时采用了先撤掉潮霉素
筛选压力，待有绿点出现至形成圆球茎后再用低浓度
潮霉素筛选的策略，达到了较好的筛选效果。
参考文献
[1] 松华.大花蕙兰史略.花卉,1995,53(1):14.
[2] Sambrook J, Russell D W.Molecular Cloning: A laboratory Manual.
3nd.New York: Cold Spring Harbor laboratory, 2001.
[3] 王关林,方宏筠.植物基因工程原理与技术.北京科学出版社,1998:
598-599.
[4] Yang J, Lee H J, Shin D H, et al.Genetic transformation of Cymbidi-
um orchid by particle bombardment[J]. Plant Cell Reports, 1999, 18:
978-984.
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