全 文 ：0 引言
大花蕙兰(Cymbidium hybridum)为兰科兰属多年
生草本植物，是兰属中一部分大花型附生性种类的杂
交种，花序较大，花葶长，小花数多，花色丰富，具有明显
的杂种优势。组织培养是目前大花蕙兰工厂化生产的
主要繁殖方式，现在已有原球茎与丛生芽两种繁殖途
径[1]。大花蕙兰组织培养的褐化现象一般出现在外植
体诱导[2-3]、原球茎增殖[4]与试管苗增殖[1]阶段，已有学者
对外植体的褐化现象进行了研究[2-3]。但对大花蕙兰试
管苗增殖过程中的褐化未进行系统的研究。笔者在试
验过程中发现，大花蕙兰试管苗增殖过程中褐化现象
严重，降低了试管苗的质量，甚至导致试管苗死亡。
此文在前人研究工作的基础上，就大花蕙兰试管
苗增殖过程中影响褐化的因素及褐化的克服进行研
究，旨在寻找有效克服大花蕙兰试管苗增殖过程中褐
化的措施。
1 材料与方法
1.1 试验材料
以大花蕙兰‘红霞’、‘修女’、‘翠玉’三个品种的试
管苗为试验材料。
基金项目：十一五国家科技支撑计划项目“优质、高效、低能耗设施花卉品种筛选与配套生产技术研究”（2006BD07B01）。
第一作者简介：马文卿，女，1985年出生，山东临沂人，硕士，主要研究方向：大花蕙兰的组织培养。通信地址：100083北京市海淀区清华东路35号北
京林业大学612信箱，Tel：010-62348745，E-mail：zhiziqing@163.com。
通讯作者：李青，女，1958年出生，副教授，主要从事园林植物组织培养研究工作。E-mail：wliqing06@sina.com。
收稿日期：2009-12-10，修回日期：2009-12-25。
大花蕙兰试管苗增殖过程中的褐化研究
马文卿，李 青，刘 燕
（北京林业大学园林学院，国家花卉工程技术研究中心，北京 100083）
摘 要：对大花蕙兰试管苗增殖过程中褐化的影响因素及褐化现象的克服进行研究。研究了不同基本培
养基、糖浓度、琼脂浓度、试管苗大小及花色等因素对褐化的影响，不同抗氧化剂与吸附剂对褐化现象的
克服及对试管苗增殖的影响。结果表明：不同基本培养基、糖浓度、琼脂浓度及试管苗大小对褐化有影
响，但影响不显著；花色对褐化的影响显著；添加1500mg/L活性炭，既可解决褐化现象，又能保证试管苗
生长旺盛，保持较高的增殖系数。
关键词：大花蕙兰；试管苗增殖；褐化；褐化克服
中图分类号：S682.31 文献标志码：A 论文编号：2009-2604
Studies on Browning during the Test-tube Proliferation of Cymbidium Hybridum
Ma Wenqing, Li Qing, Liu Yan
（College of Landscape Architecture, Beijing Forestry University,
National Engineering Research Center for Floriculture, Beijing 100083）
Abstract: This paper studied on the facts of browning and anti-browning during the test-tube proliferation of
Cymbidium Hybridum. Studied the effects of different basic mediums, sugar concentrations, agar
concentrations, the sizes of test-tube plantlet and color on browning; the effects of different anti-oxidants and
adsorbents on browning. The results showed that: the effects of different basic mediums, sugar concentrations,
agar concentrations and the sizes of test-tube plantlet on browning were influential, but the effects were not
significant; the effect of color on browning was significant; when added 1500mg/L activated carbon, browning
could be under control, and also ensured the growth of test-tube plantlet to maintain a higher proliferation
coefficient.
Key words: Cymbidium hybridum; test-tube plantlet proliferation; browning; anti-browning
中国农学通报 2010,26(7):186-190
Chinese Agricultural Science Bulletin
1.2 试验方法
1.2.1 不同基本培养基、糖浓度、琼脂浓度及试管苗大
小对褐化的影响 采用四因素三水平正交试验设计L9
(34)，基本培养基分别为MS、1/2MS、1/4MS，糖浓度分
别为 1%、2%、3%，琼脂浓度分别为 0.2%、0.4%、0.6%，
添加6-BA3.0mg/L，2,4-D1.0mg/L，pH5.4~5.8。将试管
苗大小划分为3等级：
具2~3片叶，株高为3~4cm的试管苗为Ⅰ级；
具3~4片叶，株高为5~6cm的试管苗为Ⅱ级；
具4~5片叶，株高为7~8cm的试管苗为Ⅲ级。
每瓶接入3株，每处理30瓶，每隔5天进行观察培
养基的褐化情况，并于45天后进行数据统计。
1.2.2 不同花色与大花蕙兰试管苗增殖过程中褐化问
题的相关性 以MS为基本培养基，添加6-BA3.0mg/L，
2,4-D1.0mg/L，白砂糖 3%，琼脂 0.5%，pH为 5.4~5.8。
将大小较一致的大花蕙兰三个不同花色的试管苗接入
培养基中进行增殖培养，每瓶接入3株，每处理30瓶，
每隔5天进行观察培养基的褐化情况，并于45天后进
行数据统计。
1.2.3 褐化现象的克服 以MS为基本培养基，添加
6-BA3.0mg/L，2,4-D1.0mg/L，白砂糖 3%，琼脂 0.5%，
pH 5.4~5.8。分别添加不同种类和浓度的吸附剂：活
性炭 (500、1000、1500mg/L)、聚乙烯吡咯烷酮 (500、
1000、1500mg/L)，不同种类和浓度的抗氧化剂：维生素
C(100、200、300mg/L)、硫代硫酸钠 (100、200、300mg/
L)。以不添加任何吸附剂与抗氧化剂的培养基为对
照，将大小较一致的试管苗接入培养基中进行增殖培
养，每瓶接入 3株，每处理 30瓶，每隔 5天进行观察培
养基的褐化及试管苗的增殖情况，并于45天后进行数
据统计。
1.2.4 培养条件 培养温度(25±3)℃，光照强度 2000~
3000lx，光照时间12h/天。
1.2.5 数据统计分析
褐化率=（褐化瓶数/接种瓶数）×100%
增殖系数=新增苗数/原接入苗数
数据分析采用SPSS16.0数据分析软件。
2 结果与分析
2.1 大花蕙兰试管苗增殖过程中褐化影响因素的研究
2.1.1 不同基本培养基、糖浓度、琼脂浓度、试管苗大小
对褐化的影响 接种5天后有轻微褐化现象出现，随着
时间的推移，褐化率增加，褐化程度增强，褐化物质扩
散至整个培养基，培养基呈现出不同程度的红棕色。
对试验结果进行极差分析，如表 1所示。结果表明：4
个因素中，对褐化的影响次序由大到小依次为糖浓度
>基本培养基>试管苗大小>琼脂浓度。基本培养基
中，无机盐含量的变化与褐化率未呈现比例关系，基本
培养基为MS时褐化率最低，其次为 1/4MS，1/2MS时
褐化率达到最高，因此基本培养基以MS为宜；糖浓度
与褐化率之间呈现正比关系，随糖浓度的升高，褐化率
升高，但为保证培养基能够提供足够的碳源，选择适宜
的糖浓度为20mg/L；琼脂浓度与褐化率之间也未呈现
比例关系，当琼脂浓度为 0.2%时褐化率最低，但培养
基状态为半固体状态，不利于大花蕙兰试管苗的固定，
当琼脂浓度为0.4%时褐化率最高，因此适宜的琼脂浓
度为 0.6%；试管苗大小与褐化率之间呈现正比关系，
随试管苗增大，褐化率升高，Ⅲ级试管苗增殖时的褐化
率最高，褐化程度最严重，Ⅰ级试管苗增殖时的褐化率
最低，褐化程度最轻，但试验中发现Ⅰ级试管苗增殖出
的颗粒状丛生芽较小，长成试管苗后较细弱，因此具
3~4片叶，高为5~6cm的Ⅱ级试管苗最适合继代增殖。
将对褐化影响最小的因素琼脂浓度的离差平方和
设置为误差项 [5]，进行方差分析如表 2所示。结果表
编号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
K1
K2
基本培养基
1（MS）
1
1
2（1/2 MS）
2
2
3（1/4 MS）
3
3
283.4
300
糖浓度/%
1(1.0)
2(2.0)
3(3.0)
1
2
3
1
2
3
280
296.7
琼脂浓度/%
1(0.2)
2(0.4)
3(0.6)
2
3
1
3
1
2
286.7
296.7
试管苗大小
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅲ
Ⅰ
Ⅱ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅰ
286.7
290
接种数/瓶
30
30
30
30
30
30
30
30
30
褐化数/瓶
26
29
30
30
30
30
28
30
30
褐化率/%
86.7
96.7
100
100
100
100
93.3
100
100
褐化程度
++
+++/++
+++
++
++
+++
++
+++
+++/++
表1 4种因素对褐化的影响及极差分析表
马文卿等：大花蕙兰试管苗增殖过程中的褐化研究 ·· 187
中国农学通报 http://www.casb.org.cn
明：基本培养基、糖浓度、试管苗大小等 3因素对实验
结果均有统计学意义，但 3个因素对褐化均无显著性
影响（P>0.05）。因此，大花蕙兰试管苗增殖过程中对
褐化影响的主导因素还有待于进一步研究。
2.1.2 不同花色对褐化的影响 以‘红霞’（R）、‘修女’
（P）、‘翠玉’（G）三个品种为材料，其中‘红霞’的花色
为深红色，‘修女’的花色为粉红色，‘翠玉’的花色为绿
色，观察不同花色（红R、粉P、绿G）对褐化的影响。如
表 3所示，褐化率最高的为‘红霞’（R），褐化率达到
100%，褐化程度严重，表现为+++；其次为‘翠玉’（G），
褐化率为95.7%，但褐化程度较轻，表现为++；虽然‘修
女’的褐化率最低，为 94.5%，但其褐化程度较‘翠玉’
严重，表现为+++。结果表明：不同花色之间的褐化率
及褐化程度差异显著，且同一色系不同品种随颜色的
加深，褐化率升高；不同色系之间，褐化率与褐化程度
差异均显著。因此花色对褐化的影响显著，这可能是
因为花色差异与多酚氧化酶（PPO）的活性有关。与前
人在芍药组培中对褐化的研究结果一致[6]。
K3
X1
X2
X3
R
293.3
94.5
100
97.8
5.5
300
93.3
98.9
100
6.7
293.3
95.6
98.9
97.8
3.3
300
95.6
96.7
100
4.4
表2 方差分析表
Source
Corrected Model
Intercept
基本培养基
糖浓度
试管苗大小
Error
Total
Correct Total
TypeⅢ Sum of Squares
155.113
85400.321
46.496
76.642
31.976
17.236
85572.670
172.349
df
6
1
2
2
2
2
9
8
MS
25.852
85400.321
23.248
38.321
15.988
8.618
F
3.000
9.910E3
2.698
4.447
1.855
Sig.
0.271
0.000
0.270
0.184
0.350
Fa
F0.05=19.00
F0.01=99.01
编号
1
2
3
花色
R
P
G
接种数/瓶
43
55
47
褐化数/瓶
43
52
45
褐化率/%
100.0Aa
94.5Bb
95.7Cc
褐化程度
+++
+++
++
表3 不同花色对褐化的影响
2.2 褐化现象的克服
2.2.1 不同种类和浓度的抗氧化剂与吸附剂对褐化的
影响 与对照相比，添加吸附剂活性炭的三个处理从接
种到培养第45天均未出现褐化，在此试验中的对褐化
的控制效果最明显。这与前人研究蝴蝶兰试管苗增殖
过程中对褐化的控制结果一致[7]。如表4所示，其余三
种处理均出现褐化现象，但褐化率和褐化程度有所不
同。添加硫代硫酸钠的处理，随添加浓度的升高，褐化
率降低，当浓度为 300mg/L时，褐化率降低至 83.3%，
且褐化程度减轻；添加聚乙烯吡咯烷酮的处理，褐化率
与对照无异，但褐化程度明显减轻，培养基只轻微变
褐，颜色为浅红棕色，褐化程度为+；添加维生素C的处
理，在培养前期褐化现象得到控制，但随着时间的推
移，褐化率升高至100%，褐化程度为+++。
2.2.2 不同种类与浓度的抗氧化剂与吸附剂对试管苗
增殖的影响 如表 5所示，与对照相比，在大花蕙兰试
管苗增殖过程中，添加不同种类及浓度的抗氧化剂与
吸附剂后对试管苗的增殖均有抑制作用，使试管苗的
注：不同大、小写字母分别表示P=0.01和P=0.05差异显著水平。下同。
注：R Squared=0.900（Adjusted R Squared=0.600）。
编号 基本培养基 糖浓度/% 琼脂浓度/% 试管苗大小 接种数/瓶 褐化数/瓶 褐化率/% 褐化程度
续表1
注：褐化程度：+为轻度，培养基颜色浅红棕色；++为中度，培养基颜色红棕色；+++为重度，培养基颜色为深红棕色，下同。
·· 188
增殖系数下降，且差异均显著。4种处理中，添加维生
素C与聚乙烯吡咯烷酮的处理，随浓度的增加，抑制作
用越明显，当聚乙烯吡咯烷酮浓度为500mg/L时，增殖
系数为 0.7；添加活性炭与硫代硫酸钠的处理，虽有抑
制作用，但添加浓度与增殖系数之间不呈现正比关系，
当活性炭浓度为1500mg/L时，增殖系数最高，为0.84。
不同种类的抗氧剂与吸附剂对试管苗的生长情况
亦有影响，添加维生素C的处理，试管苗长势较弱；添
加硫代硫酸钠的处理，部分试管苗出现枯叶现象；添加
活性炭的处理，试管苗生长良好，叶色浓绿有光泽，但
部分试管苗生长出根；添加聚乙烯吡咯烷酮的处理，试
管苗生长良好，叶色浓绿。
表4 不同抗氧化剂与吸附剂对褐化的影响
编号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
处理/（mg/L）
0(CK)
维生素C100
维生素C 200
维生素C 300
硫代硫酸钠100
硫代硫酸钠200
硫代硫酸钠300
活性炭500
活性炭1000
活性炭1500
聚乙烯吡咯烷酮500
聚乙烯吡咯烷酮1000
聚乙烯吡咯烷酮1500
接种数/瓶
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
褐化数/瓶
30
30
30
30
30
27
25
0
0
0
30
30
30
褐化率/%
100Aa
100Aa
100Aa
100Aa
100Aa
90Bb
83.3Cc
0Dd
0Dd
0Dd
100Aa
100Aa
100Aa
褐化程度
+++
+++
+++/++
--
+
表5 不同抗氧化剂与吸附剂对试管苗增殖的影响
编号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
处理/（mg/L）
0(CK)
维生素C100
维生素C 200
维生素C 300
硫代硫酸钠100
硫代硫酸钠200
硫代硫酸钠300
活性炭500
活性炭1000
活性炭1500
聚乙烯吡咯烷酮500
聚乙烯吡咯烷酮1000
聚乙烯吡咯烷酮1500
接入苗数/株
90
90
90
90
90
90
90
90
90
90
90
90
90
新增苗数/株
117
34
33
23
16
38
22
32
25
76
63
27
26
增殖系数
1.30Aa
0.38Dde
0.37Dde
0.26Ffg
0.18Gh
0.42Dd
0.24FGg
0.36DEe
0.28Ffg
0.84Bb
0.70Cc
0. 30EFf
0. 29Ffg
生长情况
有些试管苗下部发黑，腐烂
长势较弱
一般，部分试管苗出现枯叶现象
生长良好，叶色浓绿有光泽
生长良好，叶色浓绿，有光泽
3 讨论
植物组织培养过程中的褐化是由于植物细胞中的
酚类物质被氧化成醌，而变成棕褐色或暗褐色，这些褐
色物质会扩散至培养基中，进而抑制其他酶的活性，毒
害整个植物组织。经前人的研究，影响褐化的因素有
很多，包括基因型、植物生理状态、培养基及培养环境
等[8]。
大花蕙兰属于兰科兰属，是易褐化的植物，在外植
体诱导及试管苗增殖中均存在褐化现象，这是由基因
型导致的。该试验选取了基本培养基、糖浓度、琼脂浓
度、试管苗大小及花色为被试影响因素，结果表明：花
色对褐化的影响显著，其他因素对褐化均有不同程度
的影响，但影响不显著。三种基本培养基MS、1/2MS、
1/4MS区别在于培养基中无机盐的含量，此试验中基
马文卿等：大花蕙兰试管苗增殖过程中的褐化研究 ·· 189
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本培养基为MS时褐化率最低。前人研究亦有两种不
同结果，赵鹂等认为较低浓度的无机盐含量[2]，有利于
防止植物材料褐化，而钟士传等则认为较高浓度的无
机盐含量有利于防止褐化[9]，因此对于基本培养基中
无机盐的含量对褐化的影响有待于进一步验证。糖浓
度对褐化的影响，随糖浓度的升高，培养基中氨态氮的
含量增多，褐化率升高，这与前人在芹菜原生质体的研
究中所得到的结果一致[10]；琼脂浓度决定了培养方式
为液体培养、半固体培养还是固体培养，不同种类的植
物适合不同的培养基方式 [11]。该试验中琼脂浓度为
0.2%时褐化率最低，但培养基状态为半固体，不利于
试管苗的固定，因此大花蕙兰试管苗适宜的培养方式
为固体培养；试管苗大小对褐化的影响，随试管苗增
大，褐化越严重，这与其生理状态有关，这与前人研究
生理状态对褐化的影响的结果一致[8]。影响褐化的因
素还与细胞分裂素的浓度、pH的大小、光照强度等有
关，因此，对于影响大花蕙兰褐化的主要原因还有待于
进一步研究。
对褐化的克服，前人也进行了很多研究。选择合
适的外植体部位，适宜的培养基，有利的培养条件，添
加抗氧化剂与吸附剂，减少对外植体的损伤等[7]。此
试验在前人研究的基础上选取两种吸附剂活性炭和聚
乙烯吡咯烷酮，两种抗氧化剂维生素 C和硫代硫酸
钠。结果表明添加活性炭的效果最好，添加1500mg/L
活性炭，使褐化得到很好的控制，并使得试管苗生长旺
盛，保持较高的增殖系数。
另外，有研究者认为添加天然复合物如椰乳[12]、香
蕉泥[3]等，可减轻褐化。及时更换培养基也是减轻褐
化的一种方法[12]，但成本较高且费时。
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