全 文 ：中国药物与临床 2009 年 7 月第 9 卷第 7 期 Chinese Remedies & Clinics，July 2009,Vol.9,No.7
白黎芦醇（RES）是广泛存在于水果、中药和葡
萄酒中的一种植物抗毒素和抗氧化剂， 具有心血管
保护作用， 是目前发现的最好的天然去乙酰化酶
（SIRT）1激活剂［1-3］。陈丽函等［4］和 Yoshida等［2］先后报
道了 RES显著减弱心脏损伤、 保护心功能的作用在
一定程度上与 SIRT1的表达相关。本课题组前期工作
也证实，RES在体外可以激活 SIRT1， 从而保护缺氧
诱导的心肌细胞凋亡［5］。 但是，RES 在心肌细胞中对
SIRT1 表达时序的影响并不清楚， 本实验就上述问
题做了初步的研究。
1 材料与方法
1.1 主要材料和试剂
实验细胞 H9c2（2-1）大鼠心肌细胞株购自上海
细胞库（美国 ATCC, American Type Culture Collec－
tion，ATCC号：CRL-1446）。
主要试剂： 兔抗鼠 SIRT1多克隆抗体购自美国
Santa Cruz公司； 生物素标记的羊抗兔 IgG二抗购自
美国 KPL 公司；胎牛血清（FBS）购自德国 Biochrom
公司，ABC 试剂盒购自美国 Vector Laboratories，RES
和噻唑蓝（MTT）购自美国 Sigma公司，化学增强发光
（ECL）试剂盒购自美国 Santa Cruz公司；总 RNA提取
试剂盒及 cDNA第一链合成试剂盒购自天根生化科技
（北京）公司；聚合酶链反应（PCR）引物由上海基康公
司合成， 引物序列：18S正向 5′-ATTCCGATAACGA-
ACGAGAC-3′ ， 反向 5′-GGCATCACAGACCTGT－
基金项目：广东省自然科学基金（5008363）；广东省医学科研基金
（B2006106）
作者单位：515041 汕头大学医学院第一附属医院心内科 （王欣、
王伟、余伟、陈纯娟）；汕头大学医学院细胞衰老实验室（傅玉才）
通信作者：王伟，Email: janey_stu@yahoo.cn
白黎芦醇对心肌细胞去乙酰化酶 1表达时序的影响
王 欣 王 伟 余 伟 傅玉才 陈纯娟
【摘 要】 目的 探讨白黎芦醇（RES）在心肌细胞中对去乙酰化酶（SIRT）1 表达时序的影响。方法 大鼠心
肌细胞株 H9c2 培养 48 h 后，分别以 0（对照组）、10（低剂量组）、20（中等剂量组）、50、100 μmol/L（高剂量组）的
RES 处理 0、12、24、36、48 h，采用噻唑蓝 （MTT）比色法测定细胞活力 ；反转录-聚合酶链反应 （RT-PCR）分析
SIRT1 mRNA 表达情况，Western blot 法检测 SIRT1 蛋白表达水平的变化。 结果 H9c2 心肌细胞经 RES 处理后，
MTT 测得的吸光度（A）值在低、中剂量升高，20 μmol/L 组作用最显著（P<0.05），50 μmol/L 组开始下降，低于对照
组（P>0.05），100 μmol/L 组降至最低（P<0.05）；各组 SIRT1 mRNA 和蛋白表达 A 值均高于对照组（P<0.05），与低、
高剂量组相比，中等剂量组表达最高（P<0.05）；中等剂量组 RES 处理 0、12、24、36、48 h 后，不同时间点 SIRT1
mRNA 和蛋白表达 A 值均高于对照组（P<0.05），以 24 h 时表达最强（P<0.01）。 结论 20 μmol/L RES 作用 24 h
时心肌细胞的 SIRT1 表达最强。
【关键词】 抗氧化剂； 心肌； 大鼠
Effects of resveratrol on the sequential expression of SIRT1 in cardiomyocytes WANG Xin*, WANG Wei, YU
Wei, FU Yu-cai, CHEN Chun-juan. *Department of Cardiology, First Affiliated Hospital, Shantou University Medical
College, Guangdong 515041, China
【Abstract】 Objective To observe the effect of resveratrol (RES), an activator of silent information regulator 2,
on the sequential expression of SIRT1 in cardiomyocytes. Methods After 48 h culture under normal condition, the
embryonal rat heart-derived H9c2 cells were treated with 0 (control group), 10 (low dose group), 20 (medium dose
group) 50 and 100 μmol/L (high dose groups) of RES for 0, 12, 24, 36 and 48 h. Cell viability was analyzed by MTT
assay, expression of SIRT1 mRNA by RT-RCR and SIRT1 products by Western blot. Results The optical densities
(A) of MTT was increased in the low and medium dose groups, appeared markedly higher with 20 μmol/L RES treat-
ment (P<0.05), and was lower than normal in the high dose groups, particularly in the 100 μmol/L group (P<0.05). The
expressions of SIRT1 mRNA and protein were increased after treated with different concentrations of RES (P<0.05),
most notability with 20 μmol/L. At different time spots of incubation with 20 μmol/L RES (0, 12, 24, 36, and 48 h),
the A values of SIRT1 mRNA and proteins were higher than those in controls (P<0.05), with a peak at 24 h. Conclu-
sion The maximum expression of SIRT1 was achieved with treatment of 20 μmol/L RES for 24 h in cadiacmyocytes.
【Key words】 Antioxidants； Myocardium； Rats
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中国药物与临床 2009 年 7 月第 9 卷第 7 期 Chinese Remedies & Clinics，July 2009,Vol.9,No.7
0 10 20 50 100 μmol/L
SIRT1 mRNA
18S rRNA
图 2 不同浓度的 RES 作用 24 h 后心肌细胞 SIRT1
mRNA 与 18S rRNA 的 RT-PCR 凝胶电泳成像
0 10 20 50 100 μmol/L
SIRT1
β-actin
图 1 Western blot 法检测不同浓度的 RES 作用 24 h
后心肌细胞 SIRT1 蛋白与 β-actin 表达变化
TATTG-3′；SIRT1正向 5′-CCAGATCCTCAAGCCAT－
GT-3′，反向 5′-TTGGATTCCTGCAACCTG-3′。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养： 于含 10％FBS 的高糖达氏修正依
氏培养基（DMEM）中，用 0.25％胰酶-0.02%乙二胺
四乙酸 （EDTA） 溶液消化后传代 （10 000～12 000
cells/cm2）。
1.2.2 MTT 法检测 RES 对细胞活力的影响：H9c2
细胞接种于 96 孔培养板，培养 48 h 后弃旧培养液，
加入终浓度为 10、20、50、100 μmol/L 的 RES 培养
液，每组 6 孔,继续培养 48 h 后进行 MTT 比色测定。
即每孔加入 20 μl 新鲜配置的 MTT 溶液，37 ℃继续
培养 4 h 后终止培养，弃去孔内培养液，每孔加 150
μl二甲基亚砜（DMSO），恒温摇床振荡 10 min。选择
波长 490 nm， 以经过相同处理的空白孔为调零值，
在酶联检测仪上测各孔吸光度（A）值。
1.2.3 RT-PCR 法检测 RES 对 SIRT1 mRNA 表达
的变化： 总 RNA 提取、cDNA 合成及 PCR 反应体系
按照试剂盒操作步骤操作。 PCR 反应条件：94 ℃预
变性 3 min；然后按 94 ℃变性 30 s、58 ℃退火 30 s、
72 ℃延伸 1 min，循环 35 次，最后 72 ℃延伸 6 min。
扩增完成后取 5 μl PCR 产物加 1 μl 6×DNA loading
buffer，60 V 电泳。凝胶成像系统观察并拍照。上海天
能科技有限公司 GIS（3.74）凝胶图像处理系统 GIS
密度分析软件分析。
1.2.4 Western blot 法检测 RES 对 SIRT1 蛋白表达
的变化： 经 RES 处理后细胞用冷的磷酸盐缓冲液
（PBS）洗 3次，加入 500 μl RIPA 裂解液（5×106个细
胞），置冰上 30 min后，用细胞刮取器刮下细胞，4 ℃
12 000 r/min 离心 30 min，上清即为总的细胞蛋白溶
解成分。按常规方法进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰
胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）， 分离胶为 10％；200 mA
转膜（经甲醇处理的 PVDF 膜），5％脱脂奶粉室温封
闭 1 h 后，置于兔抗鼠一抗（用封闭液 l∶1000 稀释）
中，4 ℃孵育过夜，TBS-T 洗 3次，每次 10 min。 置生
物素标记的羊抗兔二抗（用封闭液 l∶3000 稀释）中，
室温孵育 1 h，TBS-T 洗 3次，每次 10 min。 1∶500稀
释的 ABC 试剂室温 30 min，TBS-T 洗 3 次，每次 10
min。 用 ECL 系统进行检测，X 线片显影。 Quantity
One 软件分析目的条带的灰度值。
1.2.5 统计学方法： 所得数据用 x±s 表示， 采用
SPSS13.0软件进行单因素方差分析（SNK 法），以 P<
0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 RES 对细胞活力的影响：MTT 测定方法为研究
细胞活力的有效手段 。 为分析不同浓度 RES 对
H9c2 细胞活力的影响 ， 分别用 0、10、20、50、100
μmol/L RES 处理 48 h 进行 MTT 检测 A 值分别为
0.442±0.012、0.465±0.017、0.515±0.014、0.426±0.015、
0.331±0.012。结果表明：低、中剂量处理组 A 值均高
于对照组，20 μmol/L RES 组作用最显著（P<0.05），
50 μmol/L 组开始下降， 低于对照组 （P>0.05），100
μmol/L 组降至最低（P<0.05），表明低浓度的 RES 对
H9c2 细胞的活力有促进作用 ；相反 ，高浓度 RES
（>50 μmol/L）对细胞活力有抑制作用。
2.2 不同浓度的 RES 对 SIRT1 mRNA 表达的影
响：RES 处理后各组细胞中 SIRT1 mRNA 的表达增
加，其中 20 μmol/L 组表达量最高。各组目的基因与
18 S 基因 A 值：10 μmol/L 组与对照组比较，SIRT1
mRNA 表达量上升（P<0.05）；而 20、50、100 μmol/L
组与对照组比较，SIRT1 mRNA 表达量显著上升（P<
0.01）（图 1）。
2.3 不同浓度的 RES 对 SIRT1 蛋白表达的影响：
以 0、10、20、50、100 μmol/L RES 处理细胞 24 h 后，
采用 Western blot 法检测 H9c2 细胞中 SIRT1 蛋白
表达情况。 结果显示，RES 显著上调 H9c2 细胞中
SIRT1蛋白的表达，其中以 20 μmol/L 组表达量最高。
各组目的蛋白与 β-actin A值： 各处理组与对照组比
较，SIRT1蛋白表达量显著上升（P<0.05）；而 20 μmol/L
组与 10、50、100 μmol/L 组比较，SIRT1蛋白表达量显
著上升（P<0.05）（图 2）。
2.4 20 μmol/L RES 在不同时间点对 SIRT1 蛋白表
达的影响：H9c2细胞用 20 μmol/L RES 分别处理 0、
12、24、36、48 h 后， 采用 Western blot 法检测 H9c2
细胞中 SIRT1蛋白表达情况。结果显示，在不同时间
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中国药物与临床 2009 年 7 月第 9 卷第 7 期 Chinese Remedies & Clinics，July 2009,Vol.9,No.7
0 12 24 36 48 h
SIRT1
β-actin
图 3 Western blot 法检测 20 μmol/L RES 作用不同时
间后心肌细胞 SIRT1 蛋白与 β-actin 表达变化
点 RES 显著上调 H9c2 细胞中 SIRT1 蛋白的表达，
其中以 24 h 时表达最高。 各时间点 SIRT1 蛋白与
β-actin A 值： 与对照组比较，RES 处理后 SIRT1 蛋
白表达量显著上升 （P<0.05）； 与 12 h 组比较，24 h
组 SIRT1蛋白表达量显著上升（P<0.05）（图 3）。
3 讨 论
SIRT 是在研究酵母菌转录沉默时发现的一个
广泛存在于各种物种的基因，在转录沉寂、染色质稳
定、双链 DNA 断裂损伤后生理修复，以及延长细胞
周期中起着重要的作用， 具有组蛋白去乙酰化酶活
性［6］。从古细菌到真核生物，SIRT均具有高度保守性。
SIRT 与多种细胞的衰老密切相关。
在哺乳动物共有 7个 SIRT 同源基因，分别命名
为 SIRT1~7， 其中 SIRT1 和酵母菌 SIRT 同源性最
高，目前也被研究的最多［1］。 在心肌细胞活力和寿命
调节方面，SIRT1是极具吸引力的候选因子。 大部分
SIRT1 基因缺失的小鼠存在宫内心脏发育异常，如
心脏房间隔缺损、室间隔缺损、瓣膜缺失等，且同时
伴有多器官发育缺陷、畸形，大部分死于宫内；小部
分 SIRT1基因缺失小鼠出生后， 其个体和器官较正
常者小，且存活率极低 ［7］。 Alcendor 等［8］用 SIRT1 最
强抑制剂尼克酰胺（nicotinamide，NAM）处理原代培
养的大鼠心肌细胞 48 h 后发现，NAM 呈剂量依赖
性使细胞皱缩、脱落、凋亡。 可见，SIRT1表达缺失或
活性丧失均使心肌细胞凋亡增加。
近年来已经发现了多种能调节 SIRT1 活性的小
分子物质，如 qucrcctin，picca- tannol 和 RES 等多酚
物质。 有研究证实，RES 在体内、外均能激活 SIRT1
酶，从而通过 SIRT1依赖性途径延长细胞寿命［1］。 有
研究证实，高剂量的 RES（＞50 μmol/L）具有抑制细
胞增殖、促凋亡等作用。 目前 RES 用于诱导肿瘤细
胞凋亡已有大量的研究报道 ［9，10］。 Howitz 等 ［3］报道
11 μmol/L RES（终浓度）能使 SIRT1 酶的脱乙酰基
作用增强 1倍，至 100~200 μmol/L 时，RES对 SIRT1
酶的脱乙酰基作用达到饱和。 虽然有众多研究证实
RES 在心肌细胞中可以激活 SIRT1， 但是 RES 对
SIRT1表达的时序影响并不清楚。
本研究利用 MTT 法观察了不同浓度的 RES 对
培养心肌细胞活力的影响， 结果发现低、 中剂量的
RES具有促进细胞增殖的作用，而高剂量的 RES（＞50
μmol/L）却有抑制细胞增殖作用。 此外，我们用半定
量 RT-PCR 和 Western blot 法分别检测了 RES 在不
同浓度及不同时间对 SIRT1 mRNA 和蛋白表达的变
化。 RT-PCR 结果显示，20 μmol/L RES 作用 24 h时
心肌细胞的 SIRT1 mRNA 表达最强 ， 至 50~100
μmol/L 时，RES 对 SIRT1 mRNA 作用达到饱和。 不
同浓度的 RES 都可以上调 SIRT1 蛋白的表达，但以
20 μmol/L 时最明显； 我们进一步观察 20 μmol/L
RES 在不同时间点都可以激活 SIRT1，但以 24 h 时
最为显著。这与 Bai等［11］最近报道的 RES呈时间、浓
度依赖性地激活 SIRT1 mRNA 的表达结果不一致。
我们推测可能与实验过程中所选择的细胞株不同有
关，其具体机制还有待于进一步深入研究。
参 考 文 献
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（收稿日期：2009-03-12）
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