全 文 ：中国生物工程杂志 China Biotechnology，2011，31(3) :76-80
檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪
檪
檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪
檪
殏
殏殏
殏
技术与方法
超滤膜分离纯化珊瑚藻溴过氧化物酶*
程小飞1 章表明2，3 薛 松2 肖通虎1＊＊
(1 宁波大学材料科学与化学工程学院 宁波 315211 2 中国科学院大连化学物理研究所 大连 116023)
(3 中国科学院研究生院 北京 100049)
摘要 利用超滤膜对珊瑚藻中溴过氧化物酶(EC 1． 11． 1． 18，分子质量 740kDa)进行分离纯化，对
膜的截留分子质量、操作压力、起始蛋白质浓度、搅拌速率、pH、离子强度等条件进行了优化。超
滤分离纯化最优条件为:截留分子质量为 100kDa的聚偏氟乙烯(PVDF)膜，操作压力为0． 02MPa，
搅拌速率为 600r /min，起始蛋白质浓度为 0． 1g /L，pH =6． 0。对粗酶液先进行热沉淀纯化，再进行
超滤纯化，溴过氧化物酶被纯化了 21 倍，比活为 212U /mg，酶活回收率为 96%。
关键词 溴过氧化物酶 聚偏氟乙烯(PVDF)膜 超滤 纯化
中图分类号 Q814． 1
收稿日期:2010-11-19 修回日期:2011-01-13
* 国家“973”计划(2009CB724700)、中国科学院知识创新工程重
要方 向 项 目 (KSCX2-YW-G-073)、浙 江 省 自 然 科 学 基 金
(Y407353)、浙江省公益技术研究项目(2010C31099)资助项目
＊＊通讯作者，电子信箱:xthci@ sina． com
溴过氧化物酶(bromoperoxidase，简称 BPO)是
一种重要的卤素过氧化物酶，具有良好的热稳定性
和有机溶剂耐受性，能催化硫氧化、环氧化、吲哚氧
化等［1-2］反应，在药物和高附加值化合物合成方面越
来越引起重视，具有很好的工业应用前景［3］。BPO
主要存在于海藻中，尤以珊瑚藻中含量较高［4］。目
前，国内外有许多报道溴过氧化物酶的分离纯化方
法，其中以 Manthey［5］和 Sheffield 等［6］建立的方法较
为典型，其基本过程为:先对粗酶液进行硫酸铵沉
淀，再经过两步或多步柱层析，这些方法普遍存在过
程复杂、回收率低等缺陷。膜分离技术具有能耗低、
工艺设备简单、操作方便、分离效果好等优点，已被
广泛应用于蛋白质分离纯化［7-14］。本文利用聚偏氟
乙烯(PDVF)超滤膜对珊瑚藻溴过氧化物酶进行分
离纯化，以期建立一种简便、高效的溴过氧化物酶分
离纯化方法。
1 材料与方法
1． 1 材料与仪器
珊瑚藻采自大连海域(石槽) ，采集后洗净，于
－20℃储存备用;聚偏氟乙烯(PVDF)平板超滤膜，截
留分子质量(MWCO)分别为 140kDa，100kDa，70kDa
(上海应用物理研究所新技术中心)。
DS-1高速组织捣碎机(上海标本模型厂制造) ;SCM
超滤杯:膜的有效过滤面积为 38． 5cm2(上海应用物理研
究所新技术中心) ;高速冷冻离心机(德国 Sigma 公司) ;
V-530紫外 /可见分光光度计(日本 JASCO公司)。
1． 2 试 剂
单氯双甲酮(MCD，Sigma 公司) ，牛血清白蛋白
(Sigma公司) ，Tris碱(Amesco 公司) ，标准分子质量蛋
白质(上海生物工程公司) ，30% H2O2、十二烷基磺酸
钠(SDS)、丙烯酰胺(ACR)、甲叉双丙烯酰胺(BIS)、双
甲基乙胺(TEMED)、过硫酸铵、巯基乙醇、二硫苏糖醇
(DTT)、考马斯亮蓝 R-250，均为国产分析纯试剂。
1． 3 方 法
1． 3． 1 粗酶液制备 取 500g(湿重)珊瑚藻，加入
600ml Tris-HC1 缓冲液(50mmol /L，pH = 8． 3) ，用组织
粉碎机捣碎后置于 4℃ 抽提 8h，离心(13 000g ×
DOI：10.13523/j.cb.20110313
2011，31(3) 程小飞 等:超滤膜分离纯化珊瑚藻中的溴过氧化物酶
10min) ，取上清液为粗酶液。
1． 3． 2 热沉淀 粗酶液热沉淀方法［15］为:向比活为
10U /mg的粗酶液中加入 1mmol /L 原钒酸钠(终浓
度) ，混匀，于 70℃水浴中加热 2h 后，离心(13 000g ×
10min) ，弃沉淀保留上清液。
1． 3． 3 超滤 向超滤杯中加入 200ml经热沉淀纯化后
的粗酶液(用稀酸调节 pH) ，以 0． 02MPa 压力、
600r /min速率磁力搅拌超滤，当超滤至杯中剩余约
20ml酶液时，停止超滤并收集酶液，测定酶活和蛋白质
浓度。
1． 3． 4 溴过氧化物酶活性测定 参照文献［16］，向 pH
= 6． 0 的磷酸盐缓冲液(100mmol /L)中依次加入
50μmol /LMCD、100mmol /L KBr 和 2mmol /L H202，混
匀，加入适量溴过氧化物酶液，使总体积为 3ml，混匀，
迅速置于紫外-可见分光光度仪中测定体系在 290nm
处的吸光值变化，以每分钟消耗 1μmol MCD 所需的酶
量定义为一个溴过氧化物酶活力单位，并按下面公式
计算酶活。
U =
ΔA290 × 3
19． 9
式中，U为酶活力浓度，单位 U;ΔA290为 290nm 波长处
1min内吸光值的变化值;19． 9 为 MCD 的摩尔吸光系
数，单位 mmol /cm。
1． 3． 5 蛋白含量的测定 采用 Lowry测定法［17］。
1． 3． 6 溴过氧化物酶亚基分子质量的确定 对纯化
过程中酶液进行 SDS-PAGE［18］电泳，电泳条件为:5%
浓缩胶，12%分离胶，恒压 200V。使用的 Marker 及其
分 子 质 量 为:phosphorylase b (97． 2kDa) ，BSA
(66． 4kDa) ，ovalbumin (44． 3kDa) ，carbonic anhydrase
(29kDa)和 muramidase (14． 3kDa)。
2 结果与分析
2． 1 超滤膜的选择
在利用超滤膜进行蛋白质分离时，如果 MWCO 太
大，则酶的回收率低;MWCO 太小，则溶液在膜的表面
流动时，溶液中的一些胶体物质会在膜表面形成一层
动态膜，会使较小分子质量的物质也起到截留作用，因
而超滤效率低，且膜通量也小。
根据文献报道［6，19］，BPO全酶由 12 个亚基构成，全
酶分子质量为 740kDa，实验选择 MWCO 分别为
140kDa、100kDa、70kDa的 PVDF平板超滤膜进行超滤，
结果见图 1。由图 1 可知，虽然酶的分子质量为
740kDa，但当用 140kDa 的膜进行超滤时，酶的截留效
果很差，这可能与酶分子的具体空间形态有关。选择
MWCO =100kDa的膜进行分离纯化，效果最佳。
图 1 不同截留分子质量的超滤膜对酶活
回收率和纯化倍数的影响
Fig． 1 Effect of MWCO on the activity recovery
and purification
2． 2 搅拌速率的影响
搅拌速率增大，膜表面不易形成凝胶层，膜通量也
增大，但搅拌速率过大，也易导致酶因机械剪切力而失
活。选择搅拌速率在 400 ～ 800r /min进行超滤，考察其
对纯化倍数和膜通量的影响，结果见图 2 所示。由图 2
可知，随着搅拌速率增大，膜通量逐渐增大，但纯化倍
数变化很小。当转速大于 600r /min 时，膜通量变化不
大。因此，选择 600r /min为最佳搅拌速率。
图 2 搅拌速率对纯化倍数和膜通量的影响
Fig． 2 Effect of stirring speed on the purification
and permeate flux
2． 3 蛋白质浓度的影响
选择起始蛋白质浓度为 0． 05 ～ 0． 24g /L 进行超
滤，考察起始蛋白质浓度对纯化倍数和膜通量的影响
(图 3)。由图 3 可以看出，随着起始蛋白质浓度增加，
纯化倍数和膜通量均逐渐减小，可能是蛋白质浓度增
加，在超滤过程中凝胶层形成较快，导致膜通量和纯化
77
中国生物工程杂志 China Biotechnology Vol． 31 No． 3 2011
倍数均逐渐下降。但在实际工艺生产过程中，如果粗
酶液浓度过低，将会增加超滤的消耗和成本。综合考
虑，选择起始蛋白质浓度为 0． 1g /L为最佳。
图 3 蛋白质浓度对纯化倍数和膜通量的影响
Fig． 3 Effect of protein concentration on the
purification and permeate flux
2． 4 操作压力的影响
压力是超滤的原动力，操作压力增大虽然加快了
粗酶液中蛋白质等大分子物质的传质速度，但也加快
了被截留大分子在膜表面聚集的速度，从而加重浓差
极化，甚至形成凝胶层，小分子质量蛋白质也不能透
过，因而可能导致纯化效果低。选择压力为 0 ～
0． 1MPa进行超滤，考察压力对膜通量和纯化倍数的影
响(图 4)。
图 4 压力对纯化倍数和膜通量的影响
Fig． 4 Effect of pressure on the purification
and permeate flux
由图 4可以看出，当压力为 0时，膜通量为 0。当压力
大于 0． 02MPa时，纯化倍数逐渐降低，随着压力增大，纯化
倍数逐渐减小，膜通量逐渐增大，当压力过大时，膜通量也
缓慢减小。综合考虑，因此选择最佳压力为0． 02MPa。
2． 5 溶液 pH的影响
选择溶液 pH为 4 ～8． 3进行超滤，考察溶液的 pH对
纯化倍数和酶回收率的影响(图 5)。由图 5 可知，当 pH
为 4． 0时，酶活回收率最低，此时出现大量沉淀，溴过氧化
物酶的等电点 pI =4 ～5，在等电点附近，蛋白质的溶解度
最小。随着 pH增大，纯化倍数和酶活回收率均逐渐增大，
当 pH =6． 0时达到最大，故选择 pH =6． 0为最佳。
图 5 pH对酶活回收率和纯化倍数的影响
Fig． 5 Effect of pH on the activity recovery
and purification
2． 6 离子强度的影响
一般认为离子强度影响膜表面和蛋白质表面的电
荷，从而影响超滤过程中蛋白质在膜上的通量及截留。
然而盐的加入并非越多越好，当盐的浓度超过某一特
定值后，有可能屏蔽掉有利于蛋白质分离的有效电荷，
反而引起膜通量的下降。
粗酶液中盐浓度为 0． 05mol /L，向其中加入一定量
的 NaCl，配制成 NaCl浓度分别为 0． 1mol /L，0． 2mol /L，
0． 3mol /L，0． 4mol /L 进行超滤，考察离子强度对酶活回
收率和膜通量的影响(图 6)。由图 6 可知，膜通量随
NaCl含量升高而逐渐降低，当 NaCl浓度大于 0． 2mol /L
时，酶活回收率也逐渐降低，这说明增加离子强度不能
改善本实验的超滤效果。因此，不需加入 NaCl 来调节
粗酶液中的离子强度。
图 6 离子强度(NaCl)对酶活回收率和膜通量的影响
Fig． 6 Effect of ionic strength (NaCl)on the activity
recovery and permeate flux
87
2011，31(3) 程小飞 等:超滤膜分离纯化珊瑚藻中的溴过氧化物酶
2． 7 SDS-PAGE电泳分析
对各纯化过程的酶液进行 SDS-PAGE分析(图 7)。
由图 7 可知，经超滤纯化后，溴过氧化物酶的相对含量
大大提高。经计算，溴过氧化物酶亚基的分子质量约
为 64kDa，与文献结果［6］一致。
图 7 溴过氧化物酶的 SDS-PAGE电泳图
Fig． 7 SDS-PAGE of purified bromoperoxidase
from Corallina officinalis
M:Lower molecular weight standard protein;1:Crude extraction;2:
The enzyme solutions purified by heat treatment;3:The enzyme
solutions purified by ultra filtration
2． 8 优化条件下超滤结果
在优化条件下:截留分子质量为 100kDa 的聚偏氟
乙烯膜，操作压力为 0． 02MPa、搅拌速率为 600r /min、
起始蛋白质浓度为 0． 1g /L、pH = 6． 0，对溴过氧化物酶
进行分离纯化(表 1)。经过两步纯化后，溴过氧化物酶
被纯化了 21 倍，得到比活 212U /mg 的溴过氧化物酶，
酶活总收率为 96%。目前文献报道中，以 Sheffield［6］建
立的方法纯化效果较好，经过一步硫酸铵沉淀和三步
柱层析，比活为 470U /mg，收率为 22%。本文建立的超
滤纯化方法，酶活收率提高至 96%，为文献值的 4． 4
倍。因此，采用超滤提取溴过氧化物酶，简化了操作步
骤、缩短了时间。
4 结 论
本实验使用 MWCO 为 100kDa 的聚偏氟乙烯平板
膜对溴过氧化物酶进行分离纯化，在 0． 02MPa 压力、
600r /min搅拌速率、0． 1g /L 的起始蛋白浓度，pH = 6． 0
的条件下，纯化倍数为 21 倍，得到比活力为212U /mg的
溴过氧化物酶，酶活回收率为 96%。本方法具有步骤
简单、收率高等特点。
表 1 珊瑚藻中溴过氧化物酶的分离纯化
Table 1 Purification of BPO from Corallina officinalis
纯化步骤
Purification step
总酶活 /U
Total activity
总蛋白 /mg
Total protein
比活 /(U /mg)
Specific activity
纯化倍数
Purification fold
回收率 /%
Recovery
粗酶液
Crude extraction 1010 100 10． 1 1． 0 100
热沉淀
Heat treatment 1044 19． 9 52． 5 5． 2 103． 3
超滤
Ultra filtration 968 4． 57 212 21 96
参考文献
［1 ］ Dembitsky V M． Oxidation， epoxidation and sulfoxidation
reactions catalysed by haloperoxidases． Tetrahedron，2003，59
(26) :4701-4720．
［2］Andersson M，Willetts A，AIlenmark S． Asmmetric sulfoxidation
catalyzed by a vanadium-containing bromopemxidase． J Org
Chem，1997，62(24) :8455-8458．
［3］ Butler A． Vanadium haloperoxidases． Curr Opin Chem Biolog，
1998，2(2) :279-285．
［4］Moore C A，Okuda R K． Bromopemxidase activity in 94 speciesof
marine algae． J Nat Toxins，1996，5(1) :295-305．
［5 ］ Manthey J A，Hager L P． Purification and properties of
bromoperoxidase from Penicillus capitatus． J Biol Chem，1981，
256(21) :11232-11238．
［6］ Sheffield D J，Harry T，Smith A J，et al． Purification and
characterization of the vanadium bromoperoxidase from the
macroalga Corallina officinalis． Phytochemistry，1993，32(1) :
21-26．
［7］陈全省，赵杰文，岳鹏翔． 中空纤维超滤膜分离菜籽饼粕中
蛋白质的实验． 农业机械学报，2006，37(8) :1-4．
Chen Q S，Zhao W J，Yue Q P． Transactions of the Chinese
Society for Agricultural Machinery，2006，37(8) :1-4．
［8］王健，张雪霞，王海燕． 超滤法提纯万古霉素的应用． 生物加
工过程，2010，8(4) :17-21．
Wang J，Zhang X X，Wang H Y． Chinese Journal of Bioprocess
Engineering，2010，8(4) :17-21．
［9］Wan J B，Liu J G，Lu J R，et al． Isolation and purification of
superoxide dismutase from garlic using two-stage ultrafiltration．
97
中国生物工程杂志 China Biotechnology Vol． 31 No． 3 2011
Journal of Membrane Science，2010，352(1) :231-238．
［10］Liu J G，Lu J R，Zhao X B，et al． Separation of glucose oxidase
and catalase using ultrafiltration with 300-kDa polyethersulfone
membranes． Journal of Membrane Science，2007，299(1) :
222-228．
［11］薛长湖，管华诗，于宜法． 现代生物工程分离提取技术在海
洋生物资源开发上的应用． 生物工程进展，1996，16(6) :49-
53．
Xue C H，Guan H S，Yu Y F． China Biotechnology，1996，16
(6) :49-53．
［12］Lin S H，Hung C L，Juang R S． Effect of operating parameters on
the separation of proteins in aqueous solutions by dead-end
ultrafiltration． Desalination，2008，234(1) :116-125．
［13］刘大川，杨国燕，翁利荣． 超滤膜法制备大豆分离蛋白工艺
研究． 中国油脂，2003，28(11) :30-34．
Liu D C，Yang G Y，Weng L R． China Oils and Fats，2003，28
(11) :30-34．
［14］ Mukai Y，Iritani E，Murase T． Fractionation characteristics of
binary protein mixture by ultrafiltration． Sep Sci Tech，1998，
33 (2) :169-185．
［15］Zhang B M，Cao X P，Cheng X F，et al． Efficient purification with
high recovery of vanadium bromoperoxidase from Corallina
officinalis． Biotechnol Lett，2011，33(1) :545-548．
［16］ Itoh N， Izumi Y． Characterization of nonheme type
bmmpemxidase in Corallina pilulifera． J Biol Chem，1986，26l
(1) :5194-5200．
［17］Lowry O H，Rosebrough N J，Lewisfarr A． Protein measurement
with the Folin phenol reagent． J Biol Chem，195l，193(1) :
265-275．
［18］汪家政，范明． 蛋白质技术手册． 北京:科学出版社，2000，
77-122．
Wang J Z，Fan M． Protein Technical Manual． Beijing:Science
Press，2000，77-122．
［19］Michail N I，Aandrew R D，Amanda A B，et al． Crystal structure
of dodecameric vanadiumdependent bromoperoxidase from the
red algae Corallina officinalis． J Mol Biol，2000，299(1) :
1035-1049．
Isolation and Purification of Bromoperoxidase from
Corallina Officinalis Using Ultrafiltration Membrane
CHENG Xiao-fei1 ZHANG Biao-ming2，3 XUE Song2 XIAO Tong-hu1
(1 Faculty of Materials Science and Chemical Engineering，Ningbo University，Ningbo 315211，China)
(2 Dalian Institute of Chemical Physics，Chinese Academy of Sciences，Dalian 116023，China)
(3 Graduate University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China)
Abstract A novel，simple and highly efficient process for purifying vanadium bromoperoxidase from
Corallina officinalis is developed，which is consist of two steps:crude enzyme extraction was heated at 70℃ for
2h，and then was ultrafiltered with PVDF membrane． The ultrafiltration conditions were optimized，and the
optimized conditions are:MWCO = 100kDa，0． 02MPa pressure，600r /min stirring，0． 12mg /ml initial protein
concentration and pH =6． 0． The crude extraction purified with heat treatment and then ultrafitration results a 21-
fold purification，with a 96% overall yield and 212U /mg specific activity．
Key words Vanadium Bromoperoxidase Polyvinylidenefluoride (PVDF)membrane Ultrafiltration
Purification
08