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微丝解聚剂及微管阻断剂对藓羽藻细胞重建过程的影响



全 文 : 
第44卷 第12期 
2014年12月
中 国 海 洋 大 学 学 报
PERIODICAL OF OCEAN UNIVERSITY OF CHINA
44(12):048~053
Dec.,2014
微丝解聚剂及微管阻断剂对藓羽藻细胞
重建过程的影响
毛玉峰,刘玉娇,张 真,董 文
(中国海洋大学海洋生命学院,山东 青岛266003)
摘 要: 某些种类的海洋多核绿藻的原生质被挤出后,其细胞器在人工海水中可立即发生聚集,随后其细胞组分发生重
建,形成新的细胞膜与细胞壁,这些重建的细胞在最佳培养条件下,最多有40%能够发育成成熟藻体。细胞骨架系统是细
胞内有序性的维系者,也是细胞及细胞器运动的动力源,这些过程都涉及细胞骨架的解聚与重聚合的动态过程。本文利用
微丝解聚剂细胞松弛素B及微管阻断剂秋水仙素对藓羽藻(Bryopsis hypnoides)细胞重建过程的影响进行了研究。结果
显示,细胞器聚集及聚集体变圆的动力不来自于细胞骨架系统,而原始微丝体系的解聚是细胞器高效聚集的基本条件;细
胞松弛素B及秋水仙素都显著抑制细胞膜的形成及细胞内组分有序性重建等后继发育过程,表明细胞骨架系统在这些过
程中扮演着重要角色。
关键词: 细胞重建;细胞骨架;细胞松弛素B;秋水仙素;藓羽藻
中图法分类号: Q172     文献标志码: A     文章编号: 1672-5174(2014)12-048-06
   基金项目:山东省自然科学基金项目(ZR2011CQ046);青岛市科技发展计划项目(12-1-4-1-(21)-jch);教育部博士点新教师基金项目
(200804231012)资助
收稿日期:2014-02-25;修订日期:2014-04-16
作者简介:毛玉峰(1979-),女,博士生。E-mail:maoyf@ouc.edu.cn
  通讯作者:E-mail:wdong@ouc.edu.cn
  细胞体外重建研究对探讨细胞的起源与进化问题
具有重要的理论意义,它为细胞的起源研究提供有效
的线索和证据,同样对基于细胞重建的生物技术如特
定用途的人造细胞的构建、外源遗传信息直接导入与
表达、直接的原生质体杂交等方面的研究都具有重要
的价值。Noireaux与Libchaber[1]研究发现在脂质体
膜上插入通道蛋白,能使包裹在脂质体内的表达载体
上的标记蛋白绿色荧光蛋白表达延长4d。Gibson等[2]
人工全合成了Mycoplasma genitalium 基因组而试图
创造人工生命,该课题组相关研究工作曾被《Nature》
评为2008年度科学新闻。但是到目前为止真正意义
上直接的人造细胞构建还是有相当大的困难[3-4]。脂
质体的体外自我组装说明细胞破碎后在一定条件下有
重新构建成有活力的完整细胞的可能性,相比细胞的
“全人工合成”,基于这种细胞重建的人造细胞构建在
理论上来说有更大的可行性。部分大型海洋多核单细
胞绿藻类的细胞重建为这一问题的研究提供了一个很
好的系统。当细胞质被挤出后,一般情况下人们会预
料到其细胞质成分将分崩离析,核酸酶、脂酶、蛋白酶
类将开始降解这些无序的细胞质物质,其细胞器也将
被分解、破碎。然而此类过程却并没有在这些绿藻中
发生:当这些大型的多核藻类细胞质被挤出后,在海水
中其细胞器迅速聚成大小为10~100μm 的聚集体,并
再生出细胞膜和细胞壁,最佳条件下40%团聚体最终
发育成成熟个体。目前发现多种管状藻的原生质都有
这个特点[5-10],羽藻属最为常见,而以羽藻(Broyopsis
plumose)和藓羽藻(Bryopsis hypnoides)的研究较多,
但多集中在描述性层面。
细胞骨架使细胞内的结构保持了合理的空间布局
与有序性,是细胞形态与功能多样性的结构基础[12-14]。
从细胞的有序性考虑,多核绿藻类细胞重建过程实际
上是由一种有序结构转变成另一种有序结构。在此过
程中细胞骨架系统进行了重新构建还是对原有系统分
割维系?细胞骨架系统在这类细胞重建过程中扮演何
种角色?细胞重建中细胞器聚集与其聚集体变圆过程
中的动力是否由细胞骨架系统提供?这些问题的解决
对基于此类细胞重建的细胞杂交、人工细胞的构建等
生物技术的开发至关重要。
1 材料和方法
1.1材料
藓羽藻于8~12月份采自青岛栈桥及太平角海域潮
间带,附带部分固着基的完整藻体用Ф0.22μm微孔滤
膜过滤的海水清洗干净后用自来水冲洗1min,迅速甩干
后用去离子水冲洗1min,尽快用吸水纸吸取表面的水
分。藻体剪成0.5cm长度,8层医用纱布过滤,获得其
12期 毛玉峰,等:微丝解聚剂及微管阻断剂对藓羽藻细胞重建过程的影响
原生质。细胞松弛素B和秋水仙素均购自Sigma公司。
1.2细胞体外重建
48孔细胞培养板中每孔加入pH=8.3的人工海
水(NaCl 2.472g,MgCl2·6H2O 0.466g,MgSO4·
7H2O 0.629g,KCl 0.067g,CaCl2·2H2O 0.136g,
Na2CO30.018g,去离子水溶解并定容至100mL,用
Ф0.22μm微孔滤膜过滤)180μL,加入原生质20μL,
混匀后一定温度下培养定期倒置显微镜观察,或者吸
取适量在凹玻片上培养并定期正置显微镜观察拍照。
1.3细胞松弛素B对细胞重建的影响
原生质3 000r/min离心10min,上清沸水浴
5min后用Ф0.22μm微孔滤膜过滤,用滤液配制10、4
和2mg/mL细胞松弛素B。1.5mL离心管中加入上
述溶液10μL,以及新鲜制备的原生质90μL,混合孵育
5min后加人工海水中900μL,混合,取适量在凹玻片
上培养并定期正置显微镜观察。每个样共设3个平行
组,定期倒置显微镜观察,并统计一定时期各尺度大小
的重建细胞(或者细胞器聚团)的数量,20倍物镜下每
个视野作为一个数据源。
1.4秋水仙素对细胞重建的影响
秋水仙素用少许乙醇溶解,配制成1、0.1和0.01
mg/mL人工海水溶液。微孔培养板中每孔加入各溶
液180μL,加入20μL原生质,混匀后一定温度培养,
共设3个平行组,定期倒置显微镜观察、统计、拍照。
2 结果和讨论
图1为藓羽藻细胞重建的基本过程。新鲜制备的
羽藻原生质中加入到人工海水并迅速混匀后,其细胞
器即开始逐渐下沉并逐步聚集,细胞器聚团以及其后
的细胞重建和发育过程明显温度依赖,20~30℃为最
佳温度,发生团聚需要2~3min,而15℃则需要1h以
上,40℃以上不能发生团聚。图1-A、B、C以及D 和
D-1分别为藓羽藻原生质中加入人工海水后20℃培养
3和30min、1和3h细胞重建情况。3min以内细胞
器明显聚集,而30min以内变圆形成致密细胞器聚集
微球,1h表面形成光滑外被膜,细胞开始变大,形成大
的液泡结构,细胞器逐渐分布在细胞的周边部位(见图
1-D-1)。显微镜下能够看到细胞器聚集过程中细胞器
表面以及聚集体表面有高折光凝胶样物质,而原生质
聚集体、细胞器以及培养器皿之间有类似的索状结构
连接(箭头),连续过程的观察提示细胞器是在这些高
折光索状结构的“牵引”作用下聚集,聚集体内细胞器
做蜗旋运动并逐渐收缩变圆(见图2)。从细胞的有序
性考虑,羽藻细胞内部是高度有序的结构,人工条件下
的原生质制备以及加入到海水的过程破坏了原来的有
序体系,细胞重建过程实际上是由这种无序体系转变
成具有细胞膜以及特定细胞器布局的正常细胞的有序
结构。而细胞骨架是细胞内的结构与时空有序性的维
系者与缔造者,是细胞器运动的动力以及结构基
础[12-13]。利用细胞骨架的解聚剂干扰正常细胞骨架的
转变过程,对微丝、微管等细胞骨架系统在多核绿藻藓
羽藻细胞重建的细胞器聚集、变圆、细胞膜以及细胞内
有序结构形成过程中的作用进行了研究。
(图A、B、C及 D分别为藓羽藻原生质中加入人工海水后培养3和
30min、1和3h时细胞重建情况,D-1为图 D方框部分放大。Bar=50
μm。Figs.A,B,C and D show the cel reconstruction states 3min,30
min,1hand 3hafterthe cytoplasmic contentsof BryopsisHypnoidesad-
dedto artificial seawaterrespectively.Fig D-1is close-up photo for the
enclosed area in Fig D.Bar=50μm.)
图1 藓羽藻细胞重建过程
Fig.1 Cel reconstruction of Bryopsis hypnoides
  图3为微丝解聚剂细胞松弛素B对细胞重建的影
响情况。图3-A、B和C分别为2、4和10mg/mL细胞
松弛素B各10μL加入到90μL新鲜制备的原生质后
混合孵育5min再加入人工海水中进行细胞重建的各
个阶段的发育情况。即各组中直接处理原生质的细胞
松弛素B的实际浓度分别为0.2、0.4和1mg/mL。非
常有意思也出乎作者意料的是细胞松弛素B处理不但
没有抑制细胞器的聚集,其高浓度处理反而显著促进
了藓羽藻细胞器的聚集过程(见图3-C-1),这说明原
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图2 显微镜连续观察聚集过程中细胞器及其聚集体以凝胶状纤维为纽带(箭头所示)(Bar=50μm)
Fig.2 Organeles were connected by the gelatinous fibers during their aggregation(Bar=50μm)
((图A、B和C分别为含有浓度为0.2、0.4和1mg/mL细胞松弛素B的细胞质加入到人工海水后细胞重建过程。Bar=50μm。Figs.A,B,and C
show the cel reconstruction process after the cytochalasin B containedcytoplasmic contents of BryopsisHypnoidesaddedto artificial sea water.The con-
centrations of cytochalasin B used in A,B and C were 0.2,0.4and 1mg/mL,correspondingly.Bar=50μm.)
图3 细胞松弛素B对藓羽藻细胞重建过程的影响
Fig.3 Influences of cytochalasin B on the cel construction process of Bryopsis hypnoides
有细胞有序结构的打破可能是细胞器之间有效聚集的
前提条件。细胞松弛素B处理也没有影响细胞器聚集
体的变圆过程,然而0.2、0.4和1mg/mL都显著抑制
了液泡的形成(见图1-D,由图1-D-1,图3),而高浓度
处理使这些细胞聚集体不断融合(见图3-C4、-C5),形
成巨大的细胞器聚集球体结构,重建细胞大小统计的
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12期 毛玉峰,等:微丝解聚剂及微管阻断剂对藓羽藻细胞重建过程的影响
结果显示细胞松弛素B处理使较大直径细胞器聚集体
(细胞)比例明显增高(见图4)。
图4 细胞松弛素B对重建羽藻细胞尺度(直径)分布的影响
Fig.4 Effects of Cytochalasin B on the size distribution of
reconstructed cels of Bryopsis hypnoides
  Klotchkova等[6]认为细胞重建过程中的细胞膜来
自与原细胞中的膜性小泡,在形成聚集体后这些膜性
小泡以类似于动物细胞膜损伤修复的方式从细胞内转
移到细胞表面形成细胞膜[15]。细胞微丝系统的重新构
建可能是这些膜性小泡的定向转移而形成细胞膜的基
础,细胞松弛素B抑制了细胞膜的形成,细胞器获得正
常的细胞内环境,抑制了细胞内有序性诸如液泡形成
等过程的进行,而这些细胞聚集体也更容易融合,从而
使其不断变大。
图5为微管形成抑制剂秋水仙素对细胞重建的影
响情况。图5-A、-B、-C、-D分别是180μL的1、0.1、
0.01mg/mL人工海水秋水仙素溶液和普通人工海水
加入20μL原生质混匀后,15℃培养1h(-1)、4h(-2)、
8h(-3)细胞的发育情况。各浓度秋水仙素均没有显著
抑制细胞器的聚集过程,这说明细胞器聚集及其聚集
体的收缩的动力并非来此于细胞骨架体系参与的动力
体系。较高浓度的秋水仙素对细胞器聚集体的后继发
育有显著的毒害作用,1和0.1mg/mL秋水仙素处理
(图A、B、C和D分别为羽藻原生质加入含1、0.1、0.01mg/mL秋水仙素人工海水溶液和人工海水后,重建细胞1h(-1)、4h(-2)和8h(-3)的细胞发
育情况。Bar=50μm。Figs.A,B,C and D show the cel reconstruction and development states 1h(-1),4h(-2)and 8h(-3)after the cytoplasmic
contents of BryopsisHypnoidesaddedto the colchicine contained artificial sea water.The concentrations of colchicine used in A,B,C and D were 1,0.
1,0.01and 0mg/mL,respectively.Bar=50μm.)
图5 秋水仙素对藓羽藻细胞重建的影响
Fig.5 Effects of colchicines on the cel reconstruction of Bryopsishypnoides
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使细胞器聚集体收缩变圆后停止发育,在8h内大部分
解聚,这也提示微管系统在细胞器聚集体早期的发育
中扮演相对更为重要的角色。
3 结语
本论文对微丝解聚剂细胞松弛素B以及微管阻断
剂秋水仙素对藓羽藻细胞重建过程的影响进行了研
究。结果显示细胞器聚集以及聚集体变圆的动力不是
来自于胞骨架系统;原始微丝体系的解聚是细胞器高
效聚集的基本条件;细胞松弛素B以及秋水仙素都显
著抑制细胞膜的形成以及细胞内组分有序性重建等后
继发育过程。
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12期 毛玉峰,等:微丝解聚剂及微管阻断剂对藓羽藻细胞重建过程的影响
Efects of Actin Cytoskeleton Depolymerize Reagent
and Microtubule Disrupt Reagent on Cel Reconstruction of Bryopsis hypnoides
MAO Yu-Feng,LIU Yu-Jiao,ZHANG Zhen,DONG Wen
(Colege of Marine Life Sciences,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)
Abstract: When some coenocytic algae were cut and the cytoplasmic contents squeezed out of the cel and
into artificial sea water,the organeles begin to aggregate,and the contents of the cytoplasm are recon-
structed,with a new cel membrane and wal formed for some of the cel.Under optimal conditions,40%
of these newly formed cels can develop into mature algal thali.Cytoskeleton maintains and reorganizes
the celular architecture and mediates cel motility.Many of these processes require the dynamic behavior
of the cytoskeleton which involves in the polymerization and depolymerization.In the present study,the
effects of actin cytoskeleton depolymerize reagent cytochalasin B and microtubule disrupt reagent colchicine
on the cel reconstruction of Bryopsis hypnoides have been studied.The results show that the motility of
organeles during their aggregation were not driven by cytoskeleton system,and depolymerization of the
original actin filaments was needed for efficient organeles aggregation;Cytochalasin B and colchicine sig-
nificantly inhibited the formation of cel membrane and reorganize of cel components,suggesting that cy-
toskeleton play an important role in those processes.
Key words: cel reconstruction;cytoskeleton;cytochalasin B;colchicine;Bryopsis hypnoides
责任编辑 朱宝象
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