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doi:10． 15889 / j． issn． 1002 － 1302． 2016． 01． 100
Pb2 + 对淡水硅藻谷皮菱形藻(Nitzschia palea)
生长的影响
易婷婷，支崇远，李培林，杨雨嘉，帅春燕
(贵州师范大学生命科学学院，贵州贵阳 550001)
摘要:通过在自制培养基中加入不同浓度的 Pb2 +，研究水环境中重金属 Pb2 +污染对谷皮菱形藻生长和叶绿素 a
含量的影响，并在光学显微镜下观察细胞形态变化，研究该藻对铅离子(Pb2 +)的耐受性。试验结果表明，谷皮菱形藻
对 Pb2 +的耐受性较强。Pb2 +浓度低于 5 mg /L，促进其生长;Pb2 +浓度为 10 mg /L时，对其无明显影响;Pb2 +浓度大于
50 mg /L时，明显抑制其生长，且藻细胞出现异常现象;96 h EC50值为 27． 26 mg /L。Pb
2 +浓度小于 10 mg /L时，藻叶绿
素 a含量均较高，与正常生长情况相似;Pb2 +浓度大于 50 mg /L时，叶绿素 a含量明显降低。Pb2 +浓度较低时，藻细胞
体形态正常，且运动能力很强，Pb2 +浓度大于 50 mg /L时，藻细胞体出现畸形，颜色加深，两端由圆形变成方形，且运动
能力很弱。
关键词:淡水硅藻;谷皮菱形藻(Nitzschia palea);Pb2 +;形态;生长
中图分类号:Q945． 78 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2016)01 － 0340 － 04
收稿日期:2015 － 07 － 15
基金项目:国家自然科学基金(编号:41062005);贵州省国际科技合
作项目［编号:(2012)800107］。
作者简介:易婷婷(1989—)，女，安徽宣城人，硕士研究生，研究爱方
向为现代生物技术应用。E － mail:136659358@ qq． com。
通信作者:支崇远，博士，教授，主要从事硅藻生理生态方面的研究。
E － mail:zhicy@ 163． com。
硅藻是单细胞藻类，作为水体中重要的初级生产者，在地
球上已存在 1． 65 亿年，对整个海洋初级生产力的贡献高达
40%［1］，与水生动物相比，硅藻具有生长周期短、易于分离培
养和可以直接观察细胞水平上的中毒症状等优点，对重金属
胁迫更加敏感，因此，是较为理想的实验材料［2］。菱形藻是
底栖硅藻的一种，因含有丰富的营养物质，可以作为鲍、海胆、
海参等名贵经济动物的饵料，另外菱形藻属也是环境污染检
测指示种［3 － 5］。
重金属污染不仅抑制藻类的生长速率，而且会使其形态
发生畸变，因而硅藻种群或群落中畸形细胞的数量可以作为
重金属污染程度的定量指标［6］。硅藻细胞形态异常在生物
监测中是一种很有前途的重金属污染物指示工具［7］。在环
境监测中，常将叶绿素 a 含量作为湖泊富营养化的指标之
一［8］。铅是一种不能降解且广泛存在的重金属污染物，铅盐
少部分是溶解于水的，大部分是微溶或不溶于水的［9］。在自
然水体中，铅的含量一般为 20 μg /L，但污染严重的地区水体
含量高达 400 μg /L。目前 EPA 和 WHO 水体铅浓度标准分
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别为 0． 05 mg /L和 10 μg /L。《水和废水监测分析方法》(第
四版)中指出，铅对水生生物的安全浓度为 0． 16 mg /L。然
而，由于工厂随意排放铅废水及释放含铅废气，不仅影响水质
和溪流中的水生生物［10］，还导致血铅儿童等污染事件频频发
生［11］。铅对植物的影响主要是破坏水生植物细胞的叶绿素、
线粒体和细胞核结构，使得叶绿素和维生素 C 含量减少，降
低了硝酸还原酶活性和脱氢还原酶活性，从而阻碍了植物的
新陈代谢和光合作用，最终导致正常生长植物数量受到
影响［11］。
单一重金属对微藻生长繁殖的影响，国内外都进行了大
量工作。对于铅对微藻的毒性影响研究，国外文献主要报道
采用微藻吸附水体中铅从而达到净化水质效果［12 － 13］。硅藻
是当前研究的热点之一，国内偏重于海洋硅藻的研究，对淡水
硅藻的毒性研究也逐步展开［14］，主要是从硅藻的生长速率、
细胞分化速率以及胞内植物螯合肽等 3 个方面进行探讨［6］。
随着环境污染程度的不同，硅藻会呈现不同的形态畸形，并且
影响研究者鉴定其属种。
本研究以谷皮菱形藻(Nitzschia palea)为材料，研究 Pb2 +
毒害对谷皮菱形藻生长和叶绿素 a含量的影响。用光学显微
镜观察细胞形态变化，评价不同 Pb2 +浓度对谷皮菱形藻的影
响以及谷皮菱形藻细胞对 Pb2 + 的耐受性，以期为探讨水体
Pb2 +污染对硅藻毒害的机理及其耐受机制积累科学依据。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
本试验所选用的硅藻谷皮菱形藻(Nitzschia palea)采集
于贵州省贵阳市花溪湿地公园的溪流中，应用微藻微吸管分
离方法分离，在自制培养基中纯化后保种培养。经扩大培养
后得到菱形藻纯种，并获得足够的藻液进行试验。当藻细胞
浓度达到 6 万 ～ 10 万个 /mL 时加入 Pb(NO3)2，使得培养基
中 Pb2 +浓度依次为 0． 5、1、5、10、50、80 mg /L 以及不加 Pb2 +
的对照组。每个浓度设置 3 个平行试验。
1． 2 培养条件
试验所用的培养基及所有器皿均经过 121 ℃高压灭菌
20 min，试验在无菌条件下进行，试验藻种均用自制培养基培
养至对数生长期备用。自制培养基各成分质量浓度为 NH4Cl
15 mg /L，MgCl2 · 6H2O 12 mg /L，CaCl2 · 2H2O 18 mg /L，
MgSO4·7H2O 15 mg /L，KH2PO4 1． 6 mg /L，NaHCO3 50 mg /L，
FeCl3·6H2O 80 μg /L，Na2EDTA·2H2O 100 μg /L，H3BO3
185 μg /L，MnCl2·4H2O 415 μg /L，ZnCl2 3 μg /L，CoCl2·
6H2O 1．5 μg /L，CuCl2·2H2O 0．01 μg /L，Na2MoO4·2H2O 7 μg /L，
维生素 B12 0． 5 μg /L，维生素 B1 0． 1 mg /L，维生素 H 0． 5 μg /L。
每 1 000 mL培养液加土壤浸出液 50 mL，调节 pH 值至 8． 0
左右。
培养温度为 20 ℃，光照度为 1 800 lx，光暗周期为 12 h －
12 h，静水培养，硅藻在对数生长期反复接种 3 次后混合所有
藻液，摇匀，重新分瓶后，开始下一步试验。
1． 3 生物量测定
显微镜下用血球计数板进行藻细胞计数，测定藻细胞的
浓度(个 /mL)。
通过计算硅藻暴露在不同浓度铅下的抑制率，采用回归
曲线拟合，计算抑制率为 50%时的铅浓度，记为 EC50。特定
生长率(U)按以下公式计算:
U =(lnNt － lnN0)/(t － t0)。
式中:N0、Nt 分别为开始期(t0)和 t时刻(t)的细胞数。
抑制率 I =(UCK － Utox)/UCK × 100% 。
式中:UCK为对照组的生长速度;Utox为有供试化合物时的生长
速度。
采用 Origin 8． 0 软件对试验数据进行作图。
1． 4 叶绿素 a含量测定
谷皮菱形藻藻株在不同 Pb2 +浓度的培养基中培养至第 9
天，取 10 mL藻液于10 mL离心管中，3 000 r /min离心10 min，弃
去上清液后，加入 10 mL 95%丙酮，置于4 ℃冰箱里静置24 h，然
后 3 000 r /min离心 10 min，取上清液后，用可见分光光度计
在 663 nm 和 645 nm 处测其吸光度，用 95%丙酮调零。按
Aron的公式计算提取液的叶绿素 a浓度。
Chl a = 12． 7D663 nm － 2． 69D645 nm
［15］。
1． 5 谷皮菱形藻活细胞的形态观察
取少量不同 Pb2 +浓度下 96 h的藻液，在光学显微镜下观
察其形态，并拍照。
2 结果与分析
2． 1 不同质量浓度的 Pb2 +对谷皮菱形藻生长的影响
由图 1 可见，当 Pb2 +浓度小于 5 mg /L 时，Pb2 +对谷皮菱
形藻的生长有一定的促进作用，藻细胞生长呈上升趋势;当
Pb2 +浓度大于 50 mg /L时，与对照组相比，谷皮菱形藻的生长
受到明显抑制。
在培养的前 72 h，当 Pb2 +浓度为 1 mg /L时，与空白对照
组的生长情况无明显差异，培养至 96 h 时，能够促进谷皮菱
形藻的生长，且明显超过了对照组。Pb2 +浓度为 0． 05 mg /L
时，24 h 时的抑制率为 31． 14%，而在之后，起着促进生长作
用。其他试验组中，24 h 时的抑制率均较高，之后均大幅度
降低。使用回归曲线模拟，计算得出 96 h EC50 值为
27． 26 mg /L。
2． 2 不同质量浓度的 Pb2 + 对谷皮菱形藻叶绿素 a 含量的
影响
由图 2 可见，不同质量浓度的 Pb2 +对谷皮菱形藻叶绿素
a含量的影响不同，当 Pb2 +浓度小于 10 mg /L时，叶绿素 a 含
量高于对照组中叶绿素 a 含量;Pb2 +浓度为 1 mg /L 时，叶绿
素 a含量达到最大值;当 Pb2 +浓度大于 50 mg /L时，叶绿素 a
含量明显降低。试验结果表明，Pb2 +浓度小于 10 mg /L时，有
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利于谷皮菱形藻叶绿素 a含量的积累。
2． 3 不同质量浓度的 Pb2 +对谷皮菱形藻形态的影响
用肉眼可直接观察出谷皮菱形藻在不同 Pb2 +浓度培养
基中的生长情况。Pb2 +浓度较低时，谷皮菱形藻生长旺盛，藻
液颜色正常，呈黄褐色，且附着在培养瓶底部，随着 Pb2 +浓度
增加，藻液颜色均变浅，且出现浑浊现象。
对照组和不同浓度 Pb2 +培养基中谷皮菱形藻活细胞见图
3。从光学显微镜中观察到，在低于 10 mg /L Pb2 +浓度中的谷
皮菱形藻细胞(图 3 － a 至图 3 － e)生长正常，颜色较鲜，叶绿
体分布均匀，且容易分辨，细胞形态上与对照组无明显差异，游
动很快;而在高浓度 Pb2 +(＞50 mg /L)的培养基中(图3 － f、图
3 － g)，细胞发生畸变，活细胞体颜色加深，藻细胞末端位置形
状由圆形变成方形，几乎没有游动，有轻微的振颤运动，与对
照组相比，形态呈明显差异。随着 Pb2 +浓度增加，藻细胞死
亡及残骸数量也增多，即使是正常的细胞，其颜色也很淡。
3 讨论与结论
重金属对水环境造成的污染已经引起人们的日益关注。
在工业时代，尤其是将铅添加到车辆的汽油燃料中，导致水生
态系统中的铅含量大大增加［16］。
本研究表明，不同质量浓度 Pb2 +对菱形藻的生长影响不
同。Pb2 +浓度低于 5 mg /L，促进其生长;Pb2 +浓度为 10 mg /L
时，对其无明显影响;Pb2 +浓度大于 50 mg /L 时，对菱形藻的
抑制作用明显，藻液颜色变为淡黄色，藻细胞体出现畸变，这
与周长芳等、李勇勇等的研究结果［17 － 18］相近。周长芳等研究
铅污染对钝顶螺旋藻生长的影响，发现当 Pb2 + 浓度高于
20 mg /L 时，钝顶螺旋藻生长受抑制，藻细胞随着浓度的升高
和时间的延长而黄化死亡［17］。有报道表明，铅会抑制硅藻的
细胞分化速率，当其达到一定浓度(4． 8 × 10 －7 mol /L)时，中
内骨条藻的细胞分化速率几近为 0［19］。铅还能使小环藻
(Cyclotella sp．)细胞形态发生变化，使其叶绿体相对体积
减小［20］。
硅藻的生长取决于多种环境因素，包括微量金属元素。
而过量的重金属，则会引起藻细胞功能障碍，降低其生长量，
并可能最终导致其死亡。为了生存，硅藻会启动防御机制，如
产生抗氧化剂或金属螯合剂，从而克服重金属胁迫［21］。
本研究中，谷皮菱形藻 96 h EC50值为 27． 26 mg /L，根据
《水与废水监测分析方法 第四版》中藻类生长抑制毒性评
价的分级标准，属于中毒级别。李勇勇等研究了铅离子对 2
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株螺旋藻生长的影响，96 h EC50值分别为 61． 66、72． 44 mg /L
［18］。
温军杰等报道的 Pb2 +对螺旋藻的 72 h EC50值为 11． 46 mg /L，
Pb2 +对湛江叉鞭金藻、小球藻的 96 h EC50值分别为 9． 03、
20 mg /L［22］。从 Pb2 +对谷皮菱形藻生长及前人研究的 Pb2 +对
其他藻类生长的影响结果比较看，该藻具有一定的 Pb2 + 耐
受性。
研究指出，铅对普通小球藻和原壳小球藻的叶绿素 a 具
有剂量抑制效应［3］。这个结果也可从本试验中得出。邱昌
恩等研究也表明，Pb2 + 可抑制绿球藻叶绿素 a 的合成［23］。
Yan等研究发现，铅之所以能抑制叶绿素 a 合成，是因为铅破
坏了植物吸收必需元素如 Mg 和 Fe，甚至加速叶绿素 a 分
解［24］。因此，本试验中，低浓度铅对谷皮菱形藻叶绿素 a 合
成具有促进作用，高浓度铅则抑制其合成，可能是由于低浓度
铅促进了谷皮菱形藻吸收必需元素，而过量的铅则抑制其吸
收必需元素或者分解叶绿素 a的缘故。
用光学显微镜观察谷皮菱形藻活细胞在高浓度铅胁迫下
的结果，与对照组比较，藻细胞出现畸变，颜色加深，运动能力
明显减弱。资料表明，高浓度的铅可使亚心形扁藻丧失运动
能力，最终导致鞭毛变形或者脱落。部分研究发现，藻类显示
了对较高浓度铅离子的忍耐力，可能是由于铅离子容易从细
胞壁排出或是高浓度的铅易于从溶液中沉淀所致［25］。通过
光学显微镜观察到硅藻细胞的畸变情况，一些类群更容易在
环境胁迫中受到影响而致变形。例如，舟形藻科的细胞会表
现出延长细胞形态，而脆杆藻科的硅藻细胞膜则是扭曲的。
重金属被认为是引起硅藻细胞表面畸形的重要因素。有试验
证明，在高浓度镉暴露中，高达 3%的硅藻细胞膜发生了变
化，无污染的对照组中，硅藻畸形瓣膜的数量少于 1%［26］。
本试验首次对谷皮菱形藻进行重金属 Pb2 +胁迫研究，分
析藻细胞的生长情况，得出 96 h EC50值，以了解 Pb
2 +对谷皮
菱形藻的生长影响及谷皮菱形藻的铅耐受范围，为 Pb2 +污染
对淡水底栖硅藻的影响及解析耐受机理积累研究基础。另
外，本研究提供了在不同 Pb2 + 浓度下生长的谷皮菱形藻图
片，以期对野外样品中畸形硅藻的鉴定提供参考依据。
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