全 文 ：收稿日期：2010 - 04 - 20 录用日期：2010 - 06 - 21
基金项目：国家科技重大专项资助 （No. 2008ZX08526-003）；江苏省省级环保科技项目 （No. 2008005）；江苏省环境监测科研基
金项目 （No. 0809）
作者简介：冯政 （1983—），男，硕士研究生；* 通讯作者 （Corresponding author），E-mail : hongxiayu01@yahoo.com.cn
全氟辛酸对斜生栅藻细胞膜特性影响研究
冯政 1，郑新梅 1，刘红玲 1，龚伊 2，于洋 2，于红霞 1，*
1. 南京大学环境学院 污染控制与资源化研究国家重点实验室，南京 210093
2. 中国科学院南京地理与湖泊研究所，南京 210008
摘要：斜生栅藻暴露于全氟辛酸（PFOA）中，其细胞膜特性可通过不同荧光染料染色的荧光信号变化来反映 . 应用流
式细胞仪检测荧光信号，研究了 PFOA 对斜生栅藻细胞膜的完整性、选择透过性和膜电位指标的影响效应 . 实验结果
显示，全氟辛酸对表征细胞膜完整性的碘化丙啶（PI）染料荧光强度起到显著刺激作用，栅藻细胞膜受损几率随暴露
浓度升高呈现上升趋势；低暴露浓度下栅藻细胞膜选择透过性增强，但在高浓度暴露下这一细胞膜特性受到明显抑
制，具体表现为表征酯酶活性的二乙酸荧光素（FDA）荧光强度出现先升后降的变化；与 FDA 荧光强度变化趋势相
反，反映膜电位的碘代 3,3’-二己氧基羰花青（DIOC6（3））荧光强度则先降后升，预示高浓度 PFOA 暴露将导致细胞
膜处于异常的生理状态 .
关键词：全氟辛酸；斜生栅藻；流式细胞术；细胞膜
文章编号：1673 - 5897（2010）4 - 537 - 06 中图分类号：TQ086 文献标识码：A
Effect of Perfluorooctane Acid on Cell Membrane Properties of
Scenedesmus obliquus
FENG Zheng1，ZHENG Xin-mei1，LIU Hong-ling1，GONG Yi2，YU Yang2，YU Hong-xia1，*
1 . State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse , School of the Environment , Nanjing University , Nanjing 210093
2. Nanjing Institute of Geography and Limnology, Chinese Academy of Science , Nanjing 210008
Received 20 April 2010 accepted 21 June 2010
Abstract：Flow cytometry has been applied to detect fluorescence changes of Scenedesmus obliquus which were exposed
to perfluorooctanoic acid. These fluorescence changes have been used to assess the completeness of cell membrane,
permeability and membrane potential. The results show that PFOA stimulated a sharp increase of Propidium Iodide（PI）,
which indicated that the damage rate of membrane appeared to rise as the concentration of PFOA increased; Membrane
permeability enhanced at low dosage and inhibited at high dose, which showed the intensity of Fluorescein diacetage（FDA）
raised at first and then fell down; Contrary to FDA’s trend, intensity of Iodide 3,3’-2 hexyloxy carbonyl cyanine（DIOC6
（3））went down firstly, and then increased to a high level, which meant cell membrane’s functions were disturbed due to
PFOA contact.
Keywords：perfluorooctanoic acid；Scenedesmus obliquus；flow cytometry；cell membrane
2010 年 第 5 卷
第 4 期，537-542
生 态 毒 理 学 报
Asian Journal of Ecotoxicology
Vol. 5, 2010
No. 4, 537-542
生 态 毒 理 学 报 第 5 卷
1 引言（Introduction）
全氟化合物（Perfluorinated Compounds, PFCs）
中的全氟辛酸（Perfluorooctanoic Acid, PFOA）因具
有存在地域广泛、分布介质多样、疏水疏脂、易与
血浆蛋白结合并在高等动物体内积聚等特性
（Jones et al . , 2003; Lien et al . , 2008; Loos et al . ,
2007; Pistocchi et al . , 2009）而成为当前倍受关注
的持久性有机污染物（Persistent Organic Pollutants,
POPS）之一 . 一项近期的综合调查表明，欧洲莱茵
河及其主要支流水体中 PFOA 浓度均低于 100ng·
L-1（其中以鲁尔河中检测到浓度最高（94ng·L-1）），
进一步的研究发现莱茵-鲁尔区采集的饮用水水样
PFOA 浓度高达 519ng·L -1（其污染水平可能主要
受工业点源排放影响）（Skutlarek et al . , 2006）.
PFOA 在 日 本 地 表 水 检 出 浓 度 区 间 为 0.1 ~
67000ng·L -1，同时进行的大气检测显示全氟辛酸
浓度处于 71.9~919pg·m-3浓度范围（Nakayama et
al . , 2005）. 采用固相萃取及液相色谱-质谱联用技
术对取自美国东南部田纳西河饮用水进行分析，
检测得到的水样 PFOA 污染水平低于 25ng·L -1
（Hansen et al. , 2002）. PFOA 在我国两座市政污水
处理厂处理全过程污水及污泥中均有检出，深入
的研究发现其浓度水平在采用较短污泥停留时间
的活性污泥法工艺处理前后仍保持恒定（Yu et
al . , 2009），说明 PFOA 稳定的理化性质使其难以
被传统的水处理工艺去除，进而不能排除 PFOA 对
人工及自然水体存在的潜在健康风险 .
研究 PFOA 在生物体内的分布同样有着十分
重要的现实意义，已有许多关于鸟类卵、哺乳动物
体内、人体肝脏组织及乳汁中 PFOA 浓度的报道
（Dietz et al . , 2008; Wang et al . , 2008），而基于
PFOA 对哺乳动物、鸟类、鱼类（及其胚胎）、原生动
物等各营养级生物的急慢性毒性研究也在不断深
入 . 大鼠短期暴露于高剂量 PFOA 将引起循环嗜
中性粒细胞数目的异常变化，强化巨噬细胞对脂
多糖的炎性效应（Qazi et al. , 2009）；通过使用微
阵列技术，暴露于低剂量 PFOA（0.1、0.5 或 5mg·
mL-1）雏鸡（六周）肝脏基因的表达均出现异常，在
4 周暴露周期，超过 290 和 320 个肝脏基因在
PFOA 作用下表达受到严重影响（Yeung et al. ,
2007）；对斑马鱼胚胎（Zebra fish embryos）致毒效
应研究发现，PFOA 的 48h -LC50 为 1005mg·L -1、
96h-LC50为 499mg·L-1，且脊柱畸形和 96h 孵化分
别为 PFOA的最敏感毒理学终点（叶露等 , 2009）；
PFOA 对多刺裸腹蚤（Moina macrocopa） 的 24h -
LC50和 48h-LC50分别为 348.76mg·L-1 和199.51mg·
L -1，对大型蚤（Daphnia magna）24h -LC50 和 48h -
LC50 分别为 675.05mg·L -1 和 476.52mg·L -1（Ji et
al., 2008）.
值得注意的是，现有关于 PFOA 生物急慢性毒
性研究中与浮游植物相关的文献报道还十分有限 .
浮游植物是水体生态系统生物链中至关重要的一
环，研究 PFOA 对水体中典型浮游植物生物毒性效
应具有极为重要的理论研究价值和现实应用意义 .
藻类暴露于 PFOA 中，其细胞膜特性可通过不同荧
光染料染色的荧光信号变化来反映 . 本文应用流
式细胞仪检测了 PFOA 引起的碘化丙啶（PI）、二乙
酸荧光素（FDA） 和碘代 3,3’-二己氧基羰花青
（DIOC6（3））3 种染料荧光指标在 24h 和 48h 的变
化，进而研究了浮游植物中的指示生物斜生栅藻
（Scenedesmus obliquus）在不同浓度 PFOA 暴露过程
中细胞膜完整性、细胞膜选择透过性和膜电位特
性的变化，一方面补充了 PFOA 对浮游藻类的毒性
数据，另一方面为评价此种新型持久性有机污染
物潜在的生物健康风险提供理论依据 .
2 材料与方法（Material and methods）
2.1 主要试剂
全氟辛酸（PFOA, Alfa 公司 , 美国），纯度高于
95%，白色晶体，使用二甲基亚砜和人工稀释水配
制成预设浓度储备液 . 二甲基亚砜（DMSO, TEDIA
公司 , 美国），色谱纯，透明液体，全氟辛酸储备液
助溶剂（实验用人工稀释水溶液中 DMSO 浓度小
于 0.5‰）. 碘化丙啶（PI, Sigma 公司 , 美国），重蒸
馏水稀释到 100μmol·L-1，4℃保存 . 二乙酸荧光素
（FDA, Sigma 公司, 美国），丙酮稀释到 1mmol·L-1，
-18℃保存 . 碘代 3,3’-二己氧基羰花青（DiOC6
（3）, Sigma 公司 , 美国），重蒸馏水稀释到 10μmol·
L-1，4℃保存 .
分析纯硝酸钠、磷酸氢二钠、氯化钙、碳酸钠、
硫酸镁、柠檬酸、柠檬酸铁铵等 .
2.2 实验生物及培养
斜生栅藻（Scenedesmus obliquus）取自中国科学
院南京地理与湖泊研究所，采用 BG-11 培养基培
538
冯政等：全氟辛酸对斜生栅藻细胞膜特性影响研究第 4 期
养 . BG-11 培养基及实验使用的容器均经灭菌锅
高温高压灭菌（120℃ , 15min），藻液转接过程在超
净台完成，培养在 250mL 三角瓶中 . 培养温度
（25±1）℃，光暗比 12:12，光照强度≤（1500±500）
lux，静置培养，每天早晚定时振荡一次 .
显微镜下观察栅藻形态并使用细胞计数板计
数，待栅藻生长良好并进入对数生长期，即开始目
标化合物暴露实验 .
2.3 静态暴露实验
静态暴露实验共设置 1 个参照组（0.5‰
DMSO）和 5 个质量浓度梯度组（80、160、240、320、
400mg·L-1），每组 3 个平行 . 在超净台无菌环境中
将经过镜检处于对数生长期的藻液转入配制好的
含有 PFOA 的 BG-11 培养基中，使初始藻细胞密
度达到 2×105cell·mL -1. 暴露 24h 和 48h，无菌条件
下分别取参照和各浓度组均匀藻液，过 300 目尼龙
筛网 . 在对应编号的流式管中各加入 1mL 滤后藻
液，并依据不同测定指标分别加入细胞膜完整性
指标 PI 染料、细胞膜选择透过性指标 FDA 与膜电
位指标 DIOC6（3） 染料，3 种染料加入量分别为
100、25 和 15μL·mL -1，对应的暗室恒温温育时间
15、8 和 15min . 经过温育后的藻液，立即进行流式
细胞仪各细胞膜指标的测定 .
2.4 流式细胞仪检测
实验采用 FACSVantage 型流式细胞仪（Becton
Dickinson 公司 , 美国）进行样品测定 . 流式细胞仪
第一激光为 Coherent 水冷氩离子激光器（激发波长
为 488nm），第二激光为 Coherent 染料激光器（激发
波长为 600nm），检测通道波长为 660/20nm（FL-4，
藻蓝素荧光）. PI 采用 FL-2 通道（560~590nm, PI
荧光） 进行检测，而 FDA 和膜电位均采用 FL -1
（530/30nm）通道 . 非藻类颗粒或聚集细胞可以通
过自发荧光（FL3/FL4）的差异去除 . 样品的分析流
速为 1μL·s-1，单样收集 5000 个细胞（选取 5000 个
细胞均值），双组分绝对计数小球保证实验精度 .
2.5 数据处理
通过流式细胞仪测量得到的实验数据，折算成
荧光强度百分比进行表示，作为实验结果讨论的
最终依据 . 细胞膜完整性指标 PI%=实验组 PI 荧
光强度均值/参照组 PI 荧光强度均值；细胞膜选择
透过性指标 FDA%=实验组 FDA 荧光强度均值/参
照组 FDA 荧光强度均值；膜电位指标 DIOC6（3）%
=实验组 DIOC6（3）荧光强度均值/参照组 DIOC6
（3）荧光强度均值 .
采用 SPSS 16.0 数据分析软件，进行单因素组
间显著性差异分析，比较实验浓度组与参照组的
荧光强度是否存在显著性差异（所有分析中显著
性水平 p=0.05）.
3 结果与分析（Results and analysis）
3.1 细胞膜完整性指标
细胞膜完整性是衡量细胞活力的一项重要指
标 . 对于完整性良好的细胞膜来说，PI 染料分子难
以通过，进而无法染色细胞内的核酸类物质（引起
荧光强度的升高）. 因此，可以利用 FCM 检测得到
的 PI 荧光强度反映实验生物在毒性物质暴露条件
下细胞膜完整性的变化，即细胞膜的受损程度与
PI 荧光强度之间存在显著的正相关性 . 实验组占
参照组 PI 荧光强度的百分比越高，说明细胞膜受
损的程度越严重 .
PI 荧光强度随 PFOA 浓度增加而呈现的强度-
浓度关系如图 1 所示 . 暴露 24h 后，低浓度（80、
160 和 240mg·L-1）组荧光强度与参照组差异很小
（PI%对应为 92%、98%和 89%），而高浓度（320 和
400mg·L-1）组荧光强度与参照组之间存在显著性
差异（p <0.05），PI%分别增至参照组的 466%和
554%；48h 暴露 PI 荧光强度显示与 24h 相似的变
化规律，320 和 400mg·L -1 组 PI%分别增至参照组
的 300%和 307%. 这些研究结果表明，当 PFOA 浓
度低于 240mg·L -1，细胞膜受损程度不显著；当浓
度高于 320mg·L -1 时，细胞膜受损程度显著，并且
呈现出随 PFOA 浓度升高膜受损程度增大的趋势 .
细胞膜完整性对于细胞生理代谢过程的正常进行
有着十分重要的意义，一旦细胞膜受损，胞外有毒
物质将进入细胞内导致酯酶活性等代谢指标变
化，甚至造成细胞器功能的严重损害 .
3.2 细胞膜选择透过性指标
酯酶活性为流式细胞仪检测中敏感的毒理学
指标，可用来评价细胞膜选择透过性的改变 . FDA
染料能够透过细胞膜而被酯酶转化，当细胞膜的
选择透过性被削弱时，由于胞外物质通过细胞膜
的几率增加，胞内酯酶活性将发生变化 . 结合细胞
539
生 态 毒 理 学 报 第 5 卷
PFOA 对斜生栅藻酯酶活性 FDA 荧光的影响
如图 2 所示，低暴露浓度（80、160 和 240mg·L-1）组
荧光强度与参照组差异较小，而高浓度 320 和
400mg·L-1下表现出明显的抑制作用 . 实验数据表
明，24h 暴露后，80~240mg·L-1浓度组 FDA 荧光强
度与参照组差异较小（分别为参照组的 108%、87%
和 64%），而 320 和 400mg·L-1浓度组 FDA%已分
别降至 12%和 34%，与参照组荧光强度之间存在
显著性差异（p<0.05）. 48h 暴露后，80~240mg·L -1
组 FDA 荧光强度与参照组之间仍未显示显著性差
异（FDA%分别为 135%、34%和 53%），而高浓度
320 和 400mg·L -1 暴露下，FDA%分别降至 21%和
12%，与参照组之间差异显著（p<0.05）. 通过观察
实验数据可以发现，斜生栅藻酯酶活性随 PFOA 暴
露浓度升高呈现的总体变化趋势是降低的，但
80mg·L -1 酯酶活性在 24h 和 48h 较参照组均有所
升高 . 这种现象同样出现在低浓度重金属对铜绿
微囊藻酯酶活性研究过程中（于洋等，2006），并推
测 80mg·L-1组酯酶活性的上升源于细胞在胞外毒
性物质胁迫下产生的应急代谢增强效应，属于细
胞自身的一种调节机制 . 这种调节机制是受到浓
度条件制约的，随着暴露浓度继续增加，细胞膜的
选择透过性逐渐降低，胞外 PFOA 更容易通过细胞
膜进而对栅藻细胞胞内代谢产生抑制作用，从而
导致反映胞内代谢状态的酯酶活性指标显著降低 .
3.3 细胞膜膜电位指标
除了细胞膜完整性和选择透过性外，细胞膜电
位的变化也是表征细胞生理状态的敏感探针 .
DIOC6（3）染料通过其亲水性基团作用于细胞的内
膜完整性 PI 染色结果，FDA 荧光强度在排除细胞
膜完整性受到破坏影响的前提下，能够直接反映
酯酶活性的高低 . FDA%数值越小，胞内酯酶活性
越低，细胞膜的选择透过性被削弱的越严重 .
540
冯政等：全氟辛酸对斜生栅藻细胞膜特性影响研究第 4 期
质网和线粒体产生可检测的染色荧光，染色荧光
强度的高低则代表膜电位指标的水平 . 细胞膜处
于正常生理状态时，能够附着在内质网和线粒体
膜表面的荧光染料十分有限，流式细胞仪能够检
测到的染料荧光强度处于较低水平 . 但当细胞膜
的生理状态发生改变、膜系统的功能出现紊乱，附
着于内质网和线粒体的染料增多，膜电位荧光强
度随之增加 .
暴露浓度低于 240mg·L -1 时，DIOC6（3）染料
荧光强度与参照组差异并不显著 （图 3），24h
DIOC6（3）%分别为 66%、32%和 33%，48h 暴露后
3 组荧光强度对应为 88%、44%和 46%；高暴露浓
度 320 和 400mg·L -1 下，DIOC6（3）%指标表现出
与参照组的显著性差异（p<0.05），24h 荧光强度增
至参照组的 252%和 564%，而 48h 的 DIOC6（3）%
数值增至 236%和 1143%. 膜电位荧光强度在高浓
度 PFOA 作用下剧增的现象，标志着斜生栅藻细胞
膜系统功能的紊乱和生理状态的异常 . 细胞膜生
理状态的异常，不仅预示当 PFOA 暴露浓度足够高
时栅藻细胞在细胞膜水平将受到损伤，同时意味
着水体中其它高毒性物质进入细胞内产生其它细
胞毒性的可能性增加 .
本研究以指示生物斜生栅藻为模型，模拟水体
环境中 PFOA 暴露对斜生栅藻细胞膜完整性、选择
透过性和生理状态特性的影响，讨论了 3 种特性
的改变对栅藻细胞膜潜在的危害，对处于同一营
养级水平（其它浮游植物等）以及不同营养级水平
的生物毒性研究均具有一定的借鉴作用 .
通讯作者简介：于红霞，南京大学环境学院教授、博士生
导师 . 主要从事环境化学与毒理方面的研究 . 现兼任中
国毒理学会分析毒理专业委员会委员和中国环境科学
学会持久性有机污染物专业委员会委员 .
References
Dietz R, Bossi , R, Riget , F F, Sonne C, Born E W. 2008.
Increasing perfluoroalkyl contaminants in east Greenland polar
bears（Ursus maritimus）: A new toxic threat to the Arctic bears
［J］. Environmental Science & Technology, 42（7）: 2701-2707
Hansen K J, Johnson H O, Eldridge J S, Butenhoff J L, Dick L
A. 2002 . Quantitative characterization of trace levels of PFOS
and PFOA in the Tennessee River［J］. Environmental Science &
Technology, 36（8）: 1681-1685
Ji K, Kim Y, Oh S, Ahn B, Jo H, Choi K. 2008 . Toxicity of
perfluorooctane sulfonic acid and perfluorooctanoic acid on
freshwater macroinvertebrates （Daphnia magna and Moina
macrocopa）and fish （Oryzias latipes）［J］. Environmental
Toxicology and Chemistry, 27（10）: 2159-2168
Jones P D, Hu W, De Coen W, Newsted J L, Giesy J P. 2003 .
Binding of Perfluorinated fatty acids to serum proteins［J］.
Environmental Toxicology and Chemistry, 22（11）: 2639-2649
Lien N P H, Fujii S, Tanaka S, Nozoe M, Tanaka H. 2008.
Contamination of perfluorooctane sulfonate （PFOS） and
perfluorooctanoate （PFOA）in surface water of the Yodo River
basin（Japan）［J］. Desalination, 226（1-3）: 338-347
Loos R, Wollgast J , Huber T, Hanke G. 2007. Polar herbicides ,
pharmaceutical products , perfluorooctanesulfonate （PFOS）,
perfluorooctanoate（PFOA）, and nonylphenol and its carboxylates
and ethoxylates in surface and tap waters around Lake Maggiore
in Northern Italy［J］. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 387
（4）: 1469-1478
Nakayama S, Harada K, Inoue K, Sasaki K, Seery B, Saito N,
Koizumi A. 2005. Distributions of perfluorooctanoic acid（PFOA）
and perfluorooctane sulfonate（PFOS）in Japan and their toxicities
541
生 态 毒 理 学 报 第 5 卷
［J］. Environmental Science & Technology, 12（6）: 293-313
Pistocchi A, Loos R. 2009. A map of European emissions and
concentrations of PFOS and PFOA［J］. Environmental Science &
Technology, 43（24）: 9237-9244
Qazi M R, Bogdanska J. 2009 . High -dose, short - term exposure
of mice to perfluorooctanesulfonate （PFOS）or perfluorooctanoate
（PFOA）affects the number of circulating neutrophils differently,
but enhances the inflammatory responses of macrophages to
lipopolysaccharide（LPS）in a similar fashion［J］. Toxicology, 262
（3）: 207-214
Skutlarek D, Exner M, Farber H. 2006. Perfluorinated surfactants
in surface and drinking water ［J］. Environmental Science and
Pollution Research, 13（5）: 299-307
Wang Y, Yeung L W Y, Yamashita N, Taniyasu S, So M K,
Murphy M B, Lam P K S. 2008. Perfluorooctane sulfonate
（PFOS）and related fluorochemicals in chicken egg in China［J］.
Chinese Science Bulletin , 53（4）: 501-507
Ye L, Wu L L, Jiang Y X, Zhang C J, Chen L. 2009 .
Toxicological study of PFOS/PFOA to Zebrafish（Brachydanio
rerio）embryos ［J］. Environmental Science, 30 （6）: 1727 -1732
（in Chinese）
Yeung L W Y, Guruge K S. 2007 . Differential expression of
chicken hepatic genes responsive to PFOA and PFOS［J］.
Toxicology, 237（1-3）: 111-125
Yu J, Hu J Y. 2009 . Perfluorooctane sulfonate（PFOS）and
perfluorooctanoic acid （PFOA）in sewage treatment plants［J］.
Water Research, 43（9）: 2399-2408
Yu Y, Kong F X, Wang M L, Shi X L. 2006 . Effect of copper
on membrane integrality and esterase activity of microcystis
aeruginosa using flow cytometry［J］. Chinese Journal of Applied
& Environmental Biology, 12（5）: 706-709（in Chinese）
中文参考文献
叶露 , 吴玲玲 , 蒋雨希 , 张超杰 , 陈玲 . 2009. PFOS/PFOA 对斑
马鱼（Brachydanio rerio）胚胎致毒效应研究［J］. 环境科学 , 30
（6）: 1727-1732
于洋 , 孔繁翔 , 王美林 , 史小丽 . 2006. 应用流式细胞技术研究
铜对藻细胞膜完整性及脂酶活性的影响［J］. 应用与环境生物
学报 , 12（5）: 706-709 ◆
542