全 文 ：应用与环境生物学报　2001 ,7(2):147～ 150 　 　
Chin J Appl Environ Biol=ISSN 1006-687X 　 2001-04-25
　
应用斜生栅藻生长抑制实验对重金属
污染土壤的毒性进行诊断
王　颖　李　彬1　孙　弘
(沈阳大学师范学院自然科学系 1沈阳大学建筑与环境学院　沈阳　110015)
摘　要　应用斜生栅藻(Scenedesmus Obliquus)对重金属污染土壤的毒性进行诊断.结果表明 , 斜生栅藻的生长率与土
壤中的重金属含量明显相关 , 并且随重金属投加量的增加而逐渐降低.对两种测试参数进行比较 , 发现采用细胞数生
长率作为土壤毒性的检测指标要比采用光密度 D(λ)增长率更为敏感.当采用细胞数生长率作为检测指标时 , 4 种重
金属的 EC50顺序为:Pb>Cu>Zn>Cd;采用光密度生长率作为检测指标时 , 4种重金属的 EC50顺序为:Pb>Cu>Cd>Zn.
复合污染情况下 ,由于金属间的协同作用 ,使土壤的毒性比单一重金属污染时有明显增强 , 从而为污染土壤的优先修
复提供了理论依据.图5 表 2 参 17
关键词　斜生栅藻;生长抑制实验;土壤;毒性
CLC　Q949.2 ∶X825 ∶X835
TOXICITY ASSESSMENT OF SOIL CONTAMINATED BY HEAVY
METALS USING ALGAE GROWTH INHIBITION TEST
WANG Ying , LI Bin1 &SUN Hong
(Dept.of Natural Science of Teachers College;1Dept.of Architecture and Environment , Shenyang University , Shenyang　110015 , China)
Abstract　Scenedesmus obliquus growth inhibition test was used to test the toxicity of soil contaminated by heavy
metals.It was showed that the growth rate of Scenedesmus obliquus was positively related with the concentration of
heavy metals added to soil.The data also showed that the growth rate decreased with the increasing of heavy met-
als added to soil.Two parameters were chosen and the sensitivity was compared.It was found that the cell growth
rate was more sensitive than D(λ)growth rate.The orders of general detection limit by EC50 of the 4 metals were
Pb>Cu>Zn>Cd using D(λ)growth , while Pb>Cu>Cd>Zn using cell growth rate as test level.This study
also indicated under complex pollution conditions , the toxicity of heavy metals in soil was stronger than that in the
soil only contaminated by single element.Fig 5 , Tab 2 , Ref 17
Keywords　Scenedesmus obliquus;growth inhibition test;soil;toxicity
CLC　Q949.2 ∶X825 ∶X835
　　目前随着工业的发展 ,土壤污染日益严重 ,对人
类的生产和健康都带来了严重的危害.在对土壤污染
进行研究的过程中 ,人们日益发现实现土壤污染毒性
快速诊断的重要性 ,而以往的一些研究方法如植物
法 、动物法 、微生物法目前尚不能充分反映土壤的毒
性状况以及土壤经淋溶后对地下水和人体健康的影
响 ,因此完善这一生态毒理学诊断指标体系需进一步
的实验研究.
藻类作为水生生态系统的初级生产者 ,对水体的
平衡和稳定起着极其重要的作用[ 8] .生物测试中的藻
类测试(Algae inhibition test)是水生生态毒理学研究中
必不可少的方法 ,通过对大量生物测试结果进行分
析 ,发现藻类对于许多毒物比鱼类 、甲壳类更敏感 ,而
且具有生长周期短 ,易于分离培养和可以直
收稿日期:2000-09-30　　接受日期:2000-10-31
接观察细胞水平上的中毒症状等优点 ,是较为理想的
实验材料[ 6] .但此法主要用于水体中污染物的毒性诊
断 ,而将其用于土壤污染毒性诊断还未见相关报导.
所以探讨将水体中的藻类毒性实验方法应用于污染
土壤的毒性诊断的可行性 ,以及确定其毒性临界值 ,
从而为土壤污染生态毒理学指标的建立奠定基础 ,是
具有深远的意义的.
1　材料和方法
1.1　供试土壤
草甸棕壤于 1998年 10月采自中国科学院沈阳应
用生态研究所十里河生态站无污染实验小区(δ/cm 0
～ 20);实验选用过 20目筛的风干土 ,土壤的理化性质
和重金属本底值见表1.
1.2　供试污染物
　　CdCl2·2.5H2O 、CuSO4·5H2O 、Pb(NO3)、ZnSO4·
表 1　供试草甸棕壤基本理化性状
Table 1　Properties of the experimental meadow burozem
pH
w/ %
TP TN K-N Org-C
CEC
Ne/ 106(100 g)-1
w/mg kg -1
Cd Zn Cu Pb
6.22 0.04 0.59 0.09 1.65 20.251 0.122 49.90 19.1 25.7
7H2O均为分析纯试剂 ,以水溶液的形式投加 ,投加量
以干土 w/mg kg-1计算.
1.3　土壤酸浸液制备
称取 60 g过 20目筛的土壤 ,按 1:2.5 的比例用
0.1 mol/L HCl浸提 2 h ,过滤 ,调节 pH 为 6.6 ,用以进
行藻类毒性实验.
1.4　供试生物及其培养
斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)来自中国科学院
水生生物所藻种库 ,采用水生 4 号培养基[ 5] , 25℃,
4 000 lx 进行培养.同步培养采用连续接种的方法[ 2] ,
使所有的细胞个体处于良好的条件下 ,在光照期迅速
发育 ,而后借光暗迭替 ,促使其迅速完成细胞分裂 ,获
得子细胞(即幼期暗细胞),实现同步培养.
1.5　生长测定
采用惠谱 7550 分光光度计测定 D650nm.(用血球
记数板测定细胞数 N=5 N i×104 ,其中 N i为 5个中
格内细胞数)则是在 250 mL三角瓶中装 50 mL 藻液 ,
定时采样进行 D(λ)测定.
2　结果与分析
2.1　斜生栅藻的同步培养和生长
60年代末 ,日 、美 、欧各国学者进行了很多有关藻
类同步培养的研究[ 3 ,12 ,14] ,推动了藻类生理生化的迅
速发展.根据生态毒理实验的要求 ,进行毒性实验的
生物应大小 、年龄一致 ,这样才能使结果更具有代表
性和可比性 ,因此对斜生栅藻进行了同步培养.
在栅藻同步培养的一个生长繁殖周期中 ,光照期
细胞数基本稳定 ,即无形成和释放子细胞的过程 ,但
光密度直线增长 ,这是细胞生长期的特征.停止光照4
h后 ,细胞数直线上升 ,而光密度基本稳定 ,这是细胞
分裂后期的特征.说明经同步培养后 ,斜生栅藻已经
达到同步生长状态 ,为本实验方法的确立提供了良好
的前提条件.
图 1是斜生栅藻的生长曲线图 ,从图中可以看
出 ,斜生栅藻经接种后 ,1 ～ 4 d的 D 650nm迅速增加 ,处
于生长迅速的对数生长阶段 ,5 ～ 7 d的 D650nm增长缓
慢 ,处于平台期 ,接种 7 d后 ,光密度下降 ,藻体逐渐
死亡.由于对数生长期的细胞具有生长迅速 ,敏感性
和活性高等优点 ,所以根据实验要求选取经同步培养
的对数生长期的藻体进行毒性实验.
图 1　斜生栅藻生长曲线图
Fig.1　Growth curve of S.obliquus
2.2　单一重金属污染条件下典型土壤毒性对斜生栅
藻生长率的影响
图 2 ～ 5是草甸棕壤酸浸液毒性与斜生栅藻光密
度和细胞数增长率的关系图 ,从图中可以看出对于重
金属污染的土壤 ,重金属的投加量与斜生栅藻的光密
度和细胞数增长率存在明显的相关性 ,随着重金属投
加量的增加 ,其增长率明显降低.对光密度增长率和
细胞数增长率两种测试指标进行比较 ,发现采用细胞
数增长率作为毒性检测的指标要比采用光密度增长
率较为敏感 ,其它几种重金属的趋势与此相同 ,与文
献的报导完全一致[ 15] .
图 2　Cu投加量与斜生栅藻增长率的关系
Fig.2　Relationship between the concent ration of copper added to soil
and growth rate of S.obliquus
图 3　Zn投加量与斜生栅藻增长率的关系
Fig.3　Relationship between the concentration of zinc added to soil
and growth rate of S.obliquus
148　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　应 用与 环境 生物 学 报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 7卷
图 4　Pb投加量与斜生栅藻增长率的关系
Fig.4　Relationship between the concentration of lead added to soil
and growth rate of S.obliquus
图 5　Cd投加量与斜生栅藻增长率的关系
Fig.5　Relationship between the concentration of cadmium added to soil
and growth rate of S.obliquus
另外 ,不同重金属污染土壤的毒性强度也不同 ,
以光密度作为检测指标则其毒性强弱依次为 Cd>Zn
>Cu>Pb;以细胞数作为检测指标则毒性强弱依次为
Zn>Cd>Cu>Pb.造成这种现象的原因:一方面在于
土壤对重金属的吸附能力不同 ,余国营[ 17]在研究草
甸棕壤对 4种重金属的吸附作用时 ,发现土壤对不同
重金属的吸附量是不同的 ,Pb的吸附量最大 ,Cd的吸
附量最小;另一方面不同重金属对生物的生理 、生化
指标及种群数量的影响作用大小不同[ 12] , Lasheen[ 11]
的工作表明 0.05 mg kg-1的 Cd对天然藻类的生长无
影响 ,而浓度增加到 1 mg kg-1时 ,藻类的生长受到严
重的抑制.Cu作为藻类生长代谢的必需元素 ,当其浓
度为 0.2 mg kg-1时 ,可影响栅藻的生长 , 0.5 mg kg-1
时 ,生长将受到严重抑制[ 13 ,16] .藻类对 Pb 有较高的
耐受力 ,30 mg kg-1时 ,栅藻生长良好 ,100 mg kg-1时 ,
生长出现抑制[ 2 ,10] .
不同的重金属毒害作用的机制也是不同的 , Cd
主要结合在藻类的细胞质和细胞的多磷酸体中 ,使多
磷酸体中的Mg和 Ca 丧失 ,以致这些细胞内含物的元
素组成发生离子变化[ 9] ;Cu 主要是影响藻类的生长
和光合作用 ,改变原生质膜的渗透性 ,使 K从细胞内
丧失[ 1] ;Pb 对藻类的影响主要是在细胞的叶绿素形
成方面[ 10] .所以当研究重金属污染土壤毒性时 ,既要
考虑土壤对重金属的吸附特性 ,又要考虑生物对不同
重金属的敏感性及毒性作用机制.
2.3　土壤复合污染条件下毒性对斜生栅藻光密度和
细胞数增长率的影响
单个重金属污染虽有发生 ,但在自然界中和现实
生活中 ,重金属的污染多为伴生性或综合性 ,即多种
金属元素的复合污染[ 4] .在以往的研究中 ,对单一重
金属污染条件下的土壤毒性进行了大量的研
究[ 6 ,7 ,8.] ,但对复合污染条件下 ,土壤毒性研究还不
多.对单一重金属污染土壤毒性的研究虽有助于制定
环境标准和环境容量 ,但受到一定限制 ,有时使制定
的标准与实际不相符合 ,甚至会造成严重后果 ,因此
有必要对土壤复合污染条件下的毒性进行诊断 ,从而
确立清洁土壤的标准.
从表 2中可以看出 ,草甸棕壤当复合投加不同浓
度的重金属时 ,不同处理对发光菌的毒性作用不同.
正交分析 R 值表明 ,重金属之间存在着相互作用 ,包
括协同 、拮抗等作用 ,对斜生栅藻光密度和细胞数影
响强弱依次为 Pb>Cu>Cd>Zn.当 w(Pb)=200 mg
kg-1时 ,对处理4和处理1进行比较 ,发现处理 4在处
理 1的基础上 ,Cd 、Cu 、Zn的浓度增加后 ,斜生栅藻的
光密度和细胞数增长率都下降 ,表明 Pb与其它 3种
重金属之间存在协同作用 , 同样的作用存在于 Cd 、
Zn 、Cu与其它重金属之间.由于本实验采用正交的实
验方法 ,难以具体对各金属间的相互作用进行判定 ,
但对于研究复合污染条件下 ,影响毒性的主要因素进
行判定 ,以及确定复合条件下的警戒值 ,仍有重要的
意义.
3　结 论
3.1　本文首次应用斜生栅藻生长抑制实验对重金属
污染土壤的毒性进行诊断 ,证明此方法是可行的 ,而
且迅速 、敏感.
3.2　通过连续接种的方法可以获得同步生长的斜生
栅藻 ,在生长对数期(1 ～ 4 d)投加重金属.重金属的
投加量与斜生栅藻增长率之间有明显的相关性 ,随土
壤重金属投加量的增加 ,斜生栅藻的增长率明显降
低.
3.3　对两种测试参数进行的比较结果证明 ,以细胞
数增长率(γN/ %)作为4种金属毒性检测指标的敏感
性要强于以 D650nm的增长率(γD/ %)指标:如在单一
污染条件下的 EC50质量分数值(w [ EC50] /mg kg-1),
以 D650nm为指标时分别为:Cd 25.84 、Zn 33.54 、Cu
160.00和 Pb 408.26;而以 N cell为指标则为 Cd 22.80 、
Zn 15.28 、Cu 123.19和 Pb 310.96.4.4　复合污染条
件下 ,由于重金属的协同作用 ,毒性比单一重金属污
染条件下有明显增加 , 4种重金属的 EC50值 ,以斜生
栅藻光密度增长率 50%为标准 , 4种重金属质量分数
的临界值 w c/mg kg-1分别为 Cd 30 ,Zn 80 ,Cu 200 ,Pb
200;以斜生栅藻细胞数增长率 50%为标准 ,4种重金
属的临界值为 Cd<30 mg kg-1 、Zn<80 mg kg-1 、Cu<
200 mg kg-1 、Pb<200 mg kg-1.
149　2期 王　颖等:应用斜生栅藻生长抑制实验对重金属污染土壤的毒性进行诊断 　　
表 2　草甸棕壤 L9(34)正交实验结果分析
Table 2　The results from orthogonal Array L9(34)of meadow burozem
Cd(mg/ kg)1 Zn(mg/ kg)2 Cu(mg/ kg)3 Pb(mg/kg)4 γD/ % γN/ %
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1(10)
1(10)
1(10)
2(20)
2(20)
2(20)
3(30)
3(30)
3(30)
1(10)
2(40)
3(80)
1(10)
2(40)
3(80)
1(10)
2(40)
3(80)
1(100)
2(200)
3(300)
2(200)
3(300)
1(100)
3(300)
1(100)
2(200)
1(200)
2(500)
3(700)
3(700)
1(200)
2(500)
2(500)
3(700)
1(200)
74.44
35.24
21.08
30.48
42.84
38.76
25.47
32.58
48.62
68.27
31.08
17.49
24.62
37.18
30.57
20.07
24.13
40.01
X 1
X 1
X 2
X 2
X 3
X 3
130.76
116.84
112.08
92.37
106.67
84.21
130.39
112.96
114.34
92.39
108.06
88.07
145.78
122.97
114.34
95.71
89.39
74.74
165.90
145.46
99.47
81.72
84.14
66.24
∑X=
349.51
∑ X =
293.42
X 1
X 1
X 2
X 2
X 3
X 3
43.59
38.95
37.36
30.79
35.56
28.07
43.46
37.65
38.11
30.80
36.02
29.36
48.60
40.99
38.11
31.90
29.80
24.91
55.30
48.49
33.16
27.24
28.05
22.08
R
R
8.03
10.88
7.44
8.29
18.8
16.08
27.25
26.41
3.4　由于复合污染存在的普遍性和多样性 ,近年来
多种污染物共存的复合生态毒理效应的研究已成为
污染生态学和生态毒理学最活跃的领域之一 ,其研究
不仅有助于深入了解真实环境条件下的污染物相互
作用的机制 ,更能为决策部门制定切实可行的环境标
准提供值得信赖的理论依据.然而 ,复合污染物之间
全组合数目极其庞大 ,显然不可能将每种组合统统加
以研究 ,因而复合污染方法学的研究显得尤为重要.
本实验所采取的正交实验设计不失为一种省时 、省力
的可靠方法 ,值得在复合污染研究中广泛推广.
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