全 文 ：收稿日期:2007-07-12 录用日期:2007-09-15
基金项目:中科院水生生物研究所东湖生态站开放项目;科技部基础研究重大项目前期研究专项 (No. 2001CCB00700)
作者简介:胡芹芹 (1983—) ,女,硕士研究生;*通讯作者 (Corresponding author) ,E-mail: xionglily@263.net
邻苯二甲酸二丁酯(DBP)对斜生栅藻的致毒效应研究
胡芹芹,熊丽 *,田裴秀子,李文英
华中师范大学生命科学学院,武汉 430079
摘要:为了评估邻苯二甲酸二丁酯(DBP)对水生生物的毒性效应,采用室内培养的方法,研究了 DBP对斜生栅藻
(Scenedesmus obliquus)的急性毒性效应.实验设置 5个暴露组(5、10、20、50、100mg·L-1)和 1个对照组(0mg·L-1) ,暴露
96h后分别测定 DBP对斜生栅藻生长量、光合色素含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量等生理生
化指标的影响.结果表明,各暴露组 DBP对斜生栅藻的生长均有抑制作用,随 DBP暴露浓度的增大,藻细胞密度逐
渐降低,显示出明显的剂量-效应关系. DBP对斜生栅藻的 24、48、72、96h的 EC50值分别为 3.31、15.49、1.95、2.21mg·
L-1.叶绿素 a、b及类胡萝卜素含量随着 DBP暴露浓度的增大呈现相同的变化趋势,均为低浓度(5~10mg·L-1)上升,
高浓度(10~100mg·L-1)下降.随 DBP暴露浓度的增大,斜生栅藻 SOD活性表现为先激活后抑制,在 20mg·L-1时
SOD活性达到最大值(与对照比较,p<0.05) ;当 DBP暴露浓度≥10mg·L-1时,MDA含量随 DBP浓度的增大显著增
加(与对照比较,p<0.05, p<0.01).
关键词:邻苯二甲酸二丁酯 (DBP) ;斜生栅藻;光合色素;超氧化物歧化酶 (SOD) ;丙二醛 (MDA)
文章编号:1673-5897(2008)1-087-06 中图分类号:X171.5 文献标识码:A
Toxic Effects of Dibutyl Phthalate(DBP)on Scenedesmus obliquus
HU Qin-qin,XIONG Li*,TIANPEI Xiu-zi,LI Wen-ying
College of Life Science, Central China Normal University, Wuhan 430079
Received 12 July 2007 accepted 15 September 2007
Abstract:In order to study the toxic effects of DBP on the fresh algae, Scenedesmus obliquus was exposed to DBP of
five concentrations(5, 10, 20, 50, 100mg·L-1)and a control(0mg·L-1). Its growth rate、photosynthetic pigment contents、
SOD activities and MDA contents were measured after 96h exposure. Results showed that, DBP had inhibition effect on
growth of S. obliquus compared with the control. With the increase of concentrations, the inhibition increased
correspondingly. The 24, 48, 72, and 96h EC50values of DBP were 3.31, 15.49, 1.95, and 2.21mg·L-1, respectively.
DBP had the same effects on the contents of the chlorophyll-a, chlorophyll-b and carotenoids, that is, the contents of the
photosynthetic pigments increased at the low concentrations(5~10mg·L-1)and decreased at the high concentrations(10~
100mg·L-1). SOD activities of S. obliquus were stimulated first and inhibited later with the increase of DBP
concentrations, and reached its peak when DBP concentration was 20mg·L-1(compared with the control, p<0.05). Wi h
the increase of DBP concentrations, MDA contents increased significantly(compared with the control, p<0.05, p<0.01),
when DBP concentrations were higher than 10mg·L-1.
Keywords:dibutyl phthalate(DBP) ;Scen desmus obliquus;photosynthetic pigment;SOD;MDA
第 3卷第 1期
2008年 2月
生 态 毒 理 学 报
Asian Journal of Ecotoxicology
Vol. 3, No. 1
Feb. 2008
生 态 毒 理 学 报 第 3卷
1 引言(Introduction)
邻苯二甲酸二丁酯(DBP)是一种重要的邻苯
二甲酸酯类化合物,是塑料工业最主要的增塑剂
之一,广泛应用于塑料袋、食品袋、血液储存袋、静
脉内导管、儿童玩具,以及一些药物和杀虫剂中
(孙俊红等,2002).由于在生产加工过程中,DBP
并没有与高分子碳链聚合,随着时间的推移,DBP
会逐渐游离出来,进入空气、水体、土壤及生物体
内.DBP可通过呼吸、饮水、食物及皮肤接触(化妆
品)等途径进入人体,形成富集,从而对人群健康
造成潜在的危险.DBP是美国国家环保局优先控
制的有毒污染物之一.有关 DBP对哺乳动物、浮
游藻类、浮游动物、节肢动物和鱼类等的毒性作用
均有报道.这些研究认为邻苯二甲酸酯类化合物
在被试生物体内的积累对生物的正常生长繁殖,
甚至物种的延续都可能产生不可逆转的不利影响
(Fosteretal.,2000;刘慧杰等,2004;李佳华等,
2005;况琪军等,2003;李文英等,2007).
藻类作为水生态系统的初级生产者,其种类的
多样性和初级生产量直接影响水生态系统的结构
和功能,因而成为监测评价水环境质量的重要指
标.国内外有关 DBP对藻类的影响屡有报道,但
研究多集中于藻类对 DBP的富集和耐受性以及
DBP对藻体内各种酶活性的影响方面(况琪军等,
2003;李佳华等,2005),从藻细胞的密度以及氧化
损伤的角度出发,探讨 DBP对藻类生长、代谢和繁
殖的影响目前还鲜有报道.斜生栅藻(Scenedesmus
obliquus)是一种常见的浮游藻类,对毒物敏感、易
获得、个体小、繁殖快,在较短时间内即可得到化
学物质对其许多世代及种群水平的影响评价,是
一种常用的测试生物(熊丽等,2002).本实验选择
斜生栅藻作为实验生物,就 DBP对其毒性效应进
行了探讨,为进一步评价邻苯二甲酸酯类化合物
对水生生物的毒性效应及其环境风险评价积累科
学依据.
2 材料与方法(Materialsandmethods)
2.1 实验材料与仪器
邻苯二甲酸二丁酯(DBP),分析纯,购自天津
市科密欧化学试剂开发中心.丙酮,分析纯,购自
天津市东丽区天大化学试剂厂.MDA试剂盒,购
自南京建成生物工程研究所.
斜生栅藻(Scenedesmusobliquus),由中国科学
院水生生物研究所淡水藻种库提供,编号 FACHB39.
高速冷冻离心机 (Eppendorf,德国)、酶标仪
(BIO-TEK,美国)、96孔聚苯乙烯酶标板、显微镜、
血球计数板、计数器、光照培养箱等.
2.2 实验方法
2.2.1 驯化培养
斜生栅藻在无菌条件下转移至水生 4号(HB-
4)人工培养液中(况琪军等,2003),培养至对数生
长期进一步扩大培养.培养条件为:温度(25±1)℃;
pH7~8;白色日光灯,光暗比 12h:12h,光强为
3000lux左右;静止培养,每天定时人工摇动 3次.
2.2.2 溶剂不可见效应浓度值(NOEC)的测定
利用培养液配制丙酮的 6个浓度系列:0、0.1、
0.15、0.2、0.5和 1.0%,96h培养后用血球计数板显
微计数,测定藻细胞的密度(个·mL-1),计算其不
可见效应浓度值(Noobservedefectconcentration,
NOEC).
2.2.3 DBP暴露对斜生栅藻生长的影响及 EC50值
的测定
将原藻液用水生 4号培养基稀释至 OD值为
0.1左右,取 50mL稀释后藻液分装于 150mL锥形
瓶中.培养 3d后,根据预实验的结果,以丙酮为助
溶剂(丙酮在培养基中的浓度控制在其不可见效
应浓度范围内),设置 5个暴露组和 1个空白对照
组,每组 3个平行,DBP在藻液中的终浓度分别为
0、5、10、20、50、100mg·L-1,测定 DBP对斜生栅藻
的毒性.每隔 24h取样,用血球计数板显微计数,
测定藻细胞的密度(个·mL-1),同时用酶标仪测定
650nm波长下藻液的吸光值.用概率单位-浓度对
数法(黄国兰等,1994),分别计算出 24、48、72、96h
的半效应浓度 EC50值.
2.2.4 光合色素含量的测定
96h后,分别测定各实验组藻类光合色素含
量,具体方法为:取 20mL藻液,4000g·min-1离心
10min,去上清,直接加入 5mL80%的丙酮,摇匀,
在黑暗处抽提 24h.再 10,000g·min-1离心 10min,
取上清置于酶标 96孔板中,以 80%丙酮为参比,
于酶标仪下测定 663、645、470nm波长下抽提液的
88
胡芹芹等:邻苯二甲酸二丁酯 (DBP) 对斜生栅藻的致毒效应研究第 1期
吸光值.
光合色素含量计算公式如下(徐晓宇等,2007):
C-a=12.21OD663-2.81OD645 (1)
C-b=20.13OD645-5.03OD663 (2)
C-k=(1000OD470-3.27C-a-104C-b)/229 (3)
式中:C-a、C-b分别为叶绿素 a、叶绿素 b含量
(μg·mL-1);C-k为类胡萝卜含量(μg·mL-1).
2.2.5 超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定
暴露 96h后,取 20mL藻液,4000g·min-1离心
15min,去上清,收集藻细胞,分别加入预冷的 pH
7.8的 0.05mg·L-1的磷酸盐缓冲液 3mL和少量的
石英砂进行冰浴研磨,匀浆液在 4℃下 8500g·min-1
离心 15min,上清液即为 SOD待测液.SOD活性的
测定采用 NBT光还原反应法(唐学玺等,1998).
2.2.6 膜脂过氧化作用的测定
暴露 96h后,取 20mL藻液,4000g·min-1离心
15min,去上清,收集藻细胞,分别加入 3mL10%三
氯乙酸和少量的石英砂进行冰浴研磨,匀浆液
10,000g·min-1离心 15min,上清液即为 MDA待测
液(刘碧云等,2006).MDA含量的测定严格按照
试剂盒说明书进行.
2.3 数据处理
每组实验均设 3组平行,实验数据处理采用
Origin5.0统计分析软件,并进行 t检验和绘图.
3 结果与分析(Resultsandanalysis)
3.1 溶剂 NOEC值的测定
分别以 0.1、0.15、0.2、0.5和 1.0%的丙酮处理
斜生栅藻,结果显示,96h后,与对照组相比,0.1%
及以下浓度的丙酮对斜生栅藻的生长略有促进作
用,0.5%和 1%的丙酮有明显的抑制作用.经方差
分析,丙酮对斜生栅藻的 NOEC值为 0.15%,即正
式实验中丙酮的含量应低于 0.15%.
3.2 DBP对斜生栅藻的急性毒性
不同浓度 DBP暴露下,斜生栅藻的生长曲线
如图 1所示.从图 1可以看出,48h前,各实验组藻
密度基本呈逐渐升高趋势;48h后,随着 DBP在藻
细胞内的积累,DBP暴露组藻的生长速度减慢,藻
细胞密度呈下降趋势.与对照组相比,各 DBP暴
露组藻细胞的生长均受到不同程度的抑制.随着
DBP暴露浓度的增大,藻细胞密度逐渐下降,显示
出明显的剂量-效应关系.镜检发现,随着 DBP浓
度的增大和暴露时间的延长,藻细胞体积增大,壁
增厚,细胞形态改变,子细胞分裂畸形,出现异型
胞.说明 DBP对斜生栅藻的生长与分裂产生了一
定的解偶联作用.
根据图 1的数据,采用黄国兰等(1994)介绍的
方法得到不同时间的概率单位-浓度对数曲线方
程,经统计分析,确定各时间(24、48、72、96h)的
EC50及其 95%置信区间,如表 1所示.
培养时间/h 回归方程 EC50/(mg·L-1) r2 95%置信区间/(mg·L-1)
24 y=0.6457x+0.1663 3.31 0.99 3.14~3.48
48 y=0.6368x-0.2553 15.49 0.96 14.72~16.26
72 y=0.3903x+0.3871 1.95 0.99 1.85~2.05
96 y=0.2734x+0.4056 2.21 0.87 2.1~2.32
表1 DBP对斜生栅藻的急性毒性
Table1 TheacutetoxicityofDBPtoS.obliquus
注:x为DBP浓度对数;y为抑制率概率单位(%)
89
生 态 毒 理 学 报 第 3卷
由表 1可以看出,DBP对斜生栅藻不同时段
的 EC50值与早期报道的 DBP对水生生物的急性毒
性值波动在 1~10mg·L-1之间基本吻合 (Defoeet
al.,1990).比较各个时段的 EC50值,48h时最不敏
感,其 EC50值最大,表明在短时间内,斜生栅藻自
身恢复较快;随着暴露天数的增加,EC50值减小且
变化不大,表明 DBP对斜生栅藻的毒性随着时间
的延长而增强,藻自身的抗性减小,恢复减慢(熊
丽等,2002),此结果与暴露组斜生栅藻的生长趋
势是一致的.
3.3 DBP对斜生栅藻光合色素含量的影响
随着培养时间的延长,各暴露组藻液与对照组
相比,颜色明显变浅,且 DBP浓度越高,藻液颜色
越浅.暴露 96h后,各实验组叶绿素 a、叶绿素 b及
类胡萝卜素含量如图 2所示.无论叶绿素 a、叶绿
素 b还是类胡萝卜素,其含量均随 DBP暴露浓度
(5~100mg·L-1)呈现先上升后下降的趋势.当 DBP
浓度为 5mg·L-1时,与对照组相比,叶绿素含量减
少,表明 DBP在低浓度时即对叶绿素有显著抑制
作用.5~10mg·L-1时,叶绿素含量上升,可能是因
为此浓度范围的 DBP胁迫促进了藻的代谢,激活
了藻类色素合成的相关酶类,色素合成增多,含量
上升,且受损藻细胞逐渐恢复的结果.当 DBP浓
度>10mg·L-1时,随着 DBP浓度的升高,叶绿素含
量逐渐下降,其对藻细胞产生不可逆转的影响.
3.4 DBP对斜生栅藻 SOD的影响
暴露 96h后,各实验组斜生栅藻 SOD活性的
变化如图 3所示.从图中可以看出,随 DBP暴露浓
度的升高,SOD变化呈单峰曲线.当 DBP浓度≤
5mg·L-1,SOD活性变化不大,仅比对照高出 7%;
当 DBP浓度≥10mg·L-1时,SOD活性迅速上升,
与对照组相比有显著性差异(p<0.05),到 20mg·L-1
时 SOD达到峰值,高出对照 118%.表明 DBP对藻
具有一定的毒害作用,藻体受到逆境胁迫,诱导自
身产生更多的 SOD,以清除过多的活性氧来保护
机体.DBP暴露浓度超过 20mg·L-1后,酶活性开
始下降,50mg·L-1时,与对照组有极显著性差异
(p<0.01),但与 20mg·L-1组无显著性差异 (p>
0.05);到 100mg·L-1时,酶活性下降到对照组的
60.8%,与 20mg·L-1组有极显著性差异(p<0.01).
表明由于高浓度 DBP的胁迫,藻细胞的结构遭到
破坏,超过了藻自身的调节范围,从而导致 SOD合
成障碍,活性下降.
3.5 DBP对斜生栅藻 MDA含量的影响
暴露 96h后,各实验组斜生栅藻 MDA含量变
化如图 4所示.从图中可以看出,当 DBP浓度≤
5mg·L-1时,MDA含量略有升高,与对照组没有显
著性差异(p>0.05).当 DBP浓度≥10mg·L-1时,
MDA含量随 DBP浓度的增大逐渐上升.与对照组
相比,10mg·L-1时即有显著性差异 (p<0.05),从
20mg·L-1组开始,均有极显著性差异(p<0.01).表
明随着 DBP暴露浓度的增大,膜脂过氧化加剧,细
胞伤害加重,其生长受到抑制.
90
胡芹芹等:邻苯二甲酸二丁酯 (DBP) 对斜生栅藻的致毒效应研究第 1期
4 讨论(Discussion)
从本实验结果可以看出,不同浓度的 DBP暴
露下,斜生栅藻的生长、光合色素、SOD活性及
MDA含量呈现出一种内部相关性.低浓度的 DBP
暴露下,SOD活性增强,使藻细胞的代谢加强,色
素合成增多,含量上升,MDA含量趋于稳定,藻细
胞受损较轻;高浓度 DBP暴露下,SOD含量及活
性均下降,氧自由基增多,MDA含量相应上升,膜
质过氧化加剧,导致细胞膜及内囊体膜的损伤和
破坏,抑制了藻细胞的生长和代谢,降低了色素含量.
本研究表明,不同浓度 DBP暴露下,藻细胞的
生长均受到不同程度的抑制,且抑制程度与 DBP
的浓度呈正相关.DBP浓度≥50mg·L-1时,斜生栅
藻 96h的细胞数减少率达 54%.况琪军等人(2003)
研究认为 DBP对藻类的生长具有抑制作用,当
DBP浓度≥40mg·L-1时,被测指标 96h的减少率
达 40%,本实验结果与之基本吻合.这可能是因为
DBP暴露降低了斜生栅藻代谢繁殖相关酶的活
性,从而抑制了藻的代谢和繁殖,导致藻细胞数量
减少.
很多需氧生物的细胞毒害机理可以用自由基
损伤学说来解释.超氧阴离子(O2
-·
)是一种反应活
泼的氧自由基,与单线态氧(1O2)、过氧化氢(H2O2)
和羟自由基(OH·)等统称为活性氧(ROS).ROS
在细胞内需氧代谢过程中不断产生和清除,使之
处于低水平的动态平衡,这时的活性氧含量不会
危害生物体.当植物遭受环境胁迫(盐、低温、高
温、外源物质等)时,活性氧的产生和清除间的平
衡被破坏,导致活性氧积累(刘碧云等,2006).
光合色素是客观反映植物利用光照能力的一
类重要指标,往往可以作为判断植物光合生理能
力、反映环境胁迫状况的依据,其含量变化能较好
地反映生物各阶段生长发育正常与否.光合器官
是植物细胞内活性氧的主要来源之一,而光合色
素及与之结合的内囊体膜均具有不饱和多烯结
构,极易受活性氧的攻击(刘碧云等,2006).从实
验结果可以看出,斜生栅藻的叶绿素含量在 DBP
低浓度范围内增加,高浓度范围内降低,可能是因
为高浓度 DBP暴露下,细胞内活性氧的积累导致
叶绿体结构破坏,叶绿素合成受阻(Geofroyetal.,
2003).Alberte等(1981)认为,逆境胁迫下叶绿素
含量降低的主要原因是叶绿体片层中捕光 Chla/b-
Pro复合体合成受到抑制.
过剩自由基的毒害之一是引发或加剧膜脂过
氧化作用,造成细胞膜系统的损伤,严重时会导致
植物细胞死亡(唐学玺等,1998).SOD酶能消除逆
境中生成的氧自由基,是防护氧自由基对细胞膜
系统伤害的保护酶.从本实验结果可以看出,斜生
栅藻在受到低浓度的 DBP暴露时,SOD活性有所
上升,以增强藻体对活性氧的清除能力,保持自由
基的平衡;而当受到高浓度的 DBP暴露时,藻细胞
的结构遭到破坏,SOD合成障碍,活性随之下降,
造成活性氧的积累和细胞的伤害.MDA是生物膜
系统脂质过氧化的产物之一,其浓度表示脂质过
氧化强度和膜系统伤害程度.本实验中 MDA含量
的逐渐上升表明,随着 DBP暴露浓度的升高,SOD
酶活性的下降,活性氧的产生和清除间的平衡被
破坏,斜生栅藻的膜脂质过氧化加剧,细胞膜的结
构和功能遭到破坏,细胞伤害加重.
通讯作者简介:熊丽(1968—),女,环境科学博士,副教
授,硕士生导师,华中师范大学生命科学学院生物化学
实验室主任,主要研究方向为分子生态毒理学和污染生
物化学,近年来发表学术论文 30余篇.
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