全 文 ： 62 海洋科学 / 2012年 / 第 36卷 / 第 2期
锰离子对斜生栅藻 DHD-3的生长和油脂积累的调控作用
袁 程1,2, 刘君寒2, 任晓慧1, 李福利2
(1．河北农业大学 海洋学院, 河北 秦皇岛 066003; 2．中国科学院 青岛生物能源与过程研究所, 山东 青岛
266101)
摘要: 研究了培养液中不同锰离子浓度对斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)DHD-3 的生长、油脂积累以
及脂肪酸组成的影响。结果表明, 培养液中不同初始浓度的锰离子对斜生栅藻早期叶绿素积累和生长
会产生一定的调节作用, 过高或过低的锰离子都不利于斜生栅藻细胞内叶绿素的积累、微藻的生长和
油脂的积累。经过 14 d 培养后, 当初始锰离子的添加量为 2.72 mg/L 时, 斜生栅藻的生物量和细胞内油
脂含量分别达到 2.9 g/L 和细胞干重的 55.1%, 细胞内油脂含量比对照组提高了 11%; 同时, 单位水体
中油脂的产量达到了 1.6 g/L, 比对照组提高了 14%, 但改变锰离子的初始浓度并不对斜生栅藻脂肪酸
的组成产生明显影响。
关键词: 锰离子; 斜生栅藻(Scenedesmus obliquus); 油脂; 脂肪酸组成; 调控
中图分类号: Q176 文献标识码: A 文章编号: 1000-3096(2012)02-0062-05
能源短缺成为 21世纪人类面临的一个重大问题,
利用微藻生产生物柴油被认为是解决能源短缺的重
要途径。斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)是一种常见
的淡水微藻 , 可以从不同的水体中分离获得 , 尤其
在污水中, 其油脂含量介于 11%~55%[1], 可以用于
污水处理 [2], 因此使用斜生栅藻生产生物柴油具有
巨大的优势。
微藻在正常的生理条件下, 其细胞内油脂的积
累是相对有限的。研究发现, 通过改变培养微藻的营
养元素的组成和比例 , 可以调控微藻生长的生理 ,
进而诱导微藻细胞油脂的积累, 如在氮、磷缺乏的情
况下, 糖类物质等可转化为脂质[3-4]。氮和磷是微藻
生长所必须的大量元素, 虽然可以通过调控氮、磷来
诱导微藻油脂的积累, 但在增加微藻细胞含油量的
同时 , 却减少了微藻生物量的积累 , 总体而言并未
提高微藻单位体积水体中油脂的生产能力。锰是植
物生长所需要的微量元素, 对于植物的生理调节有
重要作用 , 是植物细胞许多酶的辅因子 , 如脂肪酸
合成途径中的一些酶 ; 锰还直接参与光合作用 , 是
叶绿素形成的必需物质[10]。同时, 锰是工业废水中的
常见排放物, 按照国家规定, 工业废水中 Mn2+的最
高允许排放量为 5×10−3 g/L[5]。微藻培养的过程中,
水的需求量是巨大的。故探索利用含锰工业废水培
养微藻来生产油脂, 除了可以生产生物柴油、解决燃
料问题的同时, 还能达到处理工业废水、保护环境的
目的。
实验室前期筛选到一株油脂含量达到干重 46%
的斜生栅藻(Scenedesmus obliquus), 本文研究了培
养基中不同水平的锰离子浓度对该栅藻细胞的生
长、总脂含量和脂肪酸组成的影响, 为将来大规模利
用含锰工业废水培养斜生栅藻生产生物柴油提供实
验依据。
1 材料与方法
1.1 藻种和培养方法
斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)DHD-3 为中国
科学院青岛生物能源与过程研究所微生物资源藻种
库保藏。
将对数生长期的藻种按照 1 : 10(V/V)的比例接
种于含有不同锰离子浓度的 BG11培养液中。初始接
种 OD750为 0.2, 培养于柱式培养器(Φ 4.2 cm×38 cm),

收稿日期: 2010-12-16;修回日期: 2011-03-29
基金项目: 中科院知识创新工程重要方向性项目(KGCX2-YW-374-3);
国家十一五重大科技专项 : 水体污染控制与治理重大科技专项
(2008ZX074220-003-005)
作者简介 : 袁程(1985-), 男 , 山东青岛人 , 硕士研究生 , 研究方向 :
水生生物种质资源, 电话: 0532-80662656, E-mail: jkev001@126.com;
任晓慧, 通信作者, E-mail: renxiaohui710409@sina.com; 李福利, 通
信作者, 电话: 0532-80662655, E-mail: lifl@qibebt.ac.cn
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连续光照(80 μmol /m2 ·s)、通气培养, CO2浓度为
2%, 培养温度为 25℃±1℃。
BG11培养基: NaNO3 1 500 mg/L; K2HPO4 40
mg/L; MgSO4·7H2O 75 mg/L; CaCl2·2H2O 36 mg/L;
柠檬酸 6 mg/L; 柠檬酸铁铵 6 mg/L; Na2EDTA 1
mg/L; NaCO3 20 mg/L; H3BO3 2.86 mg/L;
MnCl2·4H2O 1.81 mg/L; ZnSO4·7H2O 0.222 mg/L;
NaMoO4·2H2O 0.39 mg/L; CuSO4·5H2O 0.079 mg/L;
Co(NO3)2·6H2O 0.049 mg/L; 去离子水 1 L, 调节 pH
至 7.4。
1.2 藻细胞干重的测定、叶绿素含量和
蛋白质含量的测定
藻细胞干重的测定 : 收集一定体积的藻液 , 经
0.8 μm的微孔滤膜过滤, 并于 105℃烘至恒重, 称量
藻细胞的干重。
叶绿素测定: 参照文献[6]方法进行。
蛋白质含量的测定 : 收集一定体积的藻液 ,
10 000 r/min 离心后, 弃上清, 加入 0.5 mol/L氢氧
化钠溶液, 煮沸 10 min, 用 BCA 蛋白定量试剂盒
(贝博生物, 上海)检测蛋白含量。
1.3 油脂的提取和脂肪酸成分的分析
收集藻细胞, 3 500 r/min离心 10 min, 用去离子
水洗涤后, 在冷冻干燥机中冷冻干燥 24 h。称取约
30 mg藻粉, 按照 Bligh-Dyer法, 提取总油脂[7]。加
入 2.5 mL含 2%浓硫酸的甲醇, 迅速混匀, 于 85 ℃
水浴中反应 2 h。冷却至室温后, 加入 2 mL正庚烷和
2 mL 饱和氯化钠, 充分振荡并静置分层, 加入一定
量 C19 脂肪酸甲酯, 离心后取上层进行气相色谱分
析。
脂肪酸成分的分析采用气相色谱法 (Varian
450-GC, 美 国 ), 色 谱 检 测 条 件 如 下 : 使 用
CP-WAX58 毛细管柱(25 m×0.25 mm), 进样量为 1
μL, 分流比为 1 : 30。升温程序: 100保持 2 min, 以
10℃/min 升至 250℃, 保持 3 min。进样器温度为:
250℃, 检测器温度为 280℃。以面积归一法得到各
脂肪酸组分的相对含量, 脂肪酸标准品为 Sigma 公
司产品。
2 结果与分析
2.1 锰离子对斜生栅藻生长的影响
图 1 给出了不同初始锰离子浓度的培养基中,
经 14d培养后, 斜生栅藻细胞生物量的变化。总体而
言 , 在本文实验研究的锰离子范围内 , 锰离子浓度
对微藻生物量的影响不大。仅当初始锰离子添加量
为 2.72 mg/L时, 藻细胞的生物量最大, 达到了 2.93
g/L; 当锰离子浓度较低和较高时 , 生物量相对略
低。马小妮等[8]研究了锰离子对于微囊藻生长的影响,
当锰离子含量在 0.055～5.5 mg/L时, 对微囊藻的生
长会有促进作用, 当锰离子含量过高 (55 mg/L)时,
反而对微囊藻的生长有抑制作用。本试验中未发现
锰离子强烈的抑制斜生栅藻的生长的影响, 说明在
锰离子添加量不超过 4.53 mg/L时, 不会显著影响到
斜生栅藻的生长。

图 1 经过培养 14 d 后, 不同锰离子添加量对斜生栅藻
生物量的影响
Fig. 1 Effect of different initial concentration Mn ion on bio-
mass of Scenedesmus obliquus after a 14-day culture

2.2 锰离子对斜生栅藻叶绿素积累的影响
叶绿素 a 作为植物光合作用的基础, 能够直接
或间接的反映植物生理状态的变化。由图 2可知, 藻
细胞体内叶绿素含量在微藻生长前期处在较高水平,
并在第 4天达到最大, 随着培养时间的延长, 体内叶
绿素 a 含量逐渐的减少。当藻细胞生长进入稳定期,
胞内油脂开始积累 , 此时微藻的光合作用减弱 , 叶
绿素 a的含量维持在一个较低的水平。
由图 2可知, 锰离子对于微藻叶绿素 a合成的影
响主要在微藻细胞生长的初期。在微藻细胞培养至
第 2天时, 初始液中锰离子浓度较高, 影响了微藻细
胞内叶绿素 a的合成, 细胞内叶绿素 a的含量较少。
在初始锰离子添加量为 2.72 mg/L时, 叶绿素 a含量
最多, 但在第 4天, 其叶绿素水平为不同锰离子添加
量里含量最小的 , 说明在培养的初期 , 初始液中适
当的锰离子能够促进叶绿素 a 的合成, 提高斜生栅
藻对环境的适应能力。
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图 2 锰离子对斜生栅藻细胞内叶绿素 a含量的影响
Fig. 2 Effect of different initial concentration Mn ion on
cellular chlorophyll a content of Scenedesmus
obliquus

2.3 锰离子对斜生栅藻细胞内蛋白质含量的
影响
当锰离子初始添加量为 0.92 mg/L时, 经过 14d
的培养后 , 微藻细胞内蛋白质的含量较少 , 占细胞
干重的 5.8%。锰离子初始添加量为 1.81 mg/L时, 经
过 14d培养后, 细胞内蛋白质含量较高, 占细胞干重
的 6.6%(图 3)。随着初始培养液中锰离子添加量的增
加, 细胞内蛋白质的含量逐渐减少。说明高浓度的锰
元素能够影响栅藻细胞内蛋白质的积累。但是低浓
度的锰元素又会阻碍栅藻细胞的正常生长, 从而影
响到栅藻细胞物质的积累。结合初始锰离子对斜生
栅藻初期细胞体内叶绿素 a 含量的影响, 本试验中,
以培养液中初始锰离子浓度在 1.81～2.72 mg/L为栅
藻正常生长的最佳添加量。

图 3 经过 14 d培养后, 锰离子对斜生栅藻细胞体内蛋白质
含量的影响
Fig. 3 Effect of different initial concentration Mn ion on
cellular protein content of Scenedesmus obliquus
after a 14-day culture
2.4 锰离子对斜生栅藻细胞油脂含量和
油脂产量的影响
图 4 给出了在不同初始锰离子浓度的培养液中,
经 14 d 培养后斜生栅藻细胞内油脂含量的变化, 当
锰离子添加量为 0.92 mg/L和 1.81 mg/L时, 微藻细
胞总脂含量比锰离子添加量为 2.72 mg/L时稍低, 当
初始锰离子添加量为 2.72 mg/L时, 藻细胞内油脂含
量最大 , 达到了细胞干重的 55.1%, 相对于对照组
(MnCl2·4H2O, 1.81 mg/L)提高 11%; 随着锰离子添加
量的增大 , 细胞内油脂含量降低较大 , 当锰离子添
加量为 3.62 mg/L和 4.53 mg/L时, 细胞内油脂含量
分别为细胞干重的 43.1 %和 44.7%, 说明培养液中
锰离子过少, 会影响到斜生栅藻细胞内油脂的积累,
但高浓度的锰同样也会抑制藻细胞中油脂的形成与
积累; 同时 , 对单位水体中油脂的生产能力分析发
现(图 4), 2.72 mg/L是该试验培养液中锰离子的最佳
添加量 , 此时水体中油脂的生产能力达到 1.6 g/L,
相对于对照组(MnCl2·4H2O, 1.81 mg/L)提高 14 %。综
合分析, 在栅藻的培养过程中需要添加适量的锰离
子诱导藻细胞中油脂的积累; 本试验中 , 最佳的油
脂生产能力的锰离子添加量为 2.72 mg/L。

图 4 初始液中不同浓度的锰离子添加量对斜生栅藻细胞
内油脂含量和单位水体中油脂产量的影响
Fig. 4 Effect of different initial concentration Mn ion on
cellular lipid content and yield of lipid in
Scenedesmus obliquus

2.5 锰离子对斜生栅藻脂肪酸组成的影响
经过 14 d 的培养后, 不同浓度的锰对斜生栅藻
脂肪酸组成的影响见表 1。根据标准样品中 14 种脂
肪酸成分的保留时间, 发现斜生栅藻 DHD-3 的总脂
中主要含有其中的 8种, C14 : 0、C20 : 0以及碳链更
长的脂肪酸并未检测到。虽然培养液中添加高浓度
的锰离子会造成了斜生栅藻油脂生产能力的下降 ,
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表 1 不同初始浓度的 Mn2+对脂肪酸组成的影响
Tab. 1 Effect of different initial concentration Mn ion on fatty acid composition of Scenedesmus obliquus
MnCl2·4H2O(mg/L) 脂肪酸
0.92 1.81 2.72 3.62 4.53
C16 : 0 30.53 28.87 29.48 31.31 28.43
C16 : 1 2.28 3.20 2.93 2.87 3.28
C16 : 2 4.72 4.33 3.81 3.28 4.04
C18 : 0 2.06 2.76 2.51 2.30 1.99
C18 : 1 36.68 39.41 40.35 41.2 39.85
C18 : 2 14.90 13.85 13.79 12.96 14.67
C18 : 3 5.97 5.47 5.06 4.15 5.34
C18 : 4 2.90 2.13 2.04 1.93 2.40
注: 所有结果均为 3次测定的平均值; 所有结果均为各脂肪酸在总脂中的质量分数(%)

但锰离子对于斜生栅藻细胞内脂肪酸的组成没有明
显的影响(P=0.640, P>0.05就表示在不同锰离子初始
浓度下, 各组分差别不显著), C16 : 0和 C18 : 1仍是
斜生栅藻脂肪酸中的主要成分, 其他脂肪酸在总油
脂中的比例并未发生明显变化。
3 讨论
运用污水培养微藻生产可再生能源, 是当前生
物能源领域的研究热点。作为污水排放中重要指标
的锰离子, 被报道具有调节植物光合作用以及植物
细胞脂肪酸积累的作用[9]。本试验研究了锰离子对一
株高油脂含量的斜生栅藻生长、油脂积累以及脂肪
酸组成的影响, 试验表明经过 14 d 培养后, 该藻的
最佳油脂积累的初始锰离子添加量为 2.72 mg/L, 其
生物量和细胞内油脂含量分别达到 2.9 g/L和 55.1%,
细胞内油脂含量比对照组提高了 11%; 同时, 单位
水体中油脂的产量达到了 1.6 g/L, 比对照组提高了
14%, 但改变锰离子的初始浓度并没有对斜生栅藻
脂肪酸的组成产生明显影响, 说明可以利用锰离子
调控斜生栅藻细胞的油脂积累, 增加单位水体中油
脂的产量。
郭金耀等 [9]研究了锰对盐藻生长和物质积累的
影响, 发现培养液中的锰质量浓度为 2.0 mg/L或 8.0
mg/L时, 单个盐藻细胞中的蛋白质含量与β-胡萝卜
素含量均最高, 但培养液中细胞密度、盐藻蛋白质含
量、β-胡萝卜素含量都较低。说明了盐藻生长需要
添加适宜的锰离子 , 同时获得不同的代谢产物 , 也
可用锰离子进行调控。Constantopoulos[11]研究了锰离
子对 Euglena gracilis 生长和油脂组成的影响, 发现
培养基中缺乏锰离子时会影响藻细胞的生长, 但是
缺锰培养未对最终细胞内叶绿素含量产生影响; 研
究还发现, 添加锰离子(9 μm)与缺乏锰离子培养藻
细胞时, 脂肪酸组成会发生变化; 添加锰离子时, 藻
细胞中油脂含量由无锰离子时的 135 μg 增加到 157
μg; 同时油脂中不饱和脂肪酸的含量增加 , 细胞内
的不饱和脂肪酸质量分数由不添加锰离子时的
27.9%增加至 52.3%, 说明锰离子能够影响到
Euglena gracilis细胞内油脂含量和脂肪酸组成。
本试验通过研究锰离子对斜生栅藻生长、油脂
积累及脂肪酸组成的影响, 为将来室外大规模利用
含锰工业污水及中水等培养产能微藻提供了试验基
础。
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Regulation of Mn ion on the growth and lipid accumulation of
microalga Scenedesmus obliquus DHD-3
YUAN Cheng1,2, LIU Jun-han2, REN Xiao-hui1, LI Fu-li2
(1. Ocean College of Hebei Agriculture University, Qinhuangdao 066003, China; 2. Qingdao Institute of Bioenergy
and Bioprocess Technology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266101, China)
Received: Dec.,16,2010
Key words: Mn ion, Scenedesmus obliquus, Lipid, Fatty acid composition, regulation

Abstract: As an important component of chlorophyll, manganese (Mn) ion takes part in plant photosynthesis and
adjusts the activity of enzymes. So the concentration of manganese in culture medium might affect the growth and
metabolize of microalgae. The aim of this work is to investigate the effect of different concentration of Mn on the
growth, lipid accumulation and fatty acid composition of S. obliquus DHD-3. The results show that the concentra-
tion of Mn will influence the growth and accumulation of chlorophyll. Too high or too low are both not good for S.
obliquus growth, accumulation of chlorophyll and lipid. The maximum biomass and lipid content of S.obliquus
DHD-3 were 2.9 g/L and 55.1% of dry cell weight, respectively after a 14-day incubation with an initial Mn ion
concentration of 2.72 mg/L. The cellular lipid content was increased 11% compared with control group. At the
meantime, the maximum lipid yield was 1.6 g/L, which was increased 14% compared with control group. In con-
trast, the concentration of Mn didin’t affect the fatty acid composition of S. obliquus.

(本文编辑:康亦兼)