全 文 ：季 祥，成 杰，廖利民，等． 1 株斜生栅藻扩大培养条件的优化［J］． 江苏农业科学，2015，43(10) :303 － 305．
doi:10． 15889 / j． issn． 1002 － 1302． 2015． 10． 100
1 株斜生栅藻扩大培养条件的优化
季 祥1，2，成 杰2，廖利民2，巩东辉2，蔡 禄2，齐 云1，陈冠益1*
(1．天津大学环境科学与工程学院，天津 300072;2．内蒙古科技大学生物工程与技术研究所，内蒙古包头 014010)
摘要:为了促进微藻快速生长、提高微藻生物量，在试验室条件下对 1 株含油量相对较高、长势较好的斜生栅藻进
行 10 L扩大培养，并通过单因素和正交试验对 4 种主要营养盐进行优化。结果表明，在扩大培养的 10 L反应器中，斜
生栅藻的最适生长条件为:NaNO3 1． 0 g /L、K2HPO4·3H2O 0． 10 g /L、MgSO4·7H2O 0． 100 g /L、FeCl3·6H2O
0． 008 g /L，斜生栅藻在该优化后的 10 L 培养基中生长情况良好，且最大生物量(D680 nm)可达 1． 91，分别是 10 L －
BG11、250 mL － BG11 条件下的 1． 20、1． 28 倍。
关键词:斜生栅藻;扩大培养;生物量;生长条件;优化
中图分类号:Q968． 4 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2015)10 － 0303 － 03
收稿日期:2014 － 10 － 22
基金项目:内蒙古自治区重大基础研究开放课题(编号:20120908) ;
内蒙古自治区教育厅自然科学基金重点项目(编号:NJZZ14162) ;
内蒙古自治区自然科学基金(编号:2015MS0335) ;天津市海洋局
科技兴海项目(编号:KX2010 － 0005)。
作者简介:季 祥(1978—) ，男，内蒙古包头人，硕士，副教授，主要从
事生物质能、能源微藻研究。Tel: (0472)5951554;E － mail:jixiang
@ imust． cn。
通信作者:陈冠益，博士，教授，主要从事生物质能源、废弃物资源化
利用、污泥能源化研究。E － mail:leexer@ 163． com。
随着人类社会资源的短缺和环境问题的日益突出，世界
各国正面临着能源匮乏和生态环境破坏的危机，因此寻求一
种新型的可再生能源成为世界各国科学家普遍关注的科学问
题和发展趋势［1］。生物柴油是清洁的、环境友好的可再生能
源，但由于其原材料成本较高，目前生物柴油的价格仍高于传
统柴油。而在众多的能源微生物中，微藻具有种类繁多、光合
利用度高、自身合成油脂能力强等优点［2］。利用藻类油脂生
产生物柴油具有缓解温室效应，不与人争粮、不与粮争地的众
多优点，通过微藻油转化生产生物柴油具有广阔的开发利用
前景。为了快速获得较大的微藻生物量，对微藻的扩大培养
显得至关重要，而在不同反应器中，微藻对营养盐的需求也不
一样。因此，笔者对试验室的 1 株含油量较高的斜生栅藻进
行了 10 L扩大培养研究，对其生长条件进行了优化，最大限
度地提高该藻的生物量，为其工业化生产应用提供理论依据。
1 材料与方法
1． 1 藻种来源
试验藻种为斜生栅藻(Scenedesmus obliquus) ，保存于内蒙
古自治区生物质能源化利用重点实验室。
1． 2 培养条件
试验采用 10 L 广口瓶为反应器，以前期工作［3］改进的
BG11 培养基作为基础培养基，装液量为 7 L，接种量 5%，置
于环境温度(25 ± 1)℃、光照强度 5 000 lx、光照周期
14 L /10 d的条件下培养。
1． 3 微藻生物量的测定
微藻生物量的测定采用浊度比色法［4］。本试验采用 752
紫外可见分光光度计，在波长 680 nm处测定培养液的吸光度
(D680 nm) ，试验结果数据采用 SPSS Statistics 17． 0、Origin Pro
8． 0 和 Microsoft Office Excell 2007 软件进行分析处理。
1． 4 斜生栅藻生长条件的优化
1． 4． 1 4 种主要营养盐单因子试验 试验对影响斜生栅藻
生长最主要的 N、P、Mg、Fe营养盐进行研究，在接种前 1 d 分
别换上不加 N、P、Mg、Fe 营养盐的改进 BG11 培养基，培养
24 h 后按 0、0． 5、1． 0、1． 5、2． 0 g /L 的质量浓度加入 NaNO3，
按 0、0． 06、0． 08、0． 10、0． 12、0． 14 g /L 的质量浓度加入
K2HPO4·3H2O，按 0、0． 050、0． 075、0． 100、0． 125 g /L 的质量
浓度加入 MgSO4·7H2O，按 0、0． 002、0． 004、0． 006、0． 008、
0． 010 g /L的质量浓度加入 FeCl3·6H2O。每组均作 3 个平行
试验，待微藻处于稳定生长期，取最大的 D680 nm平均值，考察
在不同浓度的 N、P、Mg、Fe 营养盐条件下斜生栅藻的生长
情况。
1． 4． 2 正交试验 在单因素试验的基础上进行正交试验，按
表 1 因素水平表中各水平分别加入 NaNO3、K2HPO4·3H2O、
MgSO4·7H2O和 FeCl3·6H2O营养盐，参照正交试验法
［5］选
用 L9(3
4)设计进行正交试验。
表 1 斜生栅藻生长条件的优化 L9(34)正交试验因素水平
水
平
各营养盐的质量浓度(g /L)
A:NaNO3 B:K2HPO4·3H2O C:MgSO4·7H2O D:FeCl3·6H2O
1 0． 5 0． 05 0． 075 0． 004
2 1． 0 0． 10 0． 100 0． 006
3 1． 5 0． 15 0． 125 0． 008
2 结果与分析
2． 1 NaNO3 对斜生栅藻生长的影响
微藻在增殖过程中需要营养物质，氮是微藻体内许多重
要有机化合物的组成成分之一，在许多方面影响植物的代谢
—303—江苏农业科学 2015 年第 43 卷第 10 期
过程和生长发育。其中，氮是微藻细胞蛋白质叶绿素的组成
成分，是组成核酸的重要元素之一，同时微藻体内的各种生物
酶也含有氮［6］。微藻在生长过程中通常能利用铵盐、硝酸盐
及尿素作氮源，本试验以 NaNO3 为氮源，在培养基中加入不
同质量浓度的 NaNO3，考察不同质量浓度的 NaNO3 在 10 L培
养体系中对斜生栅藻生长的影响，结果如图 1 所示。
从整体上看，随着 NaNO3 质量浓度的不断增加，斜生栅
藻的生物量呈现出先上升后下降的趋势。利用软件分析可
知，NaNO3 质量浓度与斜生栅藻生物量呈极显著正相关
(P ＜ 0． 01) ，且各组间生物量差异显著(P ＜ 0． 05)。当
NaNO3 质量浓度为 0 时，生物量最低;随着 NaNO3 质量浓度
的增加，栅藻生物量逐渐上升，当质量浓度为 1． 0 g /L 时，斜
生栅藻生物量在各组间最大，D680 nm为 1． 59，而持续增加
NaNO3 质量浓度并不能促进微藻的生长，生物量开始逐渐降
低，说明过高质量浓度的 NaNO3 会抑制斜生栅藻的生长。由
此得出，NaNO3 最适质量浓度为 1． 0 g /L(图 1)。
2． 2 K2HPO4·3H2O对斜生栅藻生长的影响
磷是植物生长发育心需的营养元素之一，是微藻体内许
多有机化合物的组成成分，同时磷以多种方式参与微藻体内
的各种代谢过程，是生物体内 ATP、GTP、核酸、磷脂、辅酶等
化合物合成的基本元素，在微藻生长发育中起重要的作用。
本试验以 K2HPO4·3H2O 为磷源，研究不同质量浓度的
K2HPO4·3H2O对斜生栅藻生长的影响，结果如图 2 所示。
由图 2 可知，K2HPO4·3H2O质量浓度在 0 ～ 0． 14 g /L范
围内均能促进斜生栅藻生长，且生物量与其呈极显著正相关
(P ＜ 0． 01)。当 K2HPO4·3H2O 质量浓度为 0 ～ 0． 10 g /L
时，磷盐对斜生栅藻生物量的促进作用明显，同时在 0． 10 g /L
时生物量达到最大;而当 K2HPO4·3H2O 质量浓度大于
0． 10 g /L 时，该藻的生物量呈现下降趋势，但随着磷盐质量
浓度缓慢增加，栅藻生长表现出一定的耐受性。因此，在 10 L
培养体系中，斜生栅藻的 K2HPO4·3H2O 最适质量浓度
为 0． 10 g /L。
2． 3 MgSO4·7H2O对斜生栅藻的生长影响
镁是叶绿素的组成成分，在叶绿素合成和光合作用中起
重要作用［7］，镁还参与生物体内的氮代谢和活性氧代谢。在
试验中选取 MgSO4·7H2O提供镁元素，研究不同质量浓度的
Mg2 +对斜生栅藻扩大培养时生长的影响，试验结果如图 3
所示。
由图 3 可知，斜生栅藻在不同质量浓度的 MgSO4·7H2O
条件下所达到的最大生物量有所差异。当培养液中不含镁
时，斜生栅藻生物量较低，当培养液中镁元素存在时，可见其
生物量迅速增加，由软件分析可知，镁质量浓度与微藻生物量
是显著正相关的(P ＜ 0． 01) ，同时含有 Mg2 +与缺镁条件下的
生物量差异显著(P ＜ 0． 05)。而当 MgSO4·7H2O 质量浓度
达 0． 05 g /L后，生物量表现出一定程度的先下降后上升的趋
势，但趋势较缓，增量不明显，差异也不显著(P ＞ 0． 05)。这
可能主要是由于培养液中持续镁质量浓度的增加，对微藻生
长产生了一定的抑制作用，同时由于微藻机体自身的耐受能
力，在微藻适应了较高质量浓度下的 Mg2 +后，出现一定程度
的生长现象，可以推测后续持续增加镁质量浓度会造成微藻
生物量急剧降低。综合以上分析结果可知，0． 100 g /L 为
MgSO4·7H2O 的最适质量浓度。
2． 4 FeCl3·6H2O对斜生栅藻生长的影响
铁元素在微藻生理上有重要作用，是一些重要的氧化 －
还原酶催化部分的组分。铁虽然不是叶绿素的组成成分，但
缺铁时，叶绿体的片层结构发生很大变化，严重时甚至使叶绿
体发生崩解。而且铁在微藻体内以各种形式与蛋白质结合，
作为重要的电子传递体或催化剂参与许多生命活动。本试验
以 FeCl3·6H2O为铁盐，考察不同质量浓度的 Fe
3 +对斜生栅
藻扩大培养时生长的影响，试验结果如图 4 所示。
—403— 江苏农业科学 2015 年第 43 卷第 10 期
由图 4 可知，尽管培养液中对 Fe3 +含量要求较低，但对
微藻生物量的影响很大。由软件分析结果可知，Fe3 +与斜生
栅藻生物量呈极显著正相关(P ＜ 0． 01)。当培养液中缺铁
时，斜生栅藻生物量较低;FeCl3·6H2O 的增加能够迅速促进
微藻生物量的积累，当 FeCl3·6H2O 质量浓度达 0． 006 g /L
时，生物量达到最高，D680 nm为 1． 59;而随着质量浓度的进一
步增加，微藻生物量开始降低，表现出抑制作用。说明适宜的
Fe3 +质量浓度能够促进微藻细胞增殖，有利于生物量积累。
因此，FeCl3·6H2O的最适质量浓度为 0． 006 g /L。
2． 5 4 种营养盐对斜生栅藻生长影响程度和优化水平组合
在不同条件下，斜生栅藻对营养盐的需求有很大的差异，
为了研究斜生栅藻在扩大培养时的最佳培养基配比，采用正
交设计对这 4 种营养盐进行多因子组合试验，按表 1 因素水
平表分别加入营养盐，在 10 L反应器中培养，结果见表 2。
表 2 4 种营养盐对斜生栅藻生长的影响正交试验结果
编号 A B C D D680 nm
1 1 1 1 1 1． 579
2 1 2 2 2 1． 723
3 1 3 3 3 1． 614
4 2 1 2 3 1． 845
5 2 2 3 1 1． 735
6 2 3 1 2 1． 752
7 3 1 3 2 1． 641
8 3 2 1 3 1． 678
9 3 3 2 1 1． 516
k1 1． 639 1． 688 1． 670 1． 610
k2 1． 777 1． 712 1． 695 1． 705
k3 1． 612 1． 627 1． 663 1． 712
Ｒ 0． 165 0． 085 0． 032 0． 102
由表 2 可知，4 种营养盐对斜生栅藻生长的影响程度从
大到小为 A ＞ D ＞ B ＞ C，即 NaNO3 质量浓度 ＞ FeCl3·6H2O
质量浓度 ＞ K2HPO4·3H2O 质量浓度 ＞ MgSO4·7H2O 质量
浓度，NaNO3 质量浓度水平对斜生栅藻生长的影响最大，其
次为 FeCl3·6H2O 质量浓度。通过分析 4 因素的均值可
知，4 种营养盐的最优水平组合为 A2B2C2D3，即 NaNO3、
K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeCl3·6H2O 的最佳质量浓
度为 1． 0、0． 10、0． 008 g /L，通过后续试验验证可知，斜生栅藻
在该优化条件下的生物量 D680 nm可达 1． 91，是各试验设计组中
最高的。此外，在正交试验中 4种营养盐的最适质量浓度与单
因素的最适质量浓度相吻合的有 NaNO3、K2HPO4·3H2O、
MgSO4·7H2O，而 FeCl3·6H2O较单因素试验中的质量浓度
不同，这可能是由于各因素的交互作用所致。因此，以正交试
验分析所得的最适优化组合培养基对斜生栅藻进行 10 L 扩
大培养，可以获得斜生栅藻的最大生物量。
2． 6 斜生栅藻在不同培养条件的生长情况
为了进一步验证斜生栅藻 10 L 扩大培养的最佳营养盐
条件，将经正交试验所得的营养盐条件与 BG11 基础培养条
件分别在 250 mL以及 10 L培养体系下进行微藻整个生长周
期的培养，试验结果如图 5 所示。
由图 5 可知，斜生栅藻均能在 3 种不同培养条件下生长，
总体生长趋势相当，前 6 d为调整期，6 ～ 15 d 为对数生长期，
18 d以后斜生栅藻逐渐进入到稳定生长期，27 d 后藻细胞开
始衰亡;在优化后的10 L培养体系条件下，斜生栅藻生长趋
势明显好于其余 2 组，且稳定期收获的生物量最大，D680 nm可
达 1． 91，远高于 10 L － BG11、250 mL － BG11 条件下的 D680 nm
(1． 58)、D680 nm(1． 48) ，分别是该 2 组的 1． 20、1． 28 倍。此
外，在外界环境条件、营养盐条件相同的情况下，微藻反应体
系对其生长影响较大，250 mL体系生物量小于 10 L 体系，这
可能是由于较大反应器更有利于微藻的生长繁殖，特别是在
微藻生长繁殖后期，由于微藻细胞密度不断增大，光遮蔽效应
日益明显，微藻生长对环境空间以及营养盐的需求表现得更
加突显。
3 结论
在单因素试验中，NaNO3、K2HPO4 · 3H2O、MgSO4 ·
7H2O、FeCl3·6H2O 的最佳质量浓度为 1． 0、0． 10、0． 100、
0． 006 g /L。在 10 L 反应体系中，NaNO3、K2HPO4·3H2O、
MgSO4·7H2O、FeCl3·6H2O 的最佳质量浓度为 1． 0、0． 10、
0. 10、0． 008 g /L。后续试验证明，斜生栅藻在 10 L －优化培
养中的生物量远高于 BG11 基础培养基，分别是 10 L － BG11、
250 mL － BG11 培养条件的 1． 20、1． 28 倍，同时 10 L 反应体
系更利于微藻生长繁殖和生物量的积累，该研究也为微藻的
扩大培养提供了依据。
参考文献:
［1］Brennan L，Owende P． Biofuels from microalgae － a review of technol-
ogies for production，processing，and extractions of biofuels and
co － products［J］． Ｒenewable and Sustainable Energy Ｒeviews，
2010，14(2) :557 － 577．
［2］Singh A，Nigam P S，Murphy J D． Ｒenewable fuels from algae:an
answer to debatable land based fuels［J］． Bioresource Technology，
2011，102(1) :10 － 16．
［3］季 祥，王金荣，丁 潇，等． 一株斜生栅藻的筛选及生长条件的
优化［J］． 水产科技情报，2010，37(6) :265 － 268．
［4］Mandotra S K，Kumar P，Suseela M Ｒ，et al． Fresh water green
microalga Scenedesmus abundans:a potential feedstock for high quality
biodiesel production［J］． Bioresource Technology，2014，156(101) :
42 － 47．
［5］倪海儿． 生物试验设计与分析［M］． 北京:科学出版社，2013:
156 － 160．
［6］Seppl J，Tamminen T，Kaitala S． Experimental evaluation of
nutrient limitation of phytoplankton communities in the Gulf of Ｒiga
［J］． Journal of Marine Systems，1999，23(1 /2 /3) :107 － 126．
［7］Huber S C，Maury W． Effects of magnesium on intact chloroplasts
［J］． Plant Physiol，1980，65:350 － 354．
—503—江苏农业科学 2015 年第 43 卷第 10 期