全 文 ：浙江农业学报 Acta Agriculturae Zhejiangensis，2014，26(1):72-76 http:/ /www． zjnyxb． cn
杨光，金桂花，董俊，等． 状元红葡萄的脱毒与快繁技术研究［J］．浙江农业学报，2014，26(1):72-76．
DOI:10. 3969 / j． issn． 1004-1524. 2014. 01. 13
收稿日期:2013-06-13
作者简介:杨光(1981—)，男，辽宁营口人，助理研究员，硕士研
究生，主要从事设施蔬菜栽培等研究。E-mail:hahaha0604@ 163．
com
状元红葡萄的脱毒与快繁技术研究
杨 光，金桂花，董 俊，张 青，龚 娜
(辽宁省农业科学院 园艺分院，辽宁 沈阳 110161)
摘 要:以状元红葡萄为材料，选取秋季副梢的茎尖为外植体，通过直接诱导丛生芽进行快速繁殖，同时运
用热处理和茎尖培养相结合诱导葡萄脱毒苗。脱毒技术研究结果表明，1 /2MS培养基比 MS培养基的芽诱导
率高。适宜的启动培养基为 1 /2MS + 2. 0 mg·L －1 6-BA + 0. 1 mg·L －1 IBA，诱导效果最好。无根苗接种于 1 /
2MS + 0. 5 mg·L －1 IBA + 0. 2 mg·L －1 NAA的培养基中，生根快，不定根发育良好，利于移栽。其中热处理时间
以 10 d为宜，这样有利于无根苗的生长和脱毒;经过热处理的无根苗，脱毒率达 100%。
关键词:葡萄;茎尖;脱毒;快繁
中图分类号:S 663. 1 文献标志码:A 文章编号:1004-1524(2014)01-0072-05
Study on virus-free and rapid propagation techniques of Zhuangyuanhong grape
YANG Guang，JIN Gui-hua，DONG Jun，ZHANG Qing，GONG Na
(Ｒesearch Horticulture Branch，Liaoning Academy of Agricultural Sciences，Shenyang 110161，China)
Abstract:Zhuangyuanhong grape was used as experimental material，the shoot tips of stem apexes were selected as
explants，which reproduced rapidly through directly inducing cluster buds，then the methods of heat treatment and tip
culture were combined to induce virus-free grape． The results showed that shoots induction rate in medium 1 /2MS
was higher than MS． The best inducing effects was found in the medium of 1 /2 MS + 2. 0 mg·L －1 6-BA + 0. 1 mg·
L －1 IBA． Ｒootless plantlets inoculated in the medium of 1 /2MS + 0. 5 mg·L －1 IBA + 0. 2 mg·L －1 NAA grew quickly
and the growth of adventitious root was good，which were ready for transplanting． The optimal heat treatment time was
10 days which was beneficial for growth and virus elimination of rootless plantlets． After the heat treatment，100%
target viruses in the rootless plantlets were taken off．
Key words:grape;shoot tip;virus elimination;rapid propagation
近年来，随着科学技术的快速发展，应用生
物技术快速培育种苗已在果树、花卉、蔬菜、林木
等领域得到广泛的应用。葡萄是我国重要的水
果，在长期无性繁殖过程中，感染并积累了多种
病毒，是果树中感染病毒病最多的树种之一，其
感染的病毒种类多，分布广，危害大，受到全世界
的关注［1］。在当今技术水平下，病毒病害不能用
药剂进行有效防治，葡萄的脱毒培养和无病毒栽
培是防治葡萄病毒病的有效措施。目前，采用较
多的是热处理脱毒法、茎尖培养脱毒法、热处理
结合茎尖培养脱毒法、茎尖微芽嫁接技术法、抑
制剂结合茎尖培养脱毒法等方法［2］。其中，热处
理结合茎尖培养脱毒法是目前应用最多最有效
的方法，脱毒率比其他几种都高。
本试验是针对目前科学研究生产上的迫切
要求，更进一步促进葡萄组织培养技术的研究，
以状元红葡萄为材料，对影响状元红葡萄离体快
繁的若干因素进行试验，用热处理结合茎尖组织
培养脱毒法进行脱毒，探讨状元红葡萄脱毒苗的
良种繁育途径的建立，为状元红葡萄建立快繁体
系和无病毒种苗的工厂化生产提供科学理论依
据和一般技术。
1 材料与方法
1． 1 材料
试验于 2012 年 5—12 月在辽宁省农业科学
院创新中心实验室完成。葡萄培养试材取自辽
宁省农业科学院葡萄园内，供试品种为状元红。
选取秋季副梢的茎尖为外植体，进行组织培养诱
导试管苗，再取试管无根苗进行脱毒试验。
1． 2 试验方法
1． 2. 1 茎尖分生组织培养
外植体的选择与消毒:分别采集长约 3 ～ 5
cm 嫩芽作为外植体，在流动的自来水下冲洗 3
h，再用洗洁精浸泡约 10 min，用自来水冲洗干
净，在超净工作台上用 75%酒精表面消毒 30 s，
然后用无菌水冲洗 3 遍;再用 0. 1%的升汞消毒 8
～ 10 min后，用无菌水冲洗 5 遍，最后用无菌滤
纸将其水分吸干备用。完成消毒后，取长约 1 cm
的含一个腋芽的茎段接种于事先准备好的培养
基上［3］。
培养基的配制:试验采用 MS，1 /2MS 和 B5
三种培养基，根据实验设计分别附加不同浓度的
6-BA，IBA，同时根据实际需要附加 3%的蔗糖和
0. 45%的琼脂，在进行防止褐化实验和生根培养
的时候再附加 0. 3%的活性炭，pH 值调至 5. 8 ～
6. 0，用高压锅灭菌 18 ～ 20 min备用。
1． 2. 3 培养条件
培养室温度为(25 ± 2)℃，光照强度为 1 500
～ 2 000 lx，光照时间为每天 12 h。
1． 2. 4 茎尖分生组织培养
(1)芽的诱导试验。将采集的状元红葡萄母
株上的嫩芽切成带腋芽的茎段或茎尖，接种于含
不同浓度的 6-BA，IBA 等激素组合的固体培养基
中，观察不同培养基、激素组合等因素对茎段(或
茎尖)芽形成的影响。
(2)芽的继代增殖试验。当芽长至 3 ～ 5 cm
高时，进行切段培养，观察不同激素组合对芽增
殖伸长的影响。
1． 2. 5 脱毒技术的研究
茎尖的获得:在超净台上取试管无根苗置于
体视显微镜载物台上，用解剖刀和解剖针逐层剥
去外层幼叶，切取含 1 ～ 2 个叶原基大小为 0. 5 ～
1. 0 mm 的茎尖接种于茎尖分化培养基中。
茎尖热处理:于生化培养箱中分别热处理 10
～ 15 d，白天 37℃处理 8 h，晚上 22℃处理 16 h，
光照强度 1 500 ～ 2 000 lx。
脱毒方法:(1)试管无根苗热处理脱毒法，将
试管无根苗进行变温处理，热处理 10 d 时，记录
其存活率，并剥取 0. 3 ～ 1. 0 mm的茎尖进行恒温
培养;热处理 15 d时，同样记录无根苗的存活率，
剥取 0. 3 ～ 1. 0 mm的茎尖进行恒温培养，最后将
进行过热处理的茎尖长至 1. 5 ～ 3. 0 cm 时，检测
其脱毒率。(2)芽增殖诱导，剥取 0. 3 ～ 1. 0 mm
的茎尖接种于固体培养基中，附加不同浓度的 6-
BA和 IBA，诱导成芽，当芽分化产生健壮的 2 ～ 3
cm 的试管苗时进行切割，然后把其转入增殖培
养基中进行增殖培养。接种后，观察小苗的生长
动态。
1． 3 组培苗的生根、移栽
1． 3. 1 组培苗的生根培养
待试管苗长至 3 ～ 5 cm 时，取健壮的小植株
转接于 1 /2MS 培养基中，附加不同浓度的 6-BA，
IBA 和活性炭，观察它们对生根的影响。
1． 3. 2 组培苗的移栽
接种后，每周观察根的生长情况，根数达 3 ～
5 条，根长 1 ～ 2 cm 时，即可进行炼苗。炼苗时，
将三角瓶上捆扎的牛皮纸揭开再将其转到培养
室温度较低的地方，最好有散射的太阳光，炼苗
约一周即可移栽。移栽时用的基质是蛭石和珍
珠岩各一半的混合物。移栽时，用自来水轻轻洗
去植株根部的培养基，洗好后放入 3%高锰酸钾
水溶液中泡几秒钟，再用镊子将苗移入基质中。
移入后浇透水，用塑料薄膜盖好，并在塑料薄膜
上打些小孔，以利于空气交换，将其放到温室中，
一周后逐渐揭去塑料薄膜。
2 结果与分析
·37·杨 光，等． 状元红葡萄的脱毒与快繁技术研究
2． 1 不同培养基对茎段发芽的影响
以 MS，1 /2MS，B5 为基本培养基，三种培养
基均加入相同浓度的 2. 0 mg·L －1 6-BA和 0. 2 mg
·L －1 IBA，接种状元红的无菌外植体茎段，进行腋
芽萌发离体培养，结果表明，不同培养基的茎段
腋芽萌发率存在差异(表 1)。从表 1 可以看出，
腋芽萌发率在 1 /2MS 培养基最高，萌发率为
63%;B5 培养基次之，萌发率为 53%;MS 培养基
最低，萌发率为 46%;此外，在 B5 和 1 /2MS 培养
基上萌发的嫩芽生长较为正常，而在 MS 培养基
上萌发的嫩芽，大多生长较弱。故选定1 /2MS培
养基为芽诱导基本培养基。MS 培养基无机盐及
铵态氮含量较高，而 B5 培养基铵态氮较低，1 /
2MS培养基无机盐含量是 MS 的 1 /2，这些低盐
因素有利于减少组织的褐化;同时，1 /2MS 的肌
醇含量也较低，适当降低肌醇对绝大多数葡萄品
种都是有利的［4］。
表 1 不同培养基对葡萄诱导的影响
Table 1 Effects of different culture media on the inducing
differentiation of grape
处理 接种数 萌发数 萌发率 /%
MS培养基 30 14 46
1 /2MS培养基 30 19 63
B5 培养基 30 16 53
2． 2 不同植物生长调节剂对茎段腋芽萌发的影响
以状元红葡萄茎段为外植体，接种到附加了
不同种类、不同浓度的植物生长调节剂的 1 /2MS
培养基中 30 d后观察培养情况，结果见表 2。结
果接种到第 4，10 号培养基上的外植体，诱导率
分别达到了 73. 3%和 80. 0%。两种培养基上的
外植体接种 10 ～ 15 d 后，茎段腋芽开始膨大，20
d后形成肉眼可见的芽点，25 ～ 30 d 开始长出明
显的单芽，个别长成 2 个单芽。接种在 1，2，3，5，
6 号培养基上的，萌芽率均低于接种在 4，10 号培
养基的，况且萌发时间较长;接种在 12，13 号培
养基上的外植体，5 ～ 10 d 后逐渐脱分化并形成
愈伤组织，20 d 后愈伤组织长大且非常明显，只
有小部分茎段能正常萌芽，但是芽长得比较慢，
且长势较弱。可见，4，10 号培养基是状元红葡萄
诱导芽的最佳激素组合，其中 10 号最好。试验
结果表明，细胞分裂素 6-BA浓度较低的时候，芽
启动慢，且萌芽率不高;细胞分裂素 6-BA 浓度达
到 2. 0 mg·L －1以上的时候，茎段易形成愈伤组
织，从而影响其萌芽率。只有细胞分裂素 6-BA
保持在一定浓度范围内(即 1. 0 ～ 2. 0 mg·L －1)的
时候才可以促进状元红葡萄腋芽更好地萌发。
细胞分裂素和生长素对于离体培养的组织和细
胞的增殖、分化、芽和根的诱导以及胚体形成起
着关键的作用。选用不同的激素种类以及调节
各类激素之间的比例能够诱导培养物形成营养
芽、花芽、根或者胚状体。当细胞分裂素的浓度
相对高于生长素的浓度时，培养物形成芽［5］。
表 2 不同植物生长调节剂对茎段腋芽萌发的影响
Table 2 Effects of different media on adventitious buds of
grape
编号 培养基添加的生长调节剂 接种
数
萌发
数
萌发
率 /%
1 0. 5 mg·L －1 6-BA + 0. 1 mg·L －1 IBA 30 20 67. 0
2 0. 5 mg·L －1 6-BA + 0. 5 mg·L －1 IBA 36 20 55. 0
3 0. 5 mg·L －1 6-BA + 1. 0 mg·L －1 IBA 30 18 60. 0
4 1. 0 mg·L －1 6-BA + 0. 1 mg·L －1 IBA 30 22 73. 3
5 1. 0 mg·L －1 6-BA + 0. 5 mg·L －1 IBA 26 13 50. 0
6 1. 0 mg·L －1 6-BA + 1. 0 mg·L －1 IBA 27 16 59. 2
7 1. 5 mg·L －1 6-BA + 0. 1 mg·L －1 IBA 26 18 69. 2
8 1. 5 mg·L －1 6-BA + 0. 5 mg·L －1 IBA 23 13 56. 5
9 1. 5 mg·L －1 6-BA + 1. 0 mg·L －1 IBA 32 20 62. 5
10 2. 0 mg·L －1 6-BA + 0. 1 mg·L －1 IBA 35 28 80. 0
11 2. 0 mg·L －1 6-BA + 0. 5 mg·L －1 IBA 30 16 53. 3
12 2. 0 mg·L －1 6-BA + 1. 0 mg·L －1 IBA 30 18 60. 0
13 3. 0 mg·L －1 6-BA + 1. 0 mg·L －1 IBA 30 16 53. 3
2． 3 不同激素组合对繁殖体增殖的影响
把状元红葡萄诱导长成的第一代嫩芽，剪切
成带 2 ～ 3 个叶片的芽段或切成带 2 个芽的芽
丛，分别接种到表 3 的继代培养基中，培养 25 d
后测定。结果见表 3，在 1 /2MS + 2. 0 mg·L －1 6-
BA +0. 1 mg·L －1 IBA培养基中培养，繁殖系数最
高为 4. 0，而且芽分化多。在 IBA 0． 3 ～ 0． 5 mg·
L －1水平下，6-BA 浓度由 1. 0 mg·L －1升至 2. 0 mg
·L －1时，繁殖系数呈上升趋势，在培养中还观察
到这种情况下极易诱导形成愈伤组织以及玻璃
化苗的发生，丛芽矮小密集。在 IBA 0． 3 ～ 0． 5
mg·L －1水平下，6-BA 浓度由 0. 5 mg·L －1升至
1. 0 mg·L －1时，繁殖系数增加，分化丛芽趋势增
强，在培养中同时观察到愈伤组织和玻璃化现象
发生不明显，小芽趋于上长，高度可达 2 cm。6-
·47· 浙江农业学报 第 26 卷 第 1 期(2014 年 1 月)
BA浓度为 1. 5 mg·L －1，IBA 浓度为 0. 3 mg·L －1
时，继代繁殖系数达到 3. 8，小芽生长较健壮，节
间短，长势较理想，继代周期 25 d，是状元红葡萄
继代培养的适宜浓度。因此，状元红继代培养的
最适宜激素浓度组合配比是 1. 5 mg·L －1 6-BA +
0. 3 mg·L －1 IBA。
表 3 不同激素组合对试管苗增殖的影响
Table 3 Effects of different combinations of hormone on
proliferation of grape plantlets
激素组合 接种
数
萌发
数
萌发
率 /%
增殖
倍数
0. 5 mg·L －1 6-BA + 0. 3 mg·L －1 IBA 30 20 66 2. 8
0. 5 mg·L －1 6-BA + 0. 5 mg·L －1 IBA 30 18 60 2. 7
1. 0 mg·L －1 6-BA + 0. 3 mg·L －1 IBA 30 21 70 3. 0
1. 0 mg·L －1 6-BA + 0. 5 mg·L －1 IBA 30 24 80 3. 0
1. 5 mg·L －1 6-BA + 0. 3 mg·L －1 IBA 30 26 86 3. 8
1. 5 mg·L －1 6-BA + 0. 5 mg·L －1 IBA 30 26 86 3. 8
2. 0 mg·L －1 6-BA + 0. 1 mg·L －1 IBA 30 26 86 4. 0
3. 0 mg·L －1 6-BA + 0. 1 mg·L －1 IBA 30 16 79 3. 5
2． 4 热处理对茎尖脱毒效果的影响
取分别经过 10 d 和 15 d 热处理的无根苗剥
取 0. 8 mm大小的茎尖进行培养，剥取其茎尖进
行培养，成活率较高。最后进行鉴定，发现热处
理 10，15 d 后再剥取茎尖进行培养，脱毒率达到
100%，因此，热处理结合茎尖培养是获得无毒葡
萄苗的最好途径，结果见表 4。
表 4 热处理对葡萄茎尖的脱毒效果
Table 4 Effects of different time of heat treatment on virus-
free rate of grape plantlets
热处理时间
/d
接种茎尖
数 /个
成活茎尖
数 /个
无毒茎尖
数 /个
脱毒
率 /%
0 30 28 24 93. 33
10 30 25 25 100
15 30 21 21 100
2． 5 不同培养基对脱毒苗生根的影响
试验将 2 ～ 3 cm 以上的芽苗切离原组织转
移到含不同培养基组合上诱导生根，20 d 后统
计生根率，结果见表 5。从表 5 可以看出，尽管
芽苗在 3 种培养基组合中生根率均达 100%，但
芽苗在 0. 5 mg·L － 1 IBA + 0. 2 mg·L － 1 NAA 的
培养基组合中生根效果较好，根粗且多，有须
根，苗壮。
表 5 不同培养基组合对葡萄芽苗生根的影响
Table 5 Effects of different medium on rooting of grape
seedling
激素组合 接种
数
生根
数
生根
率 /%
生根状况
0. 5 mg·L －1 NAA 30 30 100 根细且少，苗一般
0. 5 mg·L －1 IBA +
0. 2 mg·L －1 NAA
30 30 100 根粗且多，有须根，
苗壮
0. 5 mg·L －1 IBA 30 30 100 根粗但少，苗壮
3 结论与讨论
目前植物的脱毒技术研究方法很多，但未见
关于状元红葡萄品种的组织培养的报道。本试
验采用了茎尖组织培养结合热处理的方法对状
元红葡萄的主要病毒进行脱除，取得了初步见
效。在本试验中，以 1 /2MS + 2. 0 mg·L －1 6-BA
+0. 1 mg·L －1 IBA 的固体培养基对其茎尖的培
养效果较好，芽点转绿快，芽伸长也快，存活率
高;在茎尖组织培养时，植物激素种类和数量对
茎尖生长和发育具有重要作用，当然不同植物茎
尖对植物激素的反应也各不相同。因此葡萄培
养体系的建立要尽早进行，以提高培养诱导率。
由于植物分生组织几乎不含病毒或含病毒
很少，因此利用茎尖进行组织培养是脱除病毒的
一个有效途径。为同时保证较高的成活率和脱
毒效果，状元红葡萄热处理时间应选择在 10，15
d;剥取茎尖的大小直接影响茎尖存活率和脱毒
率高低，一般剥取 0. 8 ～ 1. 0 mm的茎尖就可以获
得理想的存活率，且脱毒效果也很好;不同植物
及不同病毒种类所需茎尖大小是不同的，研究表
明，通常茎尖脱毒效果的好坏与茎尖大小呈负相
关，而茎尖成活率的高低与茎尖大小呈正相
关［6］。此外，适当高温可部分或全部钝化植物组
织中的病毒，因此，通过热处理可以得到无病毒
组织。林治良等［7］利用感病株苗在热处理和微
茎尖培养后，进行脱除花叶病毒的试验研究，结
果表明，用 0. 8 ～ 1. 0 mm 培养，通过 38. 5℃热处
理 1 周后，切取 2 mm微茎尖培养，其脱毒效果最
好，其脱毒率和成活率均为 100 %。因此，本试
验以试管苗为材料，采用 38℃热处理 7 d 后，切
取 0. 7 ～ 1. 0 mm微茎尖进行培养，35 d后理论上
·57·杨 光，等． 状元红葡萄的脱毒与快繁技术研究
可形成葡萄无病毒苗。状元红葡萄的生根比较
容易，1 /2MS 培养基上附加 0. 5 mg·L －1 IBA +
0. 2 mg·L －1 NAA 则可以获得较好的生根效果，
根系粗壮，利于移栽。
参考文献:
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(责任编辑 张 韵)
·67· 浙江农业学报 第 26 卷 第 1 期(2014 年 1 月)