全 文 ：栅藻对金属离子的异质敏感性与其细胞周期的关系
于洋1 , 2 ,孔繁翔1＊ ,史小丽1
(1.中国科学院南京地理与湖泊研究所 ,南京　210008;2.南京大学环境学院环境污染与资源化研究国家重点实验室 ,南京
210093)
摘要:研究同一种群中不同状态的藻细胞对毒物的应答对理解生物体敏感性以及毒物的致毒机理十分重要.应用流式细胞技
术研究了栅藻对重金属元素(Cd2+和 Ni2+)的敏感性.将同一种群的栅藻细胞按其体积大小(FSC 参数)分为不同组分 ,在暴露
于毒物后分析不同组分细胞的酯酶活性.结果显示随着细胞体积的增加 ,其对 2 种金属离子的抗性逐渐增强.在分析各组分细
胞的 DNA 量时发现栅藻的细胞大小与其所处的细胞周期具有一定关系:随着体积的增大 , 栅藻细胞逐渐从 G1 期进入G 2/M
期 ,其中 , G 2/M 期的藻细胞对金属离子具有较强的抗性.进一步表明处于不同的细胞周期可能是决定同一种群中栅藻细胞对
金属离子具有不同敏感性的重要原因.
关键词:栅藻;异质敏感性;酯酶活性;细胞周期;流式细胞技术
中图分类号:X524　文献标识码:A　文章编号:0250-3301(2006)06-1197-04
收稿日期:2005-06-16;修订日期:2005-07-19
基金项目:国家重点基础研究发展规划(973)项目(2002CB412300);
中国科学院南京地理与湖泊研究所所长基金项目
(S250016)
作者简介:于洋(1976～ ),男,博士研究生 ,主要研究方向为分子生态
毒理学 , E-mail:nju-yuyang@yahoo.com
＊通讯联系人 , E-mail:kongfx@jlonline.com
Relationship of Heterogeneous Sensitivity to Metal Ion and Its Cell Cycle in
Scenedesmus obliquus
YU Yang 1 , 2 , KONG Fan-xiang1 , SHI Xiao-li1
(1.Nanjing Institute of Geog raphy and Limnology , Chinese Academy of Sciences , Nanjing 210008 , China;2.State Key Laboratory
of Po llution Control and Resource Reuse , School of the Environment , Nanjing University , Nanjing 210093 , China)
Abstract:I t is impor tant to investigate the effect o f contamination on the heterogeneous cells characteristically observed within sing le
algae species , which can be helpful to understand the sensitivity of org anism and the tox icity mechanism.F low cy tome try w as used to
assess sensitivity to metal ion(Cd2+ and Ni2+)in Scenedesmus obliquus.By determination o f esterase activity in cell fractions gated
by FSC(an indicato r of the cell volume), it was shown that the resistance to metal ion w as improved as the cell volume increased.By
simultaneously examining FSC and DNA content , a relationship be tw een the cell volume and the cell cy cle stage was observed:as the
cell volume increased , the S .obliquus cells changed from G 1 phase to G 2/M phase.The cells in G2/M phase had more resistance to
metal ion.Thus , this observation indica te that the difference of cell cy cle may be the impor tant cause of heterogeneous sensitivity to
metal ion in S .obliquus.
Key words:Scenedesm us obliquus;heterogeneous sensitivity;ester ase activity;cell cy cle;flow cy tometry
　　藻类毒性试验被广泛的应用于评估水生态系统
中污染物对生物的潜在影响.目前标准测试方法所
检测的往往是同一批细胞对污染物的综合效应 ,对
细胞间的差异几乎没有考虑.在实验中其实存在着
这样一个假设:处于对数期的实验细胞均处于同样
的生理状态及毒物敏感性 ,尽管这样的假设事实上
并不成立(例如不同细胞可能处于细胞的不同周
期)[ 1 , 2] .然而由于现有的检测条件限制 ,很难将同
一种群中具有异质性的藻细胞有效区分 ,进而研究
不同状态的藻细胞对毒物的应答机制 ,国内外还未
见此类的研究报道.
流式细胞技术(FCM)是一种对处在液流中的
单个细胞同时进行多参数的快速定量分析和分选的
方法 ,操作过程简单且重复性好 ,近来也逐渐应用于
生态毒理学研究[ 3 ～ 6] .传统毒性试验往往在整体水
平上检测生物体对污染物的应答 ,其结果可能是靶
细胞整体水平的变化信息只是来自于其中一部分靶
细胞.而 FCM 可以在单细胞水平上检测靶细胞在
生理生化上细微的变化 ,同时获得到数万个细胞的
样本数据 ,为研究种群异质性提供了基础.本文应用
流式细胞技术 ,并以常用的毒性标志物酯酶作为指
标 ,对 Cd2+ 、Ni2+暴露下栅藻种群中不同类型细胞
的毒物敏感性进行了初步研究.
1　材料与方法
1.1　藻种及培养
实验所用斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)取自
第 27卷第 6期
2006 年 6 月 环　　境　　科　　学ENVIRONMENTA L SCIENCE
Vol.27 , No.6
Jun., 2006
DOI :10.13227/j.hjkx.2006.06.031
中国科学院南京地理与湖泊研究所 ,采用水生 4 号
培养基 ,在 250 mL 的三角瓶中加入体积为 100 mL
的培养液 ,培养温度为 26℃±1℃,光照为白色日光
灯 ,光照强度为1 500lx±500lx , 光暗比为 12/12 ,静
置培养 ,每天定时振荡数次.
1.2　暴露实验
实验中所用的 Cd2+ , Ni2+为分析纯 , Cd2+和
Ni2+的浓度约为预实验中酯酶活性 EC50的浓度 ,分
别为:160μg/L 和 400μg/L ,无菌条件下取对数期细
胞 2.5mL ,2 500r/min离心 7min ,重蒸馏水洗涤 ,反
复3次 ,接入培养基中 ,每个处理为 3个平行.初始
藻细胞密度为 105 个/mL , 于暴露后4h定时取样用
流式细胞仪测定.
1.3　藻细胞的体积 、酯酶活性及细胞周期分析
1.3.1　藻细胞计数与细胞大小检测
应用流式细胞仪 ,将非藻类颗粒或聚集细胞通
过固有参数及叶绿素荧光(FL3)的差异去除.藻细
胞在流式细胞图中的位置以侧向光散射(SSC)和叶
绿素荧光确定.细胞计数使用双组分绝对计数小球
(CALTAG Counting Beads , Caltag Laboraties Inc.,
CA),通过计算 2种小球的比例判断其与藻细胞的
混合均匀度 ,以保证计数的精度.藻细胞体积大小以
前向光散射(FSC)参数表征 ,按细胞大小平均分为 8
个组分 ,每个组分的细胞数不少于1 000个.
1.3.2　藻细胞的酯酶活性检测染色
通过 FDA(Fluorescein diacetate , Sigma)染色方
法对栅藻酯酶活性进行检测.将 FDA用丙酮稀释到
1mmol/L , -18℃保存.染色条件为:温育时间 8 ～
9min ,FDA浓度为 25μmol/L ,并加相同浓度丙酮作
空白对照.细胞在暴露 4 h 后取样 ,经 300目滤膜过
滤 ,上流式细胞仪检测.单个细胞的平均酯酶活性以
FDA 荧光强度均值(mean f luorescence intensity ,
MFI)[ 6 ,7]表示.
1.3.3　藻细胞 DNA检测染色
SYBR Green Ⅰ(Molecular Probes)用来对藻细
胞的细胞周期进行分析[ 8 , 9] .1mL 固定样品加入
0.1g/L RNAse(1∶1 RNAse A 和 B 的混合物 ,
Sigma),在 37℃下温育 30min.加入 0.9mL 的柠檬
酸钾(30mmol/ L),及 20μL 的 SYBR Green Ⅰ(1%,
溶于 DMSO),黑暗避光 20min.上流式细胞仪检测
SYBRGreen Ⅰ荧光.对酯酶及 DNA 含量的检测为
2次独立的过程.
1.4　流式细胞仪分析
应用 FACSVantage SE 流式细胞仪(Becton
Dickinson)对藻细胞进行测定.激光器为 Coherent
水冷氩离子激光器 ,激发波长为 488nm.产生的固有
信号包括前向光散射(FSC)及侧向光散射(SSC),分
别表征细胞大小和颗粒性质.其荧光信号通过 2个
检测通道被收集:FL1(530/30nm),接收 FDA 荧光
及 SYBR Green Ⅰ荧光 ,分别表征酯酶活性及 DNA
含量;FL3(675/20nm),表征叶绿素 a 含量.样品的
收集量为30 000个细胞 ,分析流速为 1μL/ s ,单样耗
时为 40s.
2　结果与讨论
2.1　金属敏感性与细胞大小的关系
毒物对生物体的效应往往最早表现为生物大分
子和生物化学水平上(如酯酶活性)的变化[ 6] ,进而
影响种群的代谢过程与生长.藻细胞生长后期还会
分泌胞外物质进入培养基 ,从而对生物的生长环境
造成一定影响[ 10 , 11] .因此试验在金属离子短期暴露
(4h)的后 ,以细胞的酯酶活性作为指标分析栅藻对
重金属元素毒性的敏感性.见图 1 ,在 Cd2+和 Ni2+
暴露 4h 后 ,将近一半比例的栅藻细胞 FDA 荧光强
度明显下降 ,显示出其酯酶活性受到了一定的抑制.
单个细胞平均酯酶活性的抑制率分别为健康细胞的
53%(Cd2+处理)和 67%(Ni2+处理).
图 1　4h Cd2+和 Ni2+暴露对栅藻酯酶活性的影响
Fig.1　Ef fect of Cd2+ and Ni2+on esterase act ivi ty of
S.obliqu us after 4h exposure
1198 环　　境　　科　　学 27 卷
　　将栅藻种群按细胞大小(FSC 参数)平均分为 8
个组分(见图 2A ,R1 ～ R8),每个组分中细胞数不少
于1 000 ,计算各组分中单个细胞的平均酯酶活性.
结果显示同一种属对金属离子的敏感性并非一致
(如图 2B , C).在 Cd2+和 Ni2+暴露下 ,各组分中单
个细胞的平均酯酶活性变化范围分别为 41%～
63%(R2 , R8)及 46%～ 82%(R2 , R8),且这种变化
与其细胞大小呈相关性:随着细胞体积的增加 ,对金
属离子的抗性逐渐增强.
2.2　金属敏感性与细胞周期的关系
A 为栅藻细胞的 FSC流式图 ,按 FSC 参数平均设置 8个区域(R1～ R8);B和C 分别为 Cd2+(160μg/ L)和 Ni2+(400μg/ L)
处理 4h后各区域藻细胞酯酶活性变化率
图 2　4h暴露后栅藻细胞大小(FSC)与金属离子敏感性的关系
Fig.2　Relationship betw een the cell volume(FSC)and susceptibilit y to metal ion toxicity in S .obl iquus af ter 4h exposu re
　　目前 ,流式细胞技术在细胞周期方面的研究主
要集中在医学领域 ,而水生微生物的生物膜可能具
有不同的通透性和摄取动力学[ 12] ,加之存在细胞壁
的影响 ,其单个细胞 DNA 的测定较为困难.本文在
优化了栅藻的 DNA 检测方法后 ,对细胞大小和其
细胞周期的关系也进行了分析.在分析中试验采用
未暴露的健康细胞 ,这是因为重金属离子可能会不
同程度的改变细胞膜的通透性 ,从而对渗透性染料
SYBRGreenⅠ的染色效果产生一定影响 ,且重金属
离子(Cd2+:160μg/L;Ni2+:400μg/L)暴露 4h后 ,根
据FSC参数确定毒物对细胞的大小并未造成明显
的(<5%)影响.
按照同样的方法(图 2A),通过 FSC参数(细胞
大小)将细胞分为 4个组分(R1+R2 , R3+R4 , R5+
R6 ,R7+R8).对各组分中单个栅藻细胞的 DNA含
量进行分析.如图 3 ,由于细胞分裂的不同步 ,细胞
大小和其所处周期并非严格对应.在 R1 ～ R4区的
细胞主要表现 1C DNA 峰 ,为 DNA 合成前期(G1
期);而 R5 ～ R6区域的细胞逐渐出现明显的 2C峰 ,
增殖期(G2/M 期)细胞增多 , R8 区域细胞中 2C 的
比例达 63%.这表明栅藻的细胞大小与其细胞周期
具有一定相关性:随着体积的增大 ,栅藻细胞逐渐进
入增殖期.对照上一节的分析 ,进一步反映了栅藻的
毒物敏感性与其所处细胞周期的关系 ,即增殖期的
　　　　
A 为 SYBR GreenⅠ染色后种群的 DNA量分布图 , 1C和 2C分别代表G1期和 G2/M 期;
B为各分区的 DNA量分布图(R1～ R8 ,区域设置见图 6A)
图 3　栅藻细胞大小与其细胞周期(DNA量)的关系
Fig.3　Relationship betw een the cell size and cell cycle stage(DNA conten t)in S.obliquus
11996 期 环　　境　　科　　学
藻细胞对金属离子表现出较明显的抗性 ,而 DNA
合成前期的藻细胞则较为敏感.金属离子透过细胞
膜进入细胞产生毒性反应 ,最显著的表现是限制细
胞增殖能力和破坏 DNA , RNA 的合成[ 13] .本研究
表明这 2种离子主要是在藻细胞合成前期产生毒性
作用 ,这可能与 G1期细胞的新陈代谢能力较低 、解
毒功能较弱有关.而 How let t 和 Avery 等在研究酵
母细胞的 Cu 敏感性时报道了相反的结果[ 2] ,他们
发现G2/M 期的细胞具有较强的 Cu 敏感性 ,认为
这是与细胞初始的氧化还原性质所决定的 ,该类细
胞内源性活性氧自由基(ROS)的含量较高.目前相
关研究较少 , 这种现象发生的机理还有待进一步
分析.
在藻类毒性试验中 ,研究者往往采用进入同步
生长的对数期细胞评估其所承受的环境压力.然而
不同批次的对数期细胞在细胞周期的各个阶段分布
仍然具有较大的随机性 ,而本实验结果表明 ,各个阶
段的细胞对污染物的敏感性具有明显的差异 ,这就
导致了在测定污染物 EC50 , IC50值时可能会出现较
大误差.因此本研究试验提供的证据还表明:在毒性
测试中有必要进一步完善目前的毒性实验步骤 ,例
如 ,对出发种群进行 DNA 分析 ,以保证试验种群细
胞周期分布的稳定性 ,并进一步加以规范 ,从而提高
化学品的环境安全指标和污染物风险评价的精
确性.
3　结论
重金属离子 Cd2+、Ni2+对栅藻种群细胞的急性
毒性实验中 ,不同体积以及不同周期的栅藻细胞的
酯酶活性变化检测表明栅藻种群所有细胞对重金属
离子的敏感性并非一致 ,随着细胞体积的增加 ,其对
重金属离子的抗性逐渐增强.进一步分析表明 ,增殖
期的藻细胞对重金属离子的抗性较强 ,而 DNA 合
成前期的藻细胞则对重金属离子表现出明显的敏感
性.说明细胞对金属离子的敏感性与其所处细胞周
期的不同阶段有关.建议在毒性测试中 ,对出发种群
的细胞周期分布加以规范以提高评估的精确性.
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