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耐氨四尾栅藻在甲烷发酵流出液中的生长及氮磷的脱除



全 文 :生 物 工 程 学 报 ( 34 ) :2 9 0一2 0 6, 1 9 8 7
C h i n e s e J o “ r n Q了 o f B派o t e e孔了? 0 20 9夕
耐氨四尾栅藻在甲烷发酵流出液中的
生长及氮磷的脱除
官崎能雄“ 王选良* 原殷明* 前川孝昭*
( . 筑波大学 , 日本茨城县 )
(二 大连轻 工业学院 , 大 连 )
检查了耐氨四尾栅藻 ( S e e n e d e s优“ 5 q u a d r墓e a u d a ) 在甲烷发酵流出液中的生长情况 。
结果表明 , 该绿藻在 1 %和 10 %流出液中生长良好 , 而在 20 %流出浓中不生长 。 在 1 %流出
液中添加 。 一 28 m M 氨 , 不影响该绿藻的生长速度常数 , 也不影响对数生长期的光合活力。
10 % 流出液中的光合 活 力 降低 , 但仍比得上 1 %流出液的活力 。 从电子显微图中看到 ,
在不加氨 1 %流出液中生长的细胞 , 其淀粉颗粒很明显 , 并且随着加氨量的增加而变小 。 在
10 %流出液中生长的细胞的淀粉颗粒小 , 而且细胞膨胀 , 但是其叶绿体膜系统发育良好 。 这
就是说 , 虽然在形态学上发生了变化 , 但是该绿藻在 1 % 及 10 % 流出液中的生长和生理学
上 ,却没有什么变化 。 该绿藻在 1 %和 10 % 流出液中 ,排除氨氮和磷酸磷的百分数 , 前者分别
为 9 9 . 7 %和 7 3 . 8% , 后者分别为 7 8 . 0%和 6 2 . 8% 。 上述排除效率说明四尾栅藻可以用于家畜
粪便甲烷发酵流出液的处理 。
关 . 词 绿藻 , 四尾栅藻 , 流出液
应用甲烷发酵进行多种生物粪便的能
量再生和粪便处理 , 巳为人所共知 。 关于
甲烷发酵的最新进展 , 有两个方面 : 一是
如何增加消化气体的产量 , 二是如何更方
便地应用于家畜粪便的发酵 处 理 「” 。 但
是 , 甲烷发酵系统的流出液中含有高浓度
的氨和磷酸 。 因此 , 工厂规模的甲烷发酵
系统 , 必需脱除其中的氨和磷酸 、 , 以保证
环境的净化 。 可 以利用细菌 、 高等植物和
藻类来排除氨和磷酸、。 例如 , 有人曾用红
假单胞菌 ( R 五o d o p s e u d o m o n a s ) 作过 这
种脱除试验 【2 ’ 。 光合细菌的脱除作 用 效
率是比较高的 。 但是这类细菌的生长 , 需
要有机化合物作碳源 。 高等植 物 凤 眼 蓝
( E i e 为h o r n 艺a c r a s s玄p e s )的脱除试验表明 ,
该植物具有有效地 脱 除 氨 和 磷 酸 的 能
力 ` “ ’ 。 大多数藻类的脱除试验表明 , 在
高浓度流出液中生长不良 , 脱 除 效 率 也
低 `弓 ’ 。 如果能够找到在高浓度流出 液 中
生长良好的藻类 , 那未这种藻类就可以用
来处理流出液 。
在本研究中 , 我们检查了耐氨 绿 藻
s
.
q “ a dr ic uQ da 的 生 长及其脱除氨和磷酸
的能力 , 并且进一步讨论了将该绿藻用于
处理流出液的可能性 。
材 料 和 方 法
(一 ) 材料
耐氨绿藻四尾栅藻 ( 5 . 口u a d r i cau d a )是从甲烷发酵流出液贮池中分离到的 。 该
株维持在 B ol d 基 础 培 养 基 〔 5 ’ 中 , 温度
20 ℃ , 1 4:L l o D以下的光照条件 。
本文于 1 9 8 6年 了月 1 日收到。
本研究 , 部分承篆 日本农林水产省拨敬的支援 .
Y
.
O ga 二 a 博士在光合侧定中 给予帮助 , 特此致谢 .
DOI : 10. 13345 /j . cjb. 1987. 04. 011
4期 宫崎能雄等 : 耐氨四尾栅藻在甲烷发酵流出液中的生长及氮磷的脱除
(二 ) 培养和检查
用猪粪便甲烷发酵流出液培养四尾栅
藻时 , 流出液在 1 1 0 0 o x g , 离心 1 0m i n ,
取上清液稀释到预定浓度备用 。 氯化按 、
磷酸二氢钾按表 1 的数量添加 。 光源为日
光灯 , 1 4 L : l o D , 在温为20 ℃的条件下进
行培养。
裹 1 四尾娜布生长用培养甚
T a b l e 1 M e d i a u s e d f o r g r o w t h o f
5
.
q“ a d r fe a认 d a
乙醇系列 , 进行脱水处理 。 然后用 E p o n
8 1 2树脂包理 〔。 ’ 。 超薄 切片是在 L K B U I -
t ar t o m e 2 0 8 8 超薄切片机上用金刚石刀切
割的 。 后染色用酷酸双氧铀 处 理 l h , 再
用柠檬酸铅处理 l o m in 。 所得标本用电子
显微镜 ( J E M 一 l o o e , J o E L ) 在 s o k v 加
速电压下进行检查 。
(五 ) 氨和磷酸的测定
氨用 S a g j 氏的方法测定 ` ’ 」 。 磷 酸 态
磷用M u r p h y 一 R 至l e y 方法测定 〔 8 ’ 。
试 样
S
a坦 p le
N
o
.
流出液的浓度
C
o n e e
nt
r at i o n
o f e f f lu e n t s
(% )
添加 K H , P O `
A dd
e
d
K H , P O -
(坦M )
添加 N H ` C I
A d d
e d
N H 一 C l
( nI M ) 结 果
一一。一l一刚一!一1一 1 4 4
1 4 4
1 4 4
1 4 4
4
.
7
9

3
1 8

7
2 8

O
一万可 10 {一 14 {一几一
(一 ) 四尾栅藻 (了 . 宁“ a d r i ` a “ d 召 )
的生长
图 1 表示四尾栅藻在流出 液 中 的 生
长 。 生长延滞期随 1 %流出液培养从 (添
生长检查 : 先用戊二醛 ( 最 终 浓 度
1 0% ) 固定 , 然后在显微镜下做藻类细胞
的细胞计数。
(三 ) 光合成活力的测定
用 ’ ` C法测定 。 先把 5 m l 包括藻类细
胞在内的培养基注入 3 o m l 含有 K H Z P o `
( 2 4 4卜M ) 的 1 %流出液 中 。 再向试样力[I
N a H ` 弓 C O : ( 0

3m l 具有 5 林C i 一 m l一 ` 的
N a H “ C O 3 ) , 然后将样品在一定光度下
于 2 0 oC 保温 Z h 。 保温之后 J月 0 . 2m l 3 5%
的甲醛中止生物活性 , 样品通过膜过沪器
( M il iP o r e H A
, 2 5m m 中 ) , 再使过滤
面接触 H CI 气 , 然后用液炯计数器测量放
射性 。
( 四 ) 电子显微镜学方法
样品在 1 7 0 0 x g 离心 2 . s m i n , 再用
2
.
5% 戊二醛溶液固定 l h , 用 0 . 2M 磷酸
盐进行缓冲 ( p H 7 . 4 ) 。 样品再 置 2 %
o : 0 ` 的磷酸缓冲液中 , 于 4 ℃ , 后 固 定
3 一 4 h 。 固定后的材料 通 过 50 一 oJ o洲
广一豆声 ,
忿! 、
{
{

{` 卜一 `
(夕
L~ — _ 一尸 几
图 1 四尾栅藻在 甲烷发醉流 出液中的生长
F 19
.
2 G or w t h o f 5
. 口u a d r ie a : ` d a i n 口 e t h a n e
f
e r m e n t at io n e王笙lu e n t s
图中的序号 与表 1 的一致
T h e un 皿 b e r i n t h e f i妙 r e s e o r r o s p o n d s
t o t hat i n t a b le l
生 物 工 呈 学 报 3 卷
ó卜
ǎó于,:l`.叹-uoùù以且51。去U产的。ù (é石匆怪布嗽
加 N H . C 1 0一2 8m M , 表 1 的 N o . 1一 5 )
中氨浓度的增加而延长 。 但是 , 生长对数
期的比例常数 ( 兀 二 0 . 6 6一 0 . 7 9 1 /天 ,
K 由方程式 N 二 N 。 x Z兀 ’ 求得 ) 以及静止
期的最终细胞浓度 (2 一 3 x l o “ 细胞 / m D
与氨浓度的差异无关 。
在 10 % 流出液培养基 (表 1的 N o . 6)
中 , 开始时生长曲线下倾一 些 , 而 后 增
长 。 对数期的生长常数 ( 2 . 03 1 /天 ) 大
于在 l %流出液中所取得的数值 。 最终细
胞浓度 ( l x l o ” 细胞 / m l ) 贝!l低于 z %流
出液 (图 l b) 的数值 。
四尾栅藻在 20 %流出液中不生长 。
(二 ) 光合作用活性
我们测定了第 3天和第 9 天的光合作
用活性 。 第 3天的光合作用活性 , 对于生
长在不同氨浓度的 1% 流出液中的细胞来
说 ,几乎是相同的 (图 Z a) 。 当光强度低于
5 0) /m
“ · se 。 时 , 光合作用活性呈直线性
增长 。 当光强度为5 0) / m Z · s c 时 , 光合
作用活性达到平衡 , 饱和光合作用活性为
3
.
5一 4 . l m g碳 / m g叶绿素 .a h 。 第 9 天 ,
生长在含 9 。 3 (图 Z b的 N o . 3) 和 2 8 . 0m M
N H
`
e l ( 图 Z b 中的 5 ) 的 1 % 流出液中
的藻细胞光合作用活性 , 表现出类似于第
3 天 ha 形式 。 生长在不加 N H : C I ( N o , l )
的 l %流出液中的细胞 , 其光合作用活性
降低 。 生长在 10 %流 出液 ( N o . 6 ) 中
的细胞 , 其光合作用活性低于 其 他 样 品
( 图 Z b ) 。 其光合作用活性低 , 似 与 该
生长实验培养基中的最终细胞浓度低相一
致 。
(三 ) 形态学
四尾栅藻的形态学示如图 3 。 根据在
湖水之类 自然环境中观察的 结 果 【” ’ , 本
研究的四尾栅藻大多数为单生性生活 (图
4 和图 5 ) , 不呈现集群状 。 图 4 表明添
加氨对在 1 %流出液中生长的细胞的形态
并`
~
1
6
50
光强度 L ig h t in t e n s i t y
( J
·
m
一 , · s一 ` )
图 2 生长在甲烷发醉流 出液中四尾姗燕的光合成话性
F ig
.
2 p h o t o s下nt h e桩c a c t i , it i e s o f 5 .叼“ a d r£e a “ d a
g or w n i n 皿 e t五a en f e r m e t at fo n e f f lu e n t s
图中的序号与表 1一致
T五e n 仁m b e r 10 t h e f igU er s co r er s p o o d s ot
t h
a t i n t a b l e l
a
.
3 d
a y s b
.
, d a y s
影响 。 在不加氨的培养基中生长 10 天后的
细胞 ( 图 4 b ) , 淀粉颗粒明显 , 可与一
天后的细胞 ( 图 4 a ) 相比 。 细胞生长在
加氨 9 . 3m M (表 1 的 N o . 3 ) 和 1 8 。 7m M
(表 1 的 N o . 4 ) 的流出液中 , 淀粉颗粒
体积小 (图 4 c 和 4 d) 。 细胞生长在不加
氨培养基中 , 则淀粉颗粒增大 。 这可能是
由于氮素减少 。 因为一部分由光合作用生
产的碳水化合物 , 可能作为淀 粉 贮 存 起
来 , 并且可能因氮素耗尽 , 而不直接用于
合成蛋白质和核酸之类含氮化合物 。
细胞生长在10 %流出液 ( N o . 6 ) 中
4 期 宫崎能雄等: 耐氨四尾栅藻在甲烷发酵流出液中的生长及氮磷的脱除
图 3四尾栅旅生长在不加抓化铰 1 % 流出液
中1 0夭后的形态学
F i ` . 5 Mo r p ho lo 盯 o f 5. 叮“ a d r i c叼a sro w玲 i n
1 %
ef f lu e n ts wi t hou t
a d d ed a 口口 o niu m
e hlo r i d a ef ter 1 0d a y s
a . 纵剖 面L o ng iu td i na l s c e tio n( x l 选 0 0 0)
C h: 叶绿体C hl o ro p l a s t, Nu : 核 Nu c le u s
S : 淀粉顺 拉 Satr c h ` r a皿 Ie 一 V : 液泡 V a e仁 o le
G
: 高尔羞体 oG l砂 aP p r a ot s
b
。 横切面 C r o , 5 s e ct io n ( 义 I Q0 0 0 )
比生长在 1 %流出液中 (图 3 及 4 ) 显得
膨胀 (图 5 ) 。 但前者细胞的淀粉颗粒 ,
不象在不加氨的 1 %流出液生长的细胞那
样丰富 。 原因可能是它们消耗的氮素不象
在 1 %流出液中那么多 。 在 10 %流出液中
细胞叶绿体的膜系统似乎是健康的 。 上述
特征表明 , 其整个细胞形态尽 管 异 常 膨
胀 , 但是从生理学上看 , 还是正常的 。
(四 ) 流出液的橄氮和磷酸磷的脱除
表 2 说明 , 四尾栅藻在流出液中生长
10 天后 , 脱除氨氮和磷酸磷的 情 况 。 对
1 %流出液来说 , 流出液的脱氨量 , 随外
加氨量的增加而增加 。 但是就脱除百分数
来说 , 则是加氨的流出液低于不加氨的流
出液 。 磷酸磷的脱除跟氨氮脱除的趋势相
类似 。 就 10 %流出液 ( N 0 . 6 ) 来说 , 其
脱除百分数 , 氨氮为 78 % , 磷酸磷 为 63
%
。 该数值高于在添加氨 9 . 3m M ( N o . 3 )
和 28 m M ( N o . 5 ) 的 1 %流出液 中 作 生
长实验所取得的数值 。
图 4 四尾栅旅生长在不 同 N H . C I派加 t 流出液
( 1 % ) 中的形鑫变化
F ig

4 OM
r p五Ol o g i e a l e h a n犷 5 o f 5 .叮“ a d r `e a “ d a
盯 o w o 10 e f f l u e n t s ( 1% ) w it h d i f f e r e n t
a dd i iot
n s o f a m口 o n i u nZ e h lo r i d e ( x 1 0 0 0 0 )
a
. 生长 1天的细胞 (表 i 一 NO
.
1
, 不加 N H 一 C l )
A
c e ll g r o w n a f et r 2 d a y (N o
.
z i n t a b le z
,
w it hou t
a d d e d a口m o n i u m e h ! o r id e )
b
. 生长 2 0天的 细胭 (表 1一N o . 1 , 不加 N H一C l )
A e e l l g拍w n a f t e r 1 0 d a r s ( NO . 1 i n t a b } e l ,
w it h
o u t a dd e d a几m o n iu m c h l o r i d e )
c . 生长 10 天的细胞 (表 卜No . 3 , 加 N H ` C I
9

3m M )
A c e l g r o w n a fet r 1 0 d a y s ( NO
.
3 i n at b l e z
,
w it h 9
.
3m M a m m
o n
i
u
m
e ho1 , i d。 )
d
. 生长 10 天的细胞 (表 l 一oN . 4, 加 N H . a
1 8

7口M )
A e el l g or w n
a f et r l o da 了s ( NO
. ` in at b le l ,
贾妩五 1 8 . 7 mM a口m o 皿i似m 山 lor i d e )
讨 论
本研究的四尾栅藻 ( 5 . 口u a d r i e a u d a )
具有在 30 m M (表 1、 图 1) 高氨浓度中生
长的能力 。 因此 , 可 以利用它处理含有高
浓度氨的家畜粪便 。
我们还研究了其他藻类 , 其中包括莱
2 9 4生 程 学 报 3 卷
裹 2 四尾 .右排除甲烧发价流出液的确和扭
T , b le 2 R e . o v a l o f P h o s p h o ur s a n d n i t or g e n l。 二愈b a . e 全e r功 e n妞 tl o .
e f f l u e n t s b了 S 。 q“ 叱 r i e a u d a
试样 } 培养基 中礴酸碑的浓度 } 排除 { 培养基中氮翅的浓度 } 排除
s。 血 { 。 马瞥·夕f , P胜p五at e 一 P ’ n } eR 二 o v al } 巴扑卫, 矛嘿黔” ` ” , 一” ` 1 取 , v a lJ~ F` ! nt de瓦口 (卜 M ) } ` . -一 ’ 一 } ~ 少旦旦异鲜乎 《旦丛 1一一 ~乙一 } 一’一 ’ 一
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.叮u a dr 宝e口“ d a g or w n i n 20% 。 f f lu e n t s
表 i 的 oN 一 6, N o . ` i n at b le z ( x 1 4 0 0 0 )
a . 生长 i 天的细胞 A elC l `拍 , 。 a f et r 1 d a y
b
. 生长 1 0天的细胞 A e o l l g r o w n a f t e r 2 0 day s
因衣藻 ( c h l o水 y d o , o o a s r e i n h a r d t i i ) 、
一种卵囊藻 ( O co 岁石 5 sP . ) 及三角褐指
藻 ( p h a o o d a e忿yl u m t r i e o r炸 u右。机 ) 等 。 它
们都能在 l %流出液中生长 , 但不能在 10 %
流出液中生长 。 在一定程度上说 , 这可能
是由于此流出液 中的高浓度氨所致 。 迄今
已研究的藻类中 , 只有四尾栅藻能在 10 %
流出液中生长 。 其原因可能是该绿藻对高
浓度氨具有一定的耐性 。
虽然四尾栅藻能在含高浓度氨的流出
液中生长 , 但是氨似仍影响生长 。 例如 ,
当在 1 %流出液中增加氨时 , 生长开始的
延滞期也增长 , 而且在10 %流出液中生长
开始时的细胞数也下降 (图 1 ) , 推测是
由于氨的影响造成的 。 四尾栅藻可能适应
于培养基中的高浓度氨 。
但是 , 其他因子可能比氨 更影 响生
长 。 在 10 %流出液中 , 比在含有 2 8 . Om M
N H
`
e l (表 z的N o . 5、 图 z ) 的 1 %流出
液中更受抑制 。 10 %流出液中光合作用的
轻微下降和细胞膨胀与生长的 下 降 相一
致。 然而添加 2 8 . 0m坷 N H : e l的 1 %流出
液的氨浓度 , 高于 10 %流出液 , 所以细胞
的这些变化 , 可能不仅仅是由于氨浓度的
不同 。
尽管在 10 %流出液中生长有些变化 ,
但其脱除氨和磷酸的能力并未受到大的影
响 , 而且还可以 和 添加 9 . 3 和 2 8 . O m M
N H ; e l (表 1 的 N o 。 3 和 N o 。 5 ) 的 i %
流出液中的脱除能力相比 。 如果我们采用
多级绿藻培养系统 〔 ` 。 ’ , 那么脱除效率会
大大超过 90 % 。 因此 , 四尾栅藻有可能实
际用于处理 流出液 。
四尾栅藻的生长温度 , 可在较宽的范
围 ( 5 一 38 ℃ ) 内变动 , 表明该藻类生长
能力较强 。 因此该绿藻的生长和温度的依
赖关系问题 , 应当作进一步地研究 。
4 期 宫崎能雄等: 耐氨四尾栅藻在甲烷发酵流出液中的生长及氮磷的脱除 2 9 5
参 考 文 献
〔 i 〕 M助k a 下 a , T . e t 戒 . : J . S o e . A s r 公e , S t r “ e t “ r e , J P . 1礴: 7一 2 1 , i , 8魂.
〔 2〕 Y a m a n a k a , K 。 e t a l . : o n t h e b io 一 d e g r a d a t io n o f a g r i e u l tu r a l W a s t e s a n d u t il i : a t io n o f t h e
b io m a s s e o e r盯 , P P . 1 4 1一 1 5 3 , 1 9 8 3 ,
〔 3 〕 M a e k a w a , T . , e t a l . : 月 。云e ia o 云K e儿丸夕 u灭a 主N ew s 工 e t君e r s , s : 1 1一 22 , 1 9 5峨 .
〔 4 〕 M i y a z a k i , T . e t a l . : O n t h e b io d e g r a d a t io n o f a g r i e u lt u r a l w a s et s a n d u t i l i: a t io n o f t h e b i o m a s s
e n e r g y
,
P P

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T
o
k了。 , 1 9 7 7 .
〔1 0〕 eH n d r i e k s , F . a血 B o s m a n , J . : P r o g . W口r . T e e孔 . 2 2 : 6 5 1一 6 5 5 , 19 5 0 .
2 9 6 生 物 工 程 学 报 3卷
G R OW T H OT H FEAMM ONM IU一 T O LEA RN TG E EN RA LGA
S CE N ED ES M S UQ UA D R IA C UD A N IM EAT H NE一 FE R一
M E N TA T !ON E F F L UESN TA ND RME OVA L O F
AMM ON IUM A D NP HS OP HA T E IN T HE
E F F L UE NS T BY T HAE GA L
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G r ow th o f a m mon i u m

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fe e te n o s tn a tsf o r gr ow th
, n o r p h o t o s y n t h e t i e a e t iv i t j e s d u r i n g t h e e x P o n e n t运l
p h a s e o r g r o w t h
.
p h o t o s y n t h e t ie a e t i v i t i e s i n t h e 1 0 % e fl
u e n t s w e r e l o w e r
,
b u t w e r e s t il l e o m p a r a b l e t o t h e a e t i v ; t y i n t h e l %
e份l u e n t s . E l e e t r o n m ic r o -
g r a P h s s h o w e d t h a t s t a r e h g r a n u l e s w e r e P r o m i n e n t i n e e l l s g r o w n i n l %
e f f -
l u e n t s w i t h o u t a d d i t io n o f a m m o n i u m
, a n d b e e a m e s m a l l e r w i t h i n e r e a s e d a dd i
-
t i o n o f a m m o n i u m
.
I n t h e 1 0% e f f l u e n t s
,
t h e s t a r e h g r a n u l e s w e r e s m a l l a n d
t h e m e m b r a n e o f e h l o r o P l a s t s w e r e w e l l d e v e l o P e d
, a l t h o u g h t h e e e l l s w e r e
s w o l l e n

T h e s e r e s u l t s i n d ic a t e t h a t s r o w t h a n d p h y s沁 l o g y d id n o t v a r y 5 0
m u e h i n t h e l % a n d t h e 2 0%
e f f l u e n t s
,
t h o u g h t h e m o r p h ol 铭y e h a n s e d a
l i t t l e
.
P e r e e n t a g e s o f r e m o v a l o f a m m o n i u m
一 n i t r o g e n a n d P h o s P h a t e

P h o s P h o r u s
i n t h e l %
e f f l u e n t s w e r e 9 9
.
7 a n d 7 3
.
8 %
, r e s p e e t i v e l y
.
I n t h e 1 0% e f f l u
e n t s
,
t h e p e r e e n t a g e o f r e m o v a l w a s 7 8
.
0 % f o r a m m o n i u m a n d 6 2
.
8% fo r p h o s Ph a t e

T h e r e m o v a l e f f i e i e n e y s u g g e s t s t h a t s
.
q u a d r i e a u d a e a n b e u s e d fo r t h e t r e a t
-
m e n t o f e f f l u e n t s a f t e r m e t h a n e f e r m e n t a t i o n O f l i v e s t o e k w a s t e s

K e y w o r d s
G r e e n a l g a , S e e n e d e s m u s q u a d r i e a u d a ; e f l u e n t s