全 文 ：第 , 卷 第 3期
1 9 7 5年 1 月
水 生 生 物 学 集 刊
A C T A H Y D R O B IO L O G I C A S I N I C A
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栅藻高温品系的培育及其生长繁殖规律 *
夏宜净 杜代贤 钱凯先* 黎尚豪
(湖北省水生生物研究所 )
提 要
单细胞绿藻的最适生长温度 , 一般都在 25 ℃ 上下 ,这给许多试验工作 ,特别是夏季露天浅
层培养和室内高光强强化培养工作造成了大幅度降温的额外负担 。 而高温品系则可以减轻降
温的困难 , 并且具有高产的特征 。 本文报道我们培育栅藻高温品系的结果 。 观察了在长期高
温 (暗期 36 ℃ , 光照期 42 ℃ )培育后细胞形态上的变化 , 并着重研究了生长繁殖规律 , 获得了
同步培养 。 细胞生长在光照下进行 ,细胞分裂在暗中进行 , 光照 12 小时后细胞成熟 , 光照停止
后 4 小时内 , 出现抱子形成和子细胞释放的高峰 。 在 2 , 斗0 lx 的弱光照条件下 ,生长率 K 值仍
可达到 2 . 0 7 (以每日 109 , 单位计 ) , 每个母细胞平均可产生 8 . 7 个子细胞 , 显示了生长繁殖迅
速的特点 。
一 、 引 言
从上世纪末叶以来 , 各国学者在进行单细胞藻类的各种试验研究和大量培养时 , 大都
把培养温度控制在 23 一 28 ℃ 之间 , 尤其是集中在 25 ℃ 〔 , 。J。 通常用作研究材料的小球藻 、
栅藻 , 生长最适温度也正是在 25 ℃ 上下 〔, , 8 1 12, `#;] 并且一般把大约 3 5℃ 当做温度最高极
限 l3[] 。 这种温度上的局限性 , 往往使许多试验工作存在降温的困难 , 增加了生产性培养的
成本 。因此 , 选育一种耐高温的品系 , 对试验研究工作和生产性培养 , 均有所裨益 。 oS r ok in
和 M ye sr 氏 ( 1 9 , 3 ) 首先在美国南部的得克萨斯州 ( T xe as ) 培育出一个高温品系 , 生长最
适温度为 39 。 〔川。 so or ik n 等氏还证明 , 藻类的高温品系具有较高的生长率和光能利用率 ,
是一种高效能藻类 ( h i g h一 e f f i e i e n e y 。 l g a e ) 〔` , , 。
高温品系的标准 , 文献中尚无一致的规定 。 PT y X叫 氏 ( 1 9 6 3 )曾提出划分高温品系的
原则 〔15] : 将藻类接种在琼脂培养基上 , 4 0一41 ℃ , 2 , 5 0 0 lx , 培养 10 天不褪色 , 接种到新鲜
培养基上 。 在室温下具有生长能力 , 即是高温品系 。 我们认为 : 所谓高温品系 , 应该在
4 0一朽℃ 高温条件下能够正常生长 , 而且繁殖迅速 ; PT y x二 氏所定的原则 , 既不确切 , 要
求又太低 , 是不可取的 。 我们以水生 5 8 号斜生栅藻 [s c e n e d e s m u , o bl i g 。 。 s ( T u r P . ) K o t z . ] 〔` ,
为材料进行高温培育时 , 所采用的温度是 42 ℃ (光期 ) ; 据 D a v is 等氏试验 , 昼夜保持一定
的温差 , 于藻类生长有利〔` , , 为了模拟武汉地区昼夜的温差 , 在暗期我们采用了 36 ℃ 。 用
1 9 7 4年 1 月 12 日收到
* 本文系《栅藻 、 小球藻培养的研究 , 之四 , 摘要曾在中国植物学会三十周年年会宣读 。 在我们的试验工作全部完
成并摘要发表之后 , S en ge : 等氏相继发表了栅藻同步培养与生长繁殖方面的研究报告 , 其中许多结果是和我
们在本文中所论及的情况相符合的。 有关这方面的材料 , iB s h叩 等氏已经作了归纳 t , , , 本文不再赘述 。
* * 己调离水生所 。
夏宜珍等 : 栅藻高温品系的培育及其生长繁殖规律
人工控制的高温 (光期 4 2℃ , 暗期 36 ℃ )对藻种进行了近两年的诱变 、淘汰和分离选择后 ,
使本来不适应高温的栅藻获得了稳定的生长 , 进而对栅藻在高温条件下的形态变化以及
生长率 、 细胞分裂 、 细胞大小和光强曲线等生长繁殖规律 , 进行了详细的研究 。
二 、 高温品系培育方法
在高温品系的培育过程中 : 我们采用水生 斗号培养基 ( H B 4 ) , 光强 2 , 0 。 玫 左右 , 光
暗比为 1 2 : 1 2 , 光照期通以含 5务C O ; 的空气 , 温度控制在 36 ℃ (暗 )一 42 ℃ (光 ) , 并间或
以 48 一 60 ℃的过高温进行短期处理。 培养物经常予以移养 ( s ub c lut ur e) 。
(一 ) 混合培养阶段
高温诱变和藻种选择 : 最初 , 我们是以栅藻和小球藻混养的藻种作为起始的培育材
料 。 从一般观察和生长测定结果看来 , 在这一阶段 , 藻种不能适应 42 ℃ 的高温 , 更不能稳
定生长 , 以致生长停滞 , 颜色变黄 , 容易沉淀 。 而同一藻种 , 在室温下却生长迅速 , 颜色翠
绿 , 悬浮性强 。 两者形成鲜明的对照 。 坚持一段时间的高温培育后 , 它们比较能适应高
温 , 但仍不能得到稳定的生长速率 , 小球藻和栅藻此起彼落 , 相互消长 , 竞争剧烈 , 都难于
形成稳定的优势 。 在此阶段 , 藻种还间或受到 50 ℃ 上下的过高温的处理 , 使之受到锻炼
和淘汰 。
(二 ) 单种培育阶段
经过第一阶段的 9 个月混合培育以后 , 在一号培养物中 , 斜生栅藻的生长渐趋稳定 ,
在混合培养中形成了优势。 以此号培养物为材料 , 用平板稀释与微吸管法 , 分离出栅藻
单种 , 在固体培养基上得到单种藻后 , 即转入液体培养 , 继续在 3 6一 42 ℃ 高温下培育 。 在
此阶段 , 藻种又先后经历了 3 次过高温 ( 48 一60 ℃ ) 处理 , 进行了细胞个体的淘汰与选择 。
(三 ) 单源高温品系1) 的分离培养阶段
经过 9 个月的单种培育之后 , 斜生栅藻已逐步具备了耐高温的特性 , 这时 , 我们以在
过高温处理后表现最好的一号单种培养物为材料 , 进行单个细胞的分离培养 , 获得了若干
号液体培养的单源培养物 , 再从其中选出一号生长较好的培养物水生一 6 1 0 5 ( H B一 6 1 0 5 )
作为单源高温栅藻品系 。
(四 ) 过高温处理对藻类的影响
上面曾经提到 , 在品系培养过程中 , 除了采用稳定的高温条件进行诱变和选择外 , 藻
种还多次受到过高温的处理 。 藻种经过 48 一 60 ℃ 处理后 , 大部分个体死亡 ;少数细胞 , 颜
色也由绿变白 , 尔后再转绿 , 只有极少数细胞 , 始终保持绿色而保存下来 。 这些经过过高
温处理尚能保存下来的个体 , 就成为我们继续培育的好材料 。 我们对 60 ℃ 过高温处理半
小时到两小时的试验进行了观察 。 处理后 1一 2小时内 , 无论是目测整个培养物或是显微
镜观察 , 均无显著变异 , 3一 5 小时以后 , 培养物颜色开始转淡 、光密度下降 , 细胞由绿而草
绿 , 进而变黄 , 到第二天 , 整个培养物全部变白 。 此时 , 用荧光显微镜检查 , 细胞大量死亡 ,
培养物的电导率比对照略有上升 , 表明藻类大量死亡后 , 体内物质分解 、 析出 , 使培养液中
电解质增加。 经过一周时间以后 , 藻类才渐次恢复 , 在一部分原先已经变白而透明的细胞
l) 从一个细胞繁殖起来的单细胞藻类培养物 , 我们称之为 “单源培养物 ” , 而从这种单源培养物中培育出来的品
系 , 我们称之为 “ 单源品系、
水 生 生 物 学 集 刊
内 , 开始出现一个小绿点 (叶绿体 ) , 绿点逐渐扩大 , 最后整个细胞复绿而成为正常个体 。
从试验中发现 , 栅藻比小球藻更能忍受高温 , 60 ℃处理后 , 比较容易恢复正常 。
试验结果表明 : 过高温处理可以起到淘汰锻炼与选择藻种的作用 , 是培育高温品系
的一种辅助方法 。
三 、 斜生栅藻在长期高温培育后的
形态变化和生长繁殖规律
为了进一步掌握栅藻在长期高温培育后的形态特征和生长繁殖规律 , 我 们 对水生
一 6 1 0 5 号斜生栅藻在高温条件下的形态变化和细胞生长 、 分裂等等方面 , 进行了比较深人
的观察与研究 。
(一 ) 形态特征 在长期高温培育过程中 , 细胞形状逐渐由两端比较尖锐变得比较圆
钝 。集结体 ( co en ob iu m ) 只在似亲抱子刚刚释放时较多 , 一般以单细胞个体为主 , 而集结体
较为罕见 。 在细胞繁殖过程中 , 常常出现畸形现象。 一类畸形是细胞两端的胞壁增厚突
起 , 细胞体积显著增大 ;另一类畸形是形成裤状 (叉形 ) 个体 , 整个细胞长成人字形 。 从染
色观察看来 , 后一类畸形之产生 , 可能是由于母细胞在进行内分裂形成抱子时 , 原生质体
分割不完全所引起 。 所以有时可以在人字形个体中发现双核存在 。
(二 ) 生长率 K 值 进行生长率和生长繁殖规律试验的藻种 , 事先均经过相 同 的 预
备培养 , 即每隔 2 天移养一次 , 至少连续移养 3 次 。 最后一次移养后培养了 3 天的藻种 ,
再用作试验材料 。 培养基仍用水生 斗号 (N a H c 0 3 改为每 升培养液 中 0 . 3 克 3t] , 铁改 用
eF
一 E D T IA )
, 加 A , 液 ) , 其他条件均与藻种培育时相同 。
根据反复测定的结果 , 在 3 6一 42 ℃ 和弱光照 ( 2 , 4 0 0 lx) 条件下 , 水生一 6 1 0 5 的生长率
K 值 , (以细胞数每 日 109 。 单位计算 )已经达到 2 . 0 7 (试验重复的标准误差是 士 0 . 0 4 ) 。
国内以往关于栅藻生长率的报告不多 。 叶清泉和黎尚豪 ( 1 9 5 6 ) 曾在 70 0一 20 , 0 0 0 x1
光强范围内用 6 种光强研究了斜生栅藻的生长率 , 最大为 0 . 67 (出现在 20 , 0 0 0 lx) 〔, ,。 根据
夏宜玲等 ( 1 9 6 2 ) 报告中的资料计算 , 水生 58 号斜生栅藻当时的生长率约为 1 . 0 2[J 。 可见
水生一 6 1 0 5 的现行生长率已有所提高 。 国外应用最广的蛋 白核小球藻 E m er s on 品系和 T x
7一 1 1一 05 高温品系的生长率 , 分别为 1 . % 和 5 . 82) , 这都是在各自的最适生长温度和饱和光
强下测得的最大生长率 。 业已证明 : 高温品系的光饱点比一般品系要高得多 , 在最适温
度和饱和光强以内 , 温度越高 , 要获得较高生长率所需的光强也就越高1l[, ` 2,。 由此可以估
计 , 当光照强度提高以后 , 水生一 6 1 0 5 的生长率可望比 2 . 07 更高 。 表 1 是几种藻种生长率
K 值的比较 。
试验结果表明 , 不同的生长指标 (细胞数 、 干重 、生物量和光密度等 ) 在培养过程中的
变化往往不是一致的 , 但所有这些指标的 K 值都比较接近 , 均在 2 . 0 左右 。 2 . 0 7 是以细胞
数为指标的稳定的生长率 , 若以其他指标计算 。 有时可以达到 2 . 2 。
1) F
e一 ED T A 配方 ( R . s r a u b , 1 9 6 1 ) : 5毫升 I N 的 F e C 13 · 6 H Z O 溶液 (用 I N 的 H C I 配制 )和 5毫升 o · I N 的
N a 一 E D T A 溶液相混合 , 稀释到 , 0 毫升 , 即成 eF 一 E D T A 贮存液 ;使用时每升培养液中加贮存液 1 毫升 。
z ) 关于 T二 7 一 1 1一 0 5 的 K 值 , 文献中很不一致 : M y e r s 氏 ( 一9 5 3 ) 最先称该品系以每日 10 9 , 单位计 , K 二 = 5· 8〔 8 , ;在
s o r o k i n 氏等 ( 19 5 3 ) 关于该品系的正式报告中 , 以每日 10 9 , 。 计 , K一2 . 8 L , 0 , : 而在 s o r o k i n 氏和其他作者以
后的报告中 , 以每日细胞物质加倍数 (即 109 2) 计 , K一 9 . 2[ , , , , 2 , 。
夏宜玲等 : 栅藻高温品系的培育及其生长繁殖规律
表 1 几种旅类的生长率 K值的比较 (均按每日 10 9 , 单位计算 )
一介-一二一…立{〔 …二冬台兰全立蛋 白核小球藻 阮一 s o n 品系 } ` · , 6 】 2 5 1 5 , 斗0 0 (钾和 )高温小球藻 T x7 一U一。 , { ’ · 8 1 3” } ` 5 ,0 。魄和 )高温栅藻水生一 6` 。 5 { 2· 0 7 } ” 2 { 2 , 斗OD (未饱和 )斜生栅藻 { ” · 6 7 * 】 2 5一3 0 } 2 0 , 0 0 0 (饱和 )水生 , 8栅藻 } 1· o* * { 2 8 } 2 , 0 0 0 (未饱和 )
见叶清泉和黎尚豪 ( 19 , 6 )报告山 。
根据夏宜玲等 (叨 62 )的资料计算得到 〔习。
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(三 ) 光强曲线 用 3 种光强 。 , 2 0 0 , 一, 8 0 0 , 2产0 0 lx )初
步迸行了光强对水生 一 6 1 0 5 生长繁殖影响的试验 , 结果 见 图
1 。 已经知道 , 一个典型的光强曲线分为三个部分 , 即 : ( l) 生
长率随光强提高而上升的光相关部分 ; ( 2 ) 光无关部分 (顶峰
部分 ) ; ( 3 ) 生长率随光强提高而下降的光相关部分 。 由于我
们试验的 3 种光强均在饱和光强以下 , 所以图 1 只显示了光
强曲线的一部分 。这也证明 , 如提高光强 , 则 K 值将相应提高 。
(四 ) 同步培养 在高温和 2, 4 0 xl 光照下 , 采用 12 : 12
的光暗制 , 可以获得水生一 6 1 0 5 的同步培养 。 对细胞核染色进
行观察统计的结果 , 在第一个光暗周期中 , 光照停止后 , 进行
分裂的细胞占培养物细胞总数 的 85 一90 务 , 而其 中 95 多的
细胞是在光照停止后的 4 小时之内同步进行分裂并完成全部
分裂过程的 。 光照后期 , 培养物均由成熟的大型母细胞所组
成 , 而在黑暗后期 , 培养物中几乎全部是小型的子细胞 。
哄六燕斌赢)
光照强度
图 1 斜生栅藻在三种光强下
的生长率 K 值
(五 ) 生长与细胞分裂 采用定期采样观察侧定的方法 , 对水生一 6 1 0 5斜生栅藻的生
18
:
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图 2 斜生栅藻的光 、 暗生活周期 (同步培养物 )
长和细胞分裂 , 进行了反复试验 。 图 2 是这种栅
藻在温度为 36 ℃ (黑暗期 )一 42 ℃ (光照期 ) , 光 、
暗比为 1 2 : 1 2 , 光强为 2, 4 0 0 xl 等条件下 的 一 个
光 、 暗生活周期的全过程 。 图 3是在相同的培养
条件下测得的光密度和细胞数的时间曲线 , 表明
了水生一 6 10 5斜生栅藻的生长 、分裂和光 、 暗之间
的关系 。 从图 1 、 2 中可以看出 : 水生一 6 1 0 5 斜生
栅藻的细胞分裂只在黑暗中进行 , 光照停止以后 ,
细胞分裂即行开始 , 核分成 2 、 4 、 8 个 (部分细胞
分至 16 个 , 少数细胞可分至 32 个 ) , 然后原生质
分割 , 形成似亲抱子 。光照开始后 , 分裂停止。 除了
少数在暗中已经开始分裂而尚未完成分裂过程的
细胞在光照期仍处于分裂状态外 , 在光照条件下
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图 3 斜生栅藻 的生长 、 分裂和光暗之间的关系 - - -一光密度
( 6 : 0 0一1 8 : 0 0 光照期 ; 1 8 : 0 0一6 : 0 0 黑暗期 )
川 点钟
… …细胞数
一般不产生新的进行分裂的细胞 。 从细胞核分裂到似亲抱子释放 , 一般在 4 小时之内即
可进行完毕 。 在 同步率差的培养物中 , 则整个暗期内皆有生殖现象 ,在光照期间也会有许
多细胞仍处于细胞分裂的“ 停滞 ” 状态 , 而往往容易误认为在光照条件下也进行细胞分裂 。
与生殖情况相反 , 生长过程是在光下进行 , 光照开始后 , 生长立即开始 (细胞体积增大 , 光
密度上升 ) , 光照停止后 , 生长也随之停滞 。 根据实际计算统计 , 水生一 6 1 0 5栅藻在一个光
暗周期 ( 24 小时 )内 , 平均每个母细胞产生 8 . 7 个子细胞 。
在藻类生长繁殖过程中 , 我们用荧光显微镜对死 、 活细胞进行了观察计数 , 发现在培
养物中经常有一小部分细胞处于死亡状态 , 其数量在细胞总数的 10 多 以内 。 有的是营养
细胞死亡 , 有的是生殖细胞在分裂过程中死亡 。 死亡的细胞 , 先是颜色变淡 , 由绿而黄 , 嗣
后内涵物逐渐减少 , 成为空壳 , 最后细胞破碎而瓦解 。 死细胞在完全变空以前 , 一般显微
镜难于鉴别 , 在荧光显微镜下 , 则死 、活细胞一 目了然 , 前者呈蓝色 , 后者呈深红色 。
(六 ) 生活史分期 根据试验结果 , 我们将栅藻一个光暗周期中的生长 、 繁殖过程粗
分为以下 4 个时期 : ( l) 细胞增长期— 从光照开始至光照停止 , 子细胞在光合作用中增长并发育成熟 ; ( 2 ) 成熟期— 经 12 小时光照后 , 细胞内涵物大量增加 , 体积增大 , 转入黑暗即可分裂 ; ( 3 ) 抱子形成和释放期— 停止光照后的 4 小时以内 , 细胞进行分 裂增殖 , 产生似亲抱子 , 并纷纷释放 出新生个体 , 使培养物主要由子细胞所组成 ; (劝 细胞生长
迟缓期— 光照停止后第 5 小时一直到光照重新开始的这一阶段内 , 细胞增长缓慢 。 培养物光密度保持稳定 (参看图 2 ) 。
在现行条件下 , 水生一 6 1 0 5 栅藻一昼夜只行一次分裂 , 即其整个世代周期为 24 小时 。
一种生物的世代周期的长短 , 可能是由该有机体在长期的生命运动历史过程中形成的一
种内在的时间因素所左右的 。 iP sr on 等氏曾经提出 : 小球藻生活史的长度主要受一种在
光照开始时即起作用的内在时间因素所控制 〔 , , 。 我们认为 , 这种因素也是可以认识和可
以改变的 , 如何人为地调整世代周期的长短 , 是值得研究的 。
(七 ) 细胞体积 对栅藻在生长繁殖过程中细胞 体 积 的 变化 作 了 大 量 的 测量统
夏宜净等 : 栅藻高温品系的培育及其生长繁殖规律
计` ’ (见表 2 ) 。 试验的第一个光
照期间 , 细胞体积的增长最快 ,
光照 12 小时 ,平均长到 29 。微
米 3。 进行生殖的母细胞 , 其体
积大都分布在 1 3 0一 60 0微米 3
的范围之内 ( 占 生 殖 细 胞 的
90 多以上 ) ,其中又以 23 0一 40 0
微米 , 范围以内者居多 。 能 够
表 2 各类细胞的体积
细 胞 类 型
一般的生殖细胞
最大的生殖细胞 一
最小的生殖细胞 一
新生子细胞
第一昼夜细胞能长到的平均体积
第二 、 三昼夜细胞能长到的平均体积
体 积 (微米今
13 0一 6 0 0
8 4 0
7 3
14一 4 0
2 9 0
1 0 0一 1 2 0
进行生殖的母细胞的体积相差很大 , 可以小到 7 3 微米 , , 也可以大到 8 40 微米 3 , 大小悬殊
广一一一一一一一一一一一 , 1 0倍 , 但两者在总体中均属少数 。 一般看来 , 母细胞体
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(培养天数 )
图 4 斜生栅藻在培养过程中生长率
的逆升现象
积越大 , 形成的似亲抱子也越多 。
由于试验是采用批量培养 ( ba t hc c ul ut er ) 方式进行 ,
随着藻类的生长 , 培养的理化条件 (光照 、营养与分泌物
的积累等 ) 日益对藻类生长不利 , 在试验的第二 、 三天 , 光
照时间虽仍是 12 小时 , 但细胞体积平均只能长到 1 0 一
1 2 0 微米 3 , 光照停止时 , 许多细胞未能长到足以分裂的大
小 ( 1 30 微米 ,以上 ) , 不能进行生殖 , 从而使培养物的生长
速率下降 。 前一天未能分裂的细胞 , 积累起来 , 在以后的
光照期再继续长大 , 进行生殖 , 往往又会引起培养物产生
生长率逆升的现象 (见图 4 ) 。 在一般培养工作中常常出
现的生长速率时上时下的现象 , 往往就是这样形成的 。
ǎ以ù坦姗。留乙州粉平
四 、 结 语
通过将近两年的高温培育 , 终于使斜生栅藻在本来不能适应的 42 ℃ 高温下能够正常
生长繁殖 , 并已表现出较高的生长速率 。 这说明 , 为了获得一个理想的藻类品系 。 采用某
种因素长期对藻种进行诱导锻炼和淘汰选择 , 是可以比较有把握地达到定向培育的目的 。
本文所报告的栅藻在高温条件下生长 、 分裂等方面的研究结果 , 对栅藻在一个生活周期内
的细胞生长和生殖进程 , 提供了一个明晰的图景 , 加深了人们对单细胞绿藻的生长繁殖规
律的认识 , 为实现单细胞藻类培养的高产稳产展示了若干可循的途径 。
参 考 文 献
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[ 1 5 ]
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b a t i n g t h e e e l l s u n d e r t h e h i g h t e m P e r a t u r e e o n id t i o n f o r a l o n g P e r i o d h a s b e e n
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T h e m o r P h o l o g i e a l a n d d e v e l o P m e n t a l e h a n g e s o f e e l l s a f t e r a l o n g P e r i o d
o f h i g h t e m P e r武 u r e e u l t iv a t i o n ( 3 6 “ C i n t h e d a r k P e r i o d , 4 2 “ C i n t h e l i g h t P e r i o d )
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T h e P r o d u e t i o n o f t h e a u t o s P o r e s a n d t h e m a x加um a 毗 o s P o r e
l i b e r at i o n s e t i n 初 t h i n f o u r h o u r s a f t e r t h e b e g i n n i n g o f t h e d a r k P e r i o d . T h e
a v e r a g e n u m b e r o f d a u g h t e r e e l l P r o d u e e d 15 8
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