全 文 ：文章编号:0253-2468(2000)-03-0355-05　　　中图分类号:X173　　　文献标识码:A
凤眼莲根系分泌物对栅藻结构及代谢的影响
唐萍 ,吴国荣 ,陆长梅 ,周长芳 ,魏锦诚　(南京师范大学生命科学学院 ,南京　210097)
摘要:研究了凤眼莲(Eichhornia crassipes)根系分泌物对栅藻(S cenedesm us arcuatus Lemm)超微结构及生长代谢的影响.结
果显示 ,凤眼莲对栅藻有明显的克生作用 ,藻的数量逐步减少.栅藻生长受影响后 ,细胞中叶绿体片层肿胀甚至解体 ,线粒体
嵴消失 ,质膜 、核膜受破坏.光合放氧的速度明显下降 , 可溶性蛋白的含量四天后 4 线下降.超氧阴离子(O2 -·)、丙二醛
(MDA)的含量上升 ,峰值都出现在处理后第 6天.超氧物歧化酶(SOD)活性和比活性有激应性升高 ,但随处理天数的延长又
呈急剧下降趋势.过氧化物酶(POD)的活性则持续上升.
关键词:凤眼莲;分泌物;栅藻;超微结构;光合放氧;超氧物歧化酶
Effects of the excretion from root system of Eichhornia crassipes on the
cell structure and metabolism of Scenedesmus arcuatus
TANG Ping ,WU Guorong , LU Changmei , ZHOU Changfang ,WEI Jincheng 　(The College of Life Science
Nanjing Normal University , Nanjing 210097)
Abstract:The effects of the excretion from root system of E.crassipes on the cell ultrastructure and metabolism of S.arcuatus were
studied.The resul ts indicated that the grow th of S.arcuatus was inhibi ted by E.crassipes , its biomass decreased gradually.Chloro-
plast lamella swelled and disintergrated , mitochonria cristea disappeared, plasmolemma and nuclear envelope suf fered destruction.Pho-
tosynthetic O2 evolu tion rate declined obviously from beginning;soluble protein content decreased af ter four days.The contents of O2 -·
and MDA increased , each reached to the maximum at the sixth day.SOD activity and the specific activity increased first , but decreased
rapidly with increase of t reatment time.POD activity increased continuoulsy.
Keywords:E.crassipes;excretion;S .arcuatus;ultrastructure;photosynthetic O2 evolution;SOD
收稿日期:1999-03-12;修订日期:1999-09-27
基金项目:江苏省科学基金资助(项目编号:1998SWXOSZ0001)
作者简介:唐萍(1965—),女 ,讲师
江河湖泊严重富营养化时藻类大量繁殖 ,水色浓绿浑浊 ,水中严重缺氧 ,水质恶化 ,危及其
他水生生物的生存.但在生长凤眼莲的水域中 ,藻体密度小 ,水体较清.人们研究发现 ,凤眼莲
对藻类生长有抑制效应 ,除了是一种竞争抑制外 ,短期内更主要的原因是其根系分秘物具有杀
藻的功效[ 1] .目前已从凤眼莲根系分泌物中提取 、分离到的有 N —苯基 —2-萘胺[ 2]等六 、七种
化学物质.但凤眼莲根系分泌物对藻类结构及代谢影响的报道尚少.本文以栅藻为材料 ,研究
凤眼莲的根系分泌物对其生长量 、细胞结构 、光合放氧 、膜脂过氧化 ,以及自由基清除系统的影
响 ,以期为研究凤眼莲根系分泌物的抑藻机理提供有价值的资料.
1　材料与方法
1.1　实验材料
栅藻(Scenedesmus arcuatus Lemm)由南京师范大学生物工程实验室提供.凤眼莲(Eich-
hornia crassipes)取自南京师范大学生物系生物实验基地.
第 20卷第 3期
2000 年 5 月
环　境　科　学　学　报
ACTA SCIENT IAE CIRCUMSTANTIAE
Vol.20 , No.3
May , 2000
DOI :10.13671/j.hjkxxb.2000.03.020
1.2　培养方法
在圆柱形玻璃缸中用 1/10N 修改的 Hoag land 培养液[ 1] 培养栅藻 ,使起始的 OD650达
0.100.设一对照组 ,另外 5组玻璃缸中植入生长期和重量都相同的凤眼莲 ,凤眼莲植入前先用
蒸馏水冲洗干净并用吸水纸吸干 ,对照组玻璃缸模拟凤眼莲的植入 ,予以遮光.所有玻璃缸上
中部都用一层黑纸加一层白纸包裹 ,以防克藻物在强光下分解[ 1] ,培养温度 18 ℃,自然照光.
培养当天即进行各项指标的检测 ,以后每隔一天测定一次 ,至第十天测定完毕.实验设 3 组重
复 ,均取得一致结果.
1.3　测定方法
生长量的测定参照沃沙克等的方法[ 3] ,测定培养液在波长 650 nm 的光吸收.光合放氧速
率的测定采用李德耀等的簿膜氧电极法[ 4] ,测量时保持藻体密度相同.藻细胞提取液的制备:
抽滤收集藻细胞 ,以 50 mmol/ L 、pH 7.8的磷酸缓冲液洗涤 ,称取藻体 ,悬浮于同种缓冲液中 ,
冰浴下超声破碎(JY88-11型超声波破碎仪 , 150 W ,5min ,工作 10 s ,间 10 s),离心(4 ℃, 12000
×g ,20 min)收集上清液 , -20 ℃保存待测.
可溶性蛋白含量的测定参照 Bradford的考马斯亮蓝 G-250法[ 5] .超氧阴离子(O2-·)含量
的测定参照王爱国等改良的 Elstner 的方法[ 6] .丙二醛(MDA)含量的测定参照 Heath 等的硫
代巴比妥酸(TBA)比色法[ 7] .采用南京建成生物工程研究所 MDA测定试剂盒测定.超氧物歧
化酶(SOD)活性的测定参照 Stew ert和 Bew ley 等的方法[ 8] .过氧化物酶(POD)活性的测定参
照李瑞智等的方法[ 9] .
超微结构的观察:分别收集对照组藻细胞以及处理组分别培养 6天 、10天的藻细胞 ,用
4%戊二醛及 1%锇酸溶液双重固定 ,各级丙酮脱水 ,双氧铀和柠檬酸铅双重染色 ,切片后于
Hitachi600A-2透射电镜下观察.
2　结果
2.1　凤眼莲根系分泌物对栅藻生长量 ,细胞结构的影响
图 1　凤眼莲根系分泌物对栅藻生长量的
影响
Fig.1　Effect of the excretion f rom root
system of E.crassipes on biomass
of S.arcuatus
在实验过程中 ,对照组和处理组的藻培养液 OD650值呈
现不同的变化趋势(见图 1).对照组光密度值逐渐上升 ,10
天后从 0.100升至 0.130 ,而处理组接种后第二天的光密度
值稍大于起始值 , 以后即呈下降趋势 , 到第 10 天降至
0.059 ,比起始下降了 41%, 与同期对照相比则下降了
54.62%,表现出凤眼莲对栅藻生长的明显抑制.
凤眼莲根系分泌物对栅藻细胞结构的损伤是显著的 ,
且随处理天数的延长而加剧.从图版 1 、2 、3(对照)可见 ,未
受伤害的对照组栅藻细胞的叶绿体具有完好的外膜 ,类囊
体片层清晰 ,排列整齐有序;线粒体双层膜结构完整 ,内有
嵴;细胞膜贴壁无皱折 ,核质均匀.而处理组藻细胞培养至
第 6天时(图版 4 , 5),其内部结构已表现出受伤害症状.叶绿体中的类囊体片层膨胀不均匀造
成波浪状的无序排列;细胞膜内陷皱折(图版 4);线粒体嵴消失;核膜破裂 ,核质外渗(图版 5).
当处理组培养至第 10天时(图版 6)可见伤害症状加重 ,藻细胞原生质体收缩 ,叶绿体片层以
及外包膜都发生解体 ,细胞中心几乎成一空腔.
356 环　　境　　科　　学　　学　　报 20 卷
图 2　凤眼莲根系分泌物对栅藻光合放
氧相对速率的影响
Fig.2 　Effect of the excretion f rom root
system of E.crassipes on photo-
synthet ic O 2 evolut ion relative rate
of S.arcuatus
2.2　凤眼莲根系分泌物对栅藻的光合放氧及可溶性蛋白含
量的影响
实验组和对照组栅藻光合放氧速率的测定结果见图 2.
对照组的光合放氧速率在实验过程中相对稳定.实验组处理
的第二天就出现光合放氧的速率明显下降 ,比对照降低了
30%,此后仍持续降低 ,当培养至 10 天时已比对照下降了
60%.表明凤眼莲根系分泌物严重抑制栅藻的光合作用 ,在
处理的初期即明显表现出来.
可溶性蛋白含量的测定结果见图 3 ,处理组栅藻细胞中
可溶性蛋白含量在培养初期略有上升 ,两天后就开始降低 ,
第四天起出现直线下降的趋势 ,到第 10 天已经低于起始值
的28.4%,与藻细胞的生长状态和同期细胞结构的损伤相
互印证.而对照组可溶性蛋白的含量在 10 天中则无明显变
化.表明栅藻体内蛋白质合成系统及水解酶系统对凤眼莲根系分泌物表现相当敏感 ,而光合速
率的变化也应与之相关联.
图 3　凤眼莲根系分泌物对栅藻可溶性蛋
白含量的影响
Fig.2　Effect of the excretion from root sys-
tem of E.crassipes on soluble protein
content of S.arcuatus
2.3　凤眼莲根系分泌物对栅藻 O2-· , MDA含量及活性氧
清除系统的影响
在实验中 ,随着培养时间延长 ,藻细胞内 O2-·含量发
生明显的变化(表 1).初始几天升高显著 ,第 6 天达最高
值 ,每克鲜重的 O2-·含量达到对照的 185.35%,然后逐渐
降低.考虑到实验后期藻体开始死亡 ,以蛋白质为单位计
更确切 ,从表 1可见 ,生长受抑制后藻体内 O2-·含量都明
显高于对照.这一结果表明凤眼莲根系分泌物在处理的初
期就已对藻细胞代谢产生毒害效应 ,诱导 O2-·大量产生.
MDA 为膜脂过氧化产物 ,实验结果显示 ,藻细胞中
MDA 含量的变化与 O2-·含量变化趋势相对应 ,第 6天达
最高值 ,其每克鲜重含量和每毫克蛋白含量计分别为对照
的3.15倍和 3.26倍(表 1).6天后 ,数值逐渐下降 ,可能此时膜已解体 ,细胞已趋死亡.其含量
下降时间与藻细胞结构严重损伤的时间相吻合.
表 1　凤眼莲根系分泌物对栅藻细胞O2-·和 MDA含量的影响
Table 1　Ef fect s of the excret ion f rom root system of E.crassipes on O 2-· and M DA contents of S.arcuatus
培养天数 , d 0 2 4 6 8 10
O 2
-·含量 , OD 530/ g(FW) 2.73 4.07 4.47 5.06 4.01 3.10
O 2
-·相对含量 , OD 530/mg(pro) 0.27 0.35 0.40 0.52 0.49 0.43
DNA 含量 , nmol/ g(FW) 66.02 142.53 191.67 208.30 156.66 101.70
MDA相对含量 , nmol/mg(pro) 6.62 12.36 17.01 21.45 19.24 14.26
　　SOD为 O2-·清除酶 ,藻细胞受凤眼莲根系分泌物影响后 ,藻体 SOD活性和比活性的变化
都呈单峰曲线状(图 4),两者在处理的前期都有一个升高的过程 ,比活性更明显 ,第 6 天时较
对照增长 40.4%.但 6天后 ,SOD活性和比活性都急剧下降 ,表明栅藻对凤眼莲根系分泌物反
3573 期 唐　萍等:凤眼莲根系分泌物对栅藻结构及代谢的影响
应敏感 ,细胞内原有的O2-·产生和清除的动态平衡状态被打破 ,O2-·积累增加.作为细胞抗御
胁迫的主要保护酶 SOD活性在处理前期的增大可能是一种应激性升高;后来的急剧下降则可
能是藻细胞未能抗御这种胁迫 ,SOD活性不能与 O2-·在更高的水平上建立新的平衡 ,细胞开
始遭受实质性伤害.
POD为细胞抗氧化酶系的重要组分 ,藻细胞 POD的活性和比活性在实验初期呈缓慢上
升 ,4天后增幅明显增大 ,特别是 POD比活性是持续的大幅度增长 ,比活性在第 10 天升至对
照的 5.08倍 ,表现出凤眼莲根系分泌物能促进 POD活性的增加.而未发现抑制效应(图 5).
这种现象在植物细胞受到 SO2 、Cd等毒害损伤时都有发现[ 9 ,11] .
图 4　凤眼莲根系分泌物对栅藻 SOD 活性的影响
Fig.4　Ef fect of the excretion f rom root system of E.
crassipes on SOD act ivi ty of S.arcuatus
图 5　凤眼莲根系分泌物对栅藻 POD活性的影响
Fig.5　Effect of the excretion f rom root system of E.
crassipes on POD activity of S.arcuatus
3　讨论
本文实验结果表明:凤眼莲对栅藻的克生作用是明显的 ,仅是几天的处理培养 ,藻体黄化 ,
细胞结构 ,特别是叶绿体 、线粒体等细胞器进行性损伤 ,光合放氧能力显著下降 ,严重影响藻体
的生长.藻细胞可溶性蛋白的含量几乎直线下降 ,是否与蛋白质水解酶被激活以及蛋白质合成
系统受抑制有关 ,从而使受伤害的光合系统很难恢复.线粒体嵴 、类囊体片层的破坏不能及时
修复 ,导致细胞光合 、呼吸作用的损伤.
凤眼莲抑制栅藻生长是通过其根系分泌物兑现的[ 2] ,凤眼莲根系分泌的化学物质经过水
环境进入藻细胞 ,造成藻细胞代谢紊乱及膜结构的损伤 ,就易使光合 、呼吸等电子传递链形成
电子漏 ,促进O2-·的产生 ,因有不配对电子而具有极强氧化能力的 O2-·及后继形成的 H2O2等
活性氧自由基 ,是造成藻体细胞伤害的主要原因之一.在正常条件下 ,细胞内 O2-·的产生与消
除之间处于动态平衡状态 ,使 O2 -·等自由基处于较低的水平.SOD为 O2-·的主要清除酶 ,催化
O2
-的歧化反应 ,是细胞内重要的保护酶[ 10] .其活性高低与植物的抗逆性大小有一定的相关
性[ 11] .实验结果表明 ,凤眼莲根系分泌物在短期内就使得藻细胞 SOD 活性和比活性显著下
降 ,使得 O2-·的产生和清除失去了平衡.藻细胞内过高的 O2-·等自由基浓度 ,可通过各种机理
对藻体施以破坏作用.我们的实验结果显示 ,凤眼莲根系分泌物对栅藻的影响已超出藻细胞的
耐受极限和补偿能力 ,必然造成藻体的严重损伤 ,直至死亡.
358 环　　境　　科　　学　　学　　报 20 卷
POD能分解细胞内 SOD歧化 O2 -·产生的 H2O2 等过氧化物 ,其活性亦与抗逆能力有关.
在实验过程中其活性随着细胞受伤害而逐渐增加.有人报道 ,植物细胞在受到 SO2 等化学物
质的毒害时细胞遭受损伤 ,其细胞内 POD活性也逐渐增加[ 12] .因此 ,这一现象能否指示 ,藻细
胞正在受到凤眼莲根系分泌物毒害损伤.
丁小余等[ 13]曾研究 Cd2对莼菜叶片叶肉细胞的伤害 ,在毒害初期即观察到叶绿体片层肿
胀解体 ,细粒体嵴消失等受害症状.我们的实验也表明凤眼莲根系分泌物对栅藻细胞的伤害与
莼菜受重金属离子毒害后在细胞结构上的伤害有相似的地方 ,破坏细胞的膜系统 ,首先表现在
最容易产生O2-·的叶绿体和线粒体的损伤上 ,这与所测得的生理指标的改变是相对应的.
凤眼莲根系分泌物对藻类生长表现出明显的毒害作用 ,这对于人工合成克藻剂 ,治理环境
污染具有一定的意义.
图版说明
CW.细胞壁　Chl.叶绿体　C.L.叶绿体片层　N.核　M.线粒体
图版
1.对照组栅藻细胞的核及叶绿体(×30000)　2.对照组栅藻
细胞整齐排列的叶绿体片层(箭头所指)(×80000)　3.对照
组细胞的线粒体(×120000)　4.处理组第 6天细胞 ,膨胀的
叶绿体片层 ,细胞膜内陷皱折(箭头所指)(×60000)　5.处
理组第 6天细胞 ,线粒体嵴消失 , 核膜破损(箭头所指)(×
32000)　6.处理组第 10天细胞 ,原生质体收缩 ,叶绿体瓦解
(×17000)
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3593 期 唐　萍等:凤眼莲根系分泌物对栅藻结构及代谢的影响