全 文 ：生 物 医 学 工 程 研 究
Journal of Biomedical Engineering Ｒesearch 2015，34(1):49 ～ 53
* 国家国际科技合作专项(2014DFA30380) ;国家自然科学基金资助项目(81173208)。
△通信作者 Email:samshjx@ sina． com
栅藻延迟发光的初步研究*
付加雷1，2，3，庞靖祥3，聂晓艳3，韩金祥1，3△
(1． 山东中医药大学，山东 济南 250355;
2．山东省中医药研究院，山东 济南 250014;3． 山东省医学科学院，山东 济南 250062)
摘要:采用 YPMS －2 生物光子测量仪检测栅藻的延迟发光。将测得的结果输入到 OriginPro 9． 1 软件
中，与双曲线函数做最佳线性拟合并分析。栅藻有较强的生物光子辐射能力，其延迟发光的双曲线规律为生
物光子辐射的相干性理论提供了证据。双曲函数拟合出来的三个参数(I0、τ、β) ，携带着不同浓度栅藻和液
体培养基的信息，即生物光子辐射对生物系统内部的变化及外界环境的影响有高度的敏感性，为栅藻可作为
液体环境的生物指示剂，奠定了一定的理论基础。
关键词:栅藻;生物光子;延迟发光;双曲线函数;相干性;生物指示剂
中图分类号:Ｒ318 文献标识码:A 文章编号:1672-6278 (2015)01-0049-05
The Preliminary Study of Delayed Luminescence of Scenedesmus
FU Jialei1，2，3，PANG Jingxiang3，NIE Xiaoyan3，HAN Jinxiang1，3
(1． Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China;
2． Shandong Academy of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250014;3． Shandong Academy of Medical Sciences，Jinan 250062)
Abstract:To detect the delayed luminescence of the scenedesmus by usingtheYPMS － 2 Biophotonmeasuring instrument． The
measured results were inputted to the OriginPro 9． 1 software，the best linear fit was done with the hyperbolic function． The scenedes-
mus had strong ability of biophotonemission，the hyperbolic law of delayed luminescence provided some evidences for the coherence the-
ory of biophotonemission． The three parameters (I0，τ，β)of the hyperbolic function carry the information about the different concen-
trations of Scenedesmus and liquid media． In other words，biophotonemission has high sensitivity to the internal changes of biological
systems and the impact of the external environment，which lay a certain theoretical basis for the scenedesmus being used as biological
indicators of liquid environment．
Key words:Scenedesmus;Delayed luminescence;Biophoton;Hyperbolic function;Coherencetheory;Biological indicators
1 引 言
与化学发光不同，所有生命系统均存在着超弱
的光辐射，他们涉及的范围极为广泛:动物及其器
官、组织、细胞等;植物及其根茎、花、果等;各种水
藻;各种微生物，如细菌、酵母菌等。这种普遍存在
于生物系统中的超弱光辐射被称为“生物光子辐
射”(biophoton emission)。其典型强度为 100 个光
子 /(s·cm2) ，光谱分布至少在 200 ～ 800 nm 内是
连续的。生物光子辐射作为生命新陈代谢过程的一
个产物，来自生物分子从高能态向低能态的跃
迁［1］。大量的实验结果表明，生物光子辐射对生物
系统内部的变化及外界环境的影响有高度的敏感
性，因此，通过对生物光子辐射的探测和分析能够获
得生物系统内部的微观信息，了解外界环境的微弱
变化［2 － 4］。
生物医学工程研究 第 34 卷
栅藻是淡水中常见的浮游藻类，极喜在营养丰
富的静水中繁殖，其中许多种类对有机污染物具有
较强的耐性，可在水质评价中作为指示生物［5 － 6］。
鉴于栅藻的以上特性，为了探讨栅藻生物光子辐射
与生物学过程的关系，本研究采用 YPMS －2 生物光
子测量仪对其生物光子辐射行为进行了初步探测，
得到了一些有意义的结论。
2 材料和方法
2． 1 供试生物
栅藻(Scenedesmus sp．)购自中国科学院武汉
水生生物研究所(编号 FACHB －933)。
2． 2 栅藻的培养
收到藻种后，首先将试管内藻液摇匀，在无菌操
作下将藻液直接转入灭菌后的玻璃三角瓶(50 ml)
内，然后将玻璃三角瓶瓶口封好，放置在光照培养箱
中培养。培养温度 25 ± 1℃，光照条件 2 000 Lux，时
间设置 12 h 昼 /12 h 夜。培养 20 d，藻种生长状态
良好，生物量明显增多，在无菌条件下可再次转接，
再次转接比例 1∶ 5(藻液:培养基) ，取长势良好的栅
藻转接入盛有 BG11 培养基的 500 ml 锥形瓶中，培
养一段时间后，测定藻悬液的生物光子辐射。
2． 3 栅藻生长浓度的测定［7 － 8］
藻类的生物量测定是藻类生长、生理生化、生态
等方面研究的必要手段，藻类生物量测定方法很多，
通常的显微直接计数法，光密度(OD)测量法，叶绿
素测量法，Counter 电子显微计数法等，各有优缺点。
尽管到目前为止，计数细胞个体数仍然是最准确，最
令人满意的方法之一，可以获得最基本的种群信息，
但是直接计数法不但工作量大，不同种类间由此估
算的生物量差异也较大。相比之下，光密度法操作
简单，需要样品量少，能够实现快速测定。因此，为
了准确、快速的测量栅藻生物量，本实验分别测定其
细胞密度及吸光度(A) ，并进行直线回归分析，得出
回归方程:C =(A × 11． 995 + 0． 1502) × 106 个 /ml
(Ｒ2 = 0． 9766)。按照此公式，只要测定出藻液的吸
光度，就能计算出藻液浓度(C)。
2． 4 栅藻延迟发光的测量
YPMS －2 生物光子测量仪，购自荷兰米卢娜公
司(Netherlands Meluna Ｒesearch Company)。
将制备好的藻悬液混匀后倾入 4 cm × 1 cm × 1
cm石英比色杯中，先用紫外分光光度计测其吸光系
数，然后快速置于 YPMS －2 生物光子测量仪的样品
暗室内，放置一定时间(约 180 s) ，以消除外界光源
影响，使栅藻混悬液生物光子辐射达到自发状态，再
立即用白 LED 光源激发，激发时间为 10 s，测其延
迟发光，一般测量时间为 600 s。测量参数为:工作
电压 1250 V，测量时间 600 s，间隔时间 1 s。测定光
子计数率—时间曲线、光子计数与栅藻浓度的关系
以及培养基对栅藻延迟发光的影响。
2． 5 数据处理分析
将测得的结果输入到 OriginPro 9． 1 软件中，分
别对实验数据进行作图与非线性(双曲线)拟合，并
分析处理。
3 结果与讨论
3． 1 噪声、培养基与藻液延迟发光对比分析
提前 2 h打开温湿度控制系统，室温恒定设置
为 20℃，湿度恒定设置为 45%。打开 YPMS － 2 生
物光子测量仪，测量暗室的本底噪声，然后放入盛有
3 ml 液体培养基 BG11 的石英比色杯，测量培养基
BG11 自发与延迟发光，结果见图 1。培养基 BG11
为含有无机盐 NaNO3、K2HPO4、MgSO4、CaCl2、ZnSO4
等的无菌水溶液。噪声的平均光子数为 11． 4 /s，
BG11 自发的平均光子数为 12． 05 /s，培养基 BG11
延迟发光从光子数 60 多个，1s 后直接衰减至自发
状态(平均光子数 12． 24 /s)。无机盐水溶液培养基
BG11 的延迟发光几乎没有双曲性弛豫，呈现为指数
衰减状态。
图 1 培养基 BG11 自发与延迟发光与噪声对比分析
Fig 1 The comparative analysis of the spontaneous and delayed
luminescence on BG11 and the noise
栅藻混悬液的延迟发光与培养基 BG11 延迟发
光对比分析，见图 2。培养基 BG11 延迟发光从光子
数 60 多个，1s后直接衰减至自发状态(平均光子数
12． 24 /s) ，与本底噪声(平均光子数 11． 4 /s)非常接
近。藻悬液的延迟发光是从光子数 6 × 104 多个向
下衰减，呈现双曲线弛豫;而培养基 BG11 的延迟发
光从 60 多个光子衰减，呈现指数衰减。相对于藻悬
05
第 1 期 付加雷，等:栅藻延迟发光的初步研究
液延迟发光而言，培养基延迟发光几乎可以忽略不
计，即可以认为藻悬液的延迟发光就是藻体本身的
延迟发光。
图 2 栅藻与培养基 BG11 延迟发光对比分析
Fig 2 The comparative analysis of the delayed luminescce
of Scenedesmus and BG11
3． 2 栅藻的延迟发光光子计数率———时间曲线
将栅藻悬液混匀后倾入石英比色杯中，置于
YPMS －2 生物光子测量仪的样品暗室内，放置一定
时间(约 180 s) ，待栅藻悬液生物光子辐射达到自
发状态后(自发状态的平均光子数约 30 /s) ，立即用
白 LED光源激发栅藻，激发时间为 10 s，测定其延
迟发光，得到光子计数率———时间曲线，见图 3。
图 3 栅藻延迟发光光子计数———时间曲线
Fig 3 The photons － time curve of the delayed luminescence
of Scenedesmus
将双曲函数公式:
I(t)= I0 /(1 + t /τ)β (1)
转换为公式:y = a /(1 + x /b)c (2)
将公式(2)编辑入 OriginPro 9． 1 软件，将栅藻
的混悬液延迟发光测得的数据，与理论表达式(2)
做双曲线最佳拟合，其回归方程为:
y = 586714 /(1 + t /0． 4)^1． 25，Ｒ2 = 0． 9986
将测定的栅藻混悬液延迟发光数据，与双曲线
函数(2)进行拟合，拟合关联度高达 99． 86%，拟合
的三个参数 a(I0)= 586714，b(τ)= 0． 4，c(β)=
1． 25。双曲线衰减规律说明生物系统内的各个激发
态分子之间是相互偶联的，它们可能通过生物系统
内存在的电磁场互相联系，而这正是相干场的重要
特征［9 － 10］。电磁辐射相干性:一部分自发的和光诱
导的生物超弱发光的光子(量子) ，起源于生物系统
内一个高度相干的电磁场，这种相干电磁场很可能
是活组织内通讯联络的基础［11 － 13］，而恰恰可能是生
物光子扮演着生物体内一种新型通讯信使的角
色［14］。用双曲线规律拟合栅藻的延迟发光数据曲
线，拟合关联度高达 99% 以上，这一结果支持了
Popp 的相干性理论，也符合延迟发光弛豫动力学过
程不能用指数函数描述的特点［15］。
双曲函数公式(1)所含的三个参数 I0、τ、β具有
一定的物理意义:I0 代表初始强度，它依赖于被测样
品的性质，同时与光照条件有关;τ 是一个特征时
间，只与样品自身的性质有关;β 是一个指数因子，
强烈控制弛豫的速率。这三个参数值定量地刻画了
被测样品(在延迟发光意义上)的性质［4］。
3． 3 栅藻藻液浓度对其延迟发光的影响
分别取生长旺盛的栅藻 3 ml至 5 个 14 ml离心
管中，然后用液体培养基 BG11 分别稀释至 4、5、6、
7、8 ml，取其中 3 ml入石英比色杯中，测量其吸光度
以及延迟发光。根据测得的藻液吸光度 A，依据公
式 C =(A ×11． 995 + 0． 1502) × 106(个 /ml) ，计算
每个稀释比例藻悬液的浓度(个 /mL) ，见表 1。把
不同浓度的藻悬液测得的延迟发光数据，分别与理
论表达式(2)做双曲线最佳拟合，得出不同浓度藻
悬液延迟发光曲线拟合参数，见表 2。
表 1 藻液的吸光度对应的藻液浓度
Table 1 The algae concentration is calculated by its absorbance
编号 稀释比例 吸光度(A) C =(A ×11． 995 + 0． 1502) ×106(个 /ml)
稀释 1 3 /4 2． 256 27． 21 × 106
稀释 2 3 /5 1． 953 23． 58 × 106
稀释 3 3 /6 1． 728 20． 88 × 106
稀释 4 3 /7 1． 560 18． 86 × 106
稀释 5 3 /8 1． 407 17． 03 × 106
由表 1 可知，随着稀释比例的降低，不同浓度的藻悬
液的吸光度也降低，其相应的藻悬液浓度也明显降
低。
将盛有不同浓度藻悬液的石英比色杯，放入
YPMS －2 生物光子测量仪，测定其延迟发光。测得
的不同浓度藻悬液数据利用 OriginPro 9． 1 软件进行
画图处理，由图 4 可知，单纯从延迟发光曲线来看，
不同浓度藻悬液之间几乎没有明显的区别。将不同
稀释比例的藻悬液(不同浓度的藻悬液)延迟发光
15
生物医学工程研究 第 34 卷
数据，分别与双曲线函数(2)进行最佳拟合，拟合关
联度都高达 99． 60%以上，其拟合后的参数，见表 2。
实测初始强度，即盛有藻悬液的石英比色杯，放入
YPMS －2 生物光子测量仪的样品暗室内，被白 LED
灯光源激发后，暗室快门打开，生物光子仪器初始记
录的光子数。
图 4 不同稀释比例的藻液延迟发光曲线对比
Fig 4 The comparative analysis of the delayed luminescence
curve of difference concentrations of algae solution
表 2 不同浓度的藻液延迟发光曲线拟合参数对比
Table 2 The comparative analysis of the fitting parameter
of different concentrations of algae
藻液浓度 实测初始强度 a(I0) b(τ) c(β)
27． 21 × 106 72338 100651 3． 1508 1． 2121
23． 58 × 106 68467 98616 2． 8492 1． 2041
20． 88 × 106 67806 97420 3． 0604 1． 2854
18． 86 × 106 65046 92886 3． 1854 1． 3103
17． 03 × 106 59635 84161 3． 2999 1． 3171
由表 2 可知，随着藻悬液浓度的降低，实测初
始强度明显降低;a(I0)值也明显降低;c(β)值有升
高趋势;b(τ)先降低后又微弱升高。(1)a(I0)应该
代表理论初始强度，它依赖于被测样品的性质，同时
与光照条件有关。在相同的白 LED光源、相同时间
激发下，不同浓度的藻悬液测得的延迟发光数据，经
双曲线函数(2)进行拟合后，得出的理论上的初始
强度 a(I0) (即拟合出的双曲线的理论最高点) ，一
般比实际测得的初始强度高出许多。实测初始强度
和理论初始强度都与藻悬液浓度呈正相关，即随着
藻悬液浓度的降低，实测与理论初始强度也随之降
低。(2)c(β)是一个指数因子，它强烈控制弛豫的
速率。随着藻悬液浓度的降低，指数因子逐渐增大，
即双曲线的弛豫速率升高。换而言之，随着藻悬液
浓度的降低，其相应的延迟发光衰减变快。这一点
从图 4 也可以看出，即随着藻悬液浓度越低，其延迟
发光数据双曲线拐点越接近中心坐标轴原点。(3)
b(τ)是一个特征时间，只与样品自身的性质有关，
实验结果显示随着栅藻浓度的降低，延迟发光的特
征时间有升高的趋势。生命系统相干性的另一表现
是生物光子辐射的合作性［4］，其基本特征为:辐射
寿命与原子数成反比，辐射强度与原子数的平方成
正比，这就是所谓的“超辐射”。复杂的生命系统是
由无数的小的子系统构成，整个复杂系统的辐射寿
命与子系统的数量成反比，辐射强度与子系统的数
量的平方成正比，我们的结果初步验证了该理论。
综上所述，单纯从延迟发光曲线来看，不同浓度
藻悬液之间几乎没有明显的区别;但通过双曲函数
拟合出来的三个参数(I0、τ、β) ，就能很明显的把它
们区别开，这三个参数携带着不同浓度栅藻和液体
培养基的信息，即生物光子辐射携带着自身状态和
外界状况的信息。这些实验数据的获得，为栅藻可作
为液体环境的生物指示剂，奠定了一定的理论基础。
4 结论
(1)栅藻与培养基延迟发光对比以及栅藻在液
体培养基中延迟发光分析，表明栅藻具有较强生物
光子辐射能力。
(2)栅藻的光子计数率—时间曲线回归说明，用
双曲线函数拟合，其拟合关联度高达 99%以上，双曲
线规律为生物光子辐射的相干理论提供了证据。
(3)栅藻延迟发光的初始强度 I0，随藻密度的
增加而增强，两个计量之间呈显著正相关;随着藻液
浓度的降低，指数因子 β 逐渐增大，即双曲线的弛
豫速率升高，衰减变快;τ 是一个特征时间，与样品
自身的性质有关。随着栅藻浓度的降低，延迟发光
的特征时间有升高的趋势，这一结果再次验证了生
物光子辐射相干性理论。
栅藻有较强的生物光子辐射能力，其延迟发光
的双曲线规律为生物光子辐射的相干性理论提供了
证据。双曲函数拟合出来的三个参数(I0、τ、β)有明
显差别，其中 τ 是一个特征时间，与样品自身的性质
有关。随着栅藻浓度的降低，延迟发光的特征时间
有升高的趋势，这一结果再次验证了生物光子辐射
相干性理论。这三个参数携带着不同浓度栅藻和液
体培养基的信息，即生物光子辐射携带着自身状态
和外界状况的信息。这些实验数据的的获得，为栅
藻可作为液体环境的生物指示剂，奠定了一定的理
论基础。
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第 1 期 付加雷，等:栅藻延迟发光的初步研究
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(收稿日期:2015 － 01 － 30)
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