免费文献传递   相关文献

耐酸铝斜生栅藻的筛选及其生长条件的初步研究



全 文 :1 98 9年1 月 浙江农村技术师范专科学校学报 第l 期
耐酸铝斜生栅藻的筛选及其生长条件
的 初 步 研 究
童 微 星
( 浙江农村技术师专动物饲养系 宁波 ”1 1 5 UI )
摘要 经过含5 0O m g /IA I 培养液的胁迫培养 , 从斜生栅藻 ( sc 阴尸d肖m 。 。 b)J quIJ 、 ) 中筛选到
一个耐酸铝斜生栅藻 ( s o n 尸价 s m 。 。 b峋u us ) 纯系 。 对所筛选的耐酸铝斜生栅藻的生长条件
研究表明 . 本实验室改良的 l : 5 st ie nt er g( 简称 st )T 培养液比较适合其生长 ; 其较适光照强
度是 3 0 0 0士 Z o o L u x ; 它能耐受 10 0 一 s o o m g八 以上 A ] 。
关键词 斜生栅藻 耐酸铝 筛选 生长条件
铝是地壳中最丰富的金属元素之一 , 约占地壳质量的 7% 。 由于许多植物种类对几个到十
几个 m g/ l 浓度的铝敏感 , 因此对诸多植物而言 , 土壤潜在铝毒已相当严重 。 幸运的是 , 大部
分铝是以固定态形式存在于土壤中 , 不致危害植物 , 如铝硅酸盐和沉淀物等 。 随着工业发展 ,
环境污染严重 , 造成酸雨和环境酸化 , 生态平衡被破坏 , 从而加重了土壤的酸化程度 。 目前 ,
世界上大约 40 % 的耕地已经酸化 , 并正在迅速扩大 〔 7 〕 。 由于土壤酸化 , 导致土壤中固定态
铝转变成活性铝 , 如 lA ’ + 、 lA ( O H )乒 lA ( 。 H ) , 十 等 , 从而危害植物 、 动物和水生生物等 。
欲缓解铝对植物的危害 , 既要治理环境污染 , 保持生态平衡 , 同时也须要培育耐酸铝的作物
品种 , 以抵抗酸铝的毒害作用 , 以便充分利用红黄壤等酸化土地 。 为了研究作物耐酸铝的机
理 , 最终培育出耐酸铝的作物新品种 , 人们已经研究了 70 多年 , 但仍未获得突破性的进展 。
以往 , 研究者多用植物整体为材料进行研究 , 但 由于植物整体的遗传背景复杂 , 研究过程中
碰到了许多困难 。 因此 , 寻找耐酸铝的单细胞藻类及微生物 , 并以此为材料研究生物耐酸铝
机理 , 寻找耐酸铝基因就显得很有必要 。
1 材料和方法
1
.
1 材料
供筛选的斜生栅藻 ( s c , dse m。 曲峋 u , 夕采于久置的蒸馏水瓶 。 耐酸铝斜生栅藻
( cse
n 尸 J 留m us ob lqj u us 少系本实验室所筛选的藻种 。
1
.
2 培养液的选择和配制
试验中选用三种培养液 , 即水生 6 号培养液 〔 ’ 〕 , nK au s 一 OP ert r 培养液 〔 ’ 〕和本实验室
改良的 l : 5 S te in t e r g 培养液 (简称 s 【T ) 。 改良后的 S t T 的配方如下 : 。 ( N O 乡 H : 0 0 · 3 9 ;
M g ( N O 3 ): 6 H 2 0 0
·
0 7 9 : N H 4 N伪 o · 0 1 9 9 : K Z H p O ; o · 0 1 7 9 : ( N H 4 ) 2 5 0 4 0 · ( ) ( ) 4 9 : K “ 5 0 4
浙江农村技术师范专科学校学报9 9 8 1年 l月
0
.
0 159 : K N O 30
·
0 39 9 : Mn C 12
·
4 H: 0 0
.
9 36 m g: H 3B O 30
.
6 s lm g: z n S O4
·
7HZ O0
.
35 2m g:
Cus o;
·
5 肠 0 0 .08 om g: Na Z 叽 o;·Z HZ O0 .05 om g:F e S O4 5 .4 28 m g: Na ZE A T DS ·Z oZ m g, 加
H 2 0 至 10 0 rnl 。 三种培养液的 p H 值均为 6 . 20 , 均煮沸消毒 。 在进行酸铝试验时 , 培养液中
加入 A I : ( 5 0 ; ) 3 · 1 8 H Z o 后不再调节 p H 值 。
1
.
3 耐酸铝斜生栅藻的筛选和纯化分离
在含 50 Om g/ IAI 的 S : T 培养液中加入供筛选的藻种 , 于 27 土 Z O C , 30 0 士 2 0 L xu 光照强
度下连续光照 , 培养 5 5d 以上 , 再将所选得的耐酸铝藻用稀释法 〔 ’ 〕 纯化分离 。 最终获得耐
酸铝斜生栅藻纯系 。
1 4 培养条件
在盛 50 m l 消毒培养液的 150 ml 万角瓶中 , 无菌接入培养于含 1 0 m g/ ! lA 的 S t T 培养液
中的耐酸铝斜生栅藻纯系 (稳定期后期 ) 。 接种密度一般为 O乓 80 值 = .0 0 2 5 。 在 2 7 士 2 “ C的
恒温培养室中培养 , 除光照强度试验外 , 其余试验的光照强度均为 3 0 0。 士 Z o 0 uL x , 采用连续
光照 , 每天摇匀 l 次 。 光强试验中 , 光照强度 3 0 0 0土 Z o o L u x 、 1 5 0 0土 2 0 o L u x 、 1 0 0 0 士 Z o 0 L u x
组重复 6 次 。 其他所有试验均重复 4 次 。
1
.
5 生长密度的测定
用 7 21 型分光光度计在 入二 6 80 n m 处 , 测定光密度 ( O D 值 ) 法测定生长速度和生长量 。
工 6 不同培养液对生长影响的试验
用水生 6 号 , K na u s 一 P or t er 和 S : T 三种培养液 , 分另lJ在无 lA 胁迫和 2 5 0 m 留 IAI 胁迫十
进行对比试验 。 培养 24 d 天测定 o D 值 。
1
.
7 不同光照强度对生长影响的试验
用 S : T 培养液 , 分别在无 A I胁迫和 2 5 0 m g / I A I胁迫 下 , 分别采用 4 5 0 0 士 2 () O L u X , 3 0 o U土
: o o L u x
,
1 5 0 0 士Z o o L u x 和 1 0 0 0士 Z o o L u x 光照强度 。 培养 2 2 d 后 , 测定 O D 值 。
1
.
8 不同 A ! 浓度对生长影响的试验
用 S : T 培养液 , 分别加入 0 、 5 、 2 0 、 1 0 0 、 2 5 0 、 5 0 Om g / I A I, 培养 2 4 d 后测定 o D 值 。
2 结果
2
·
1 耐酸铝斜生栅藻的筛选与纯化分离
供筛选藻在不 同 lA 浓度下不同生 产天数时的生长情况见表 1 。 当供筛选藻转移到含
50 0 m g/ IA I 的 st T 培养液中胁迫培养 1d5 时 , 藻的生长明显受到抑制 ; 培养 2 d5 时 , 加入的
藻体死亡 , 形成白色絮状沉淀 , 肉眼未能观察到绿色藻体 。 但是 , 继续培养到 3 3d 时 , 肉眼
观察发现瓶底又有隐约可见的绿色 , 镜检发现有少数椭园型的绿藻 。 继续培养后能进一步增
殖生长 。 对照组 ( o m g/ IAI ) 中 , 加入的藻种不出现死亡 , 而且能连续生长 。
表 1 高浓度 lA 胁迫对供筛选藻种生长的影响
A ]浓度
( m g / l )
生长量 ( O D 6 5 0 )
0

4 5 0
0

4 5 0
0
.
6 8 0
O

3 2 0
1 4 2 0
()
.
0 8 0
第 1期 童微星 : 衬酸铭抖生姗藻的筛选及其生长条件的初步研 究
将所选到的耐酸铝藻用稀释法 ( ` 〕 , 于含 5 0 o m g / IAI 的 tS T 琼脂平板培养基上涂布培养 。
培养 s d 后 , 取单藻落培养于含 10 m g/ IAI 的 tS T 培养液中培养扩大 , 获得 一个耐酸铝斜生栅
藻的单藻落纯系 〔 ’ 、 2 〕 。
.2 2 不同培养液对生长的影响
在无 lA 胁迫下和 2 5 o m g/ ! lA 胁迫下 , 三种不同培养液中耐酸铝斜生栅藻的生长情 况 见
表 2 。
培养液
表 2 三种培养液中耐酸铝斜生栅蕊的生长情况 *
K n a us
一 P o r t e : 水生 6 号
无 lA 时生长量
含 2 5 0 m g / I A I时生长量
0

4 7 9
0

2 6 1
0
.
5 0 9 a
0
.
4 5 4 b
0
.
7 一l b
0
.
7 8 3
, 表中行内字母 a 、 .b · · …表示有显著差异 ( P < 0 . 0 5 ) . (表 3 、 4 同 ) 。
在无 lA 胁迫下 , tS T 培养液和水生 6 号 、 K an us 一 oP o r 两种培养液间均存在显著差异 ,
而水生 6 号和 K na us s 一 P o ert r 之间差异不显著 ; 在 250 m g/ I AI 胁迫下 , 三种培养液之间均存
在显著的差异 。 可见 , 无论是否存在 lA 胁迫 , S tT 培养液都最适于本试验所选的耐酸铝斜生
栅藻的生长 。
2
.
3 不同光照强度对生长的影响
在无 lA 胁迫和 250 m g/ I AI 胁迫下 , 不同光照强度对生长影响的结果见表 3 。
表 3 不同光照强度下耐酸铝斜生姗蕊的生长情况
光照强度 (I 刀x) 4 5 0 0土 2 0 0 3 0 0 0土 2 0 0 15 0 0 土 2 0 0 1 0 0 土 2 ( . 0
无 1A 时生长量 0 . 5 5 2 0 。 4 9 9 0 . 3 2 8 b 0 。 1 7 6
含 2 5 Om g/ I AI 时生长量 0 . 6 16 a 0 . 6 0 0 0
.
3 6 o b
0
.
2 0 6
无论是否存在 A I胁迫 , 3 0 0 0士 Zo o L u x 、 15 0 0士 Z o o L u x 和 10 0 0士 2 0 o L u x 光照强度之间
耐酸铝斜生栅藻生长量均存在显著的差异 , 但是 3 0 0 0士 2 0 uL x 与 4 5 0 0 士 2 0 0 uL x 之间差异不
显著 。 可见 , 3 0 0 0 士 2 0 L ux 光照强度比较适合本试验所筛选的耐酸铝斜生栅藻的生长 。
.2 4 不同 AI 浓度下耐酸铝斜生栅藻的生长情况
在 s叮 培养液中分别加入 o 、 5 、 2 0 、 一0 0 、 2 5 0 、 s o o m g门 A I 后 , 耐酸铝斜生栅藻的生长
情况见表 4 。
表 4 不 同 lA 浓度下耐酸铝斜生栅蕊的生长情况
A I浓度 (m g / 1)
生长量 ( o D
在较高 1A 浓度下 ( 1 0 m g/ 1以上 ) 不但不抑制耐酸铝斜生栅藻的生长 , 反而有一定的促
进生长的作用 。 但是 , 在低浓度下 ( s m g/ l和 20 m g/ l) 反而显著地抑制生长 。
浙 江农村技术师范 专科学校 学报 1 9 9 8 年 l 月
3 讨论
一般作物对 Al 的耐受能力很弱 , 如大麦幼苗对 1一 3 m g门 lA 敏感 〔“ 几水稻幼苗对 5 一
10 m g/ 、敏感 〔 4 毛本试验中筛选到的耐酸铝斜生栅藻能够耐受 50 o m g/ IAI 。 试验过程中我们发
现 lA 浓度达到 I O0 o m g / l时 , 生长仍然基本正常 (资料未发表 ) 。 可见 , 所筛选的耐酸铝斜生
栅藻对 lA 具有很高的耐性 。 所以 , 所选到的耐酸铝斜生栅藻有可能成为用基因工程方法培育
耐酸铝作物的抗源材料 。 同时 , 提示我们在低等生物中可能存在较多对 A I具有高耐性的单细
胞藻类和微生物 。 我们在筛选过程中发现某些霉菌和细菌也具有很高的耐酸铝性 ( 5 0 m g l ) 。
在不同酸度的含 1A 溶液中 , 1A 3 十 、 lA ( o H ) 2 ` 和 lA ( o H ) 丁三种形态单体铝的浓度和比
例是不同的 。 在 p H 4 . O 以下 , 溶液中的 lA 主要以 lA ” 十形态存在 ; 而在 p H 4 . o 以上 l讨 , 随
着溶液 p H 值的上升 , 1A 3 + 的含量下降 , lA ( O H , 2 +和 }A ( O H )子的含量则升高仁, 〕 。 不同
植物对不同形态单体铝的敏感性不同 , 如 1A 3 + 对 马 尾松的毒性较 1A (O H 、 “ + 、 1A ( O H ) 二
大 : S J ; 又 如 lA ( O H ): 千 对 大豆的毒性较 lA ” ` 大 : 6 o]
在 tS T 培养液 ( p H 6 . 别 中 , 分别加入 5 、 2() 、 10 0 、 2 , 、 ” o m g 厂】活性 A] 后 , p H 会随
着活性 lA 浓度的提高而下降 : 当活性 lA 达到 l o o m 『 1时 , p H 一 「降到 .4 。 以下 , 活性 A } 主
要以 lA “ 十 形成存在 ; 当活 性 1A 只 达 到 5 一 Z o m断 l 时 , p H 仍 然 >4 . 5 , 此 时 溶 液 中
IA 、 0 )H 2 `
,
lA ( O H +)e 含量较高 。 因此可 以认为 , 1A ( o H ) 2 一 和 lA ( o H )丁 对耐酸铝斜生栅
藻具有较高的毒性 。 而 lA “ ` 没有毒性 。 结果表现为 , 含低浓度 1A 时藻的生长受到 了明显的
抑制 , 而高浓度时反而不会抑制生长 。
根据本研究的结果 , 采用 3 0 0 0 士2 0 o L u x 光强连续光照条件 , 在含 2 50 m 『 ,lA 的 st f 培养
i夜中培养和保存耐酸铝斜生栅藻是比较合适的 。
参考文献
( 1 〕 华汝成编著 · 单细胞藻类的培养与利用 . 农业出版社 、 19弱
〔 2 〕 胡鸿钓等编著 . 中国淡水藻类 . 上海科学技术出版社 . 19 8 0
( 3 二童微星 . 硕士论文 : 大麦耐酸铝机理及铝锈导蛋白表达的研究 . 杭州大学 , 1 9 9 5
〔 ` . 郝鲁宁等 · 铝对水稻幼苗的生理影响 , 植物学报 . 1 9 8 9 . 31 门 1 ) : 、 `行 一 、洲
〔 5 〕 刘厚田等 · 重庆南山马尾松衰亡与土壤铝活化的关系 . 环境科学学报 、 1明 : ! : ( 另) : : 沂 一 别 1` ;
〔 6 ) A 了v a · A . K . , e t a l . , S。 , S* A m J, 19 8 6 5 0 : 9 5 9
〔 7 〕 M zy a sa k a , S · C 二 e r 该 l· , e l a n t p h y s iso l , 19 8 9 , 9 1 : 飞1 8 8 一 1 19 6 。