全 文 ：中国环境科学 2012,32(5)：886~891 China Environmental Science

离子液体 1-丁基-3-甲基咪唑氯盐对斜生栅藻的毒性效应
段 炼,杜 耀,陆秋琳,蔡卫丹,方治国,刘惠君* (浙江工商大学环境科学与工程学院,浙江 杭州 310012)

摘要：按照毒性试验标准方法研究了不同浓度离子液体 1-丁基-3-甲基咪唑氯盐([BMIM]Cl)对斜生栅藻的影响,测定了半数抑制浓度
(IC50)、叶绿素含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性以及藻细胞通透性的变化,观察了 80mg/L[BMIM]Cl 处理 96h对
藻细胞的影响.结果表明:[BMIM]Cl对斜生栅藻生长具有抑制作用,随着浓度的增大抑制率增加,叶绿素含量下降, 48h IC50、72h IC50和 96h
IC50 分别为 103.77、76.44 和 68.49mg/L.藻细胞对[BMIM]Cl 有一定的氧化应激反应,CAT 和 SOD 活性随[BMIM]Cl 浓度升高而降
低.[BMIM]Cl对藻细胞的细胞膜有一定程度的破坏作用,藻细胞通透性随浓度升高而增大,同时藻细胞的超微结构受到了[BMIM]Cl的影响,
造成质壁分离,叶绿体片层断裂,线粒体嵴数量减少.
关键词：1-丁基-3-甲基咪唑氯盐；斜生栅藻；半数抑制浓度；酶活性；叶绿素含量；细胞通透性；超微结构
中图分类号：X171.5 文献标识码：A 文章编号：1000-6923(2012)05-0886-06

Toxicity of 1-butyl-3-methylimidazolium chloride ionic liquid to Scenedesmus obliqnus. DUAN Lian, DU Yao, LU
Qiu-lin, CAI Wei-dan, FANG Zhi-guo, LIU Hui-jun* (School of Environmental Science and Engineering, Zhejiang
Gongshang University, Hangzhou 310012, China). China Environmental Science, 2012,32(5)：886~891
Abstract：The toxicity of ionic liquid 1-butyl-3-methylimidazolium chloride ([BMIM]Cl) to Scenedesmus obliqnus was
studied in different concentration by using the standard toxicity test. Five different test endpoints were determined such as
the growth inhibition rate (IC50), the content of chlorophyll a (Chla), chlorophyll b (Chlb), the superoxide dismutase
activity (SOD) and the catalase activity (CAT), the permeability of algae cell, and the ultrastructural morphology of cell.
The results indicated that the inhibition rate of algae growth increased and the content of Chla and Chlb in algae cell
decreased with the [BMIM] Cl concentration. The 48h IC50, 72h IC50 and 96h IC50 were 103.77、76.44 and 68.49mg/L,
respectively. The results also indicated that the activities of CAT and SOD decreased due to the oxidative stress and the
permeability of algal cell decreased due to the cell membrane being destroyed with the increase of [BMIM] Cl
concentration. Also, the ultrastructure of algal cell was affected by 80mg/L [BMIM] Cl, resulting in plasmolysis,
chloroplast lamellae fractured and the number of crest in mitochondria reduced.
Key words：1-butyl-3-methylimidazolium chloride；Scenedesmus obliqnus；IC50；enzyme activity；chlorophyll content；
cell permeability；subcellular structure

一种新型的“绿色溶剂”—离子液体因具有
极低的蒸汽压、不挥发、导电性强、对许多无机
盐和有机物有良好溶解性等诸多优点使之在分
离过程、电化学和化学反应等领域显示出广阔的
应用前景[1].然而离子液体的结构与其毒性和生
态效应存在相关性[2],离子液体的化学和热力学
稳定性导致其在环境降解、残留和生态效应等方
面具有潜在环境风险,近年来其环境行为及生态
毒性引起了研究者的关注[3],在离子液体对大型
蚤、斑马鱼、蚯蚓、卤虫的急慢性毒性影响及酶
活性等方面做了相关研究[4-7].
由于离子液体较好的水溶性,其对水环境的
影响不容忽视[3].近年来离子液体对绿藻、大型蚤
和斑马鱼生物生长抑制率的影响已有研究报
导 [8-10].然而目前对于咪唑氯盐离子液体对藻类
影响的研究较少.本文研究 1-丁基-3-甲基咪唑
氯盐([BMIM]Cl)对斜生栅藻的影响,从 IC50、叶
绿素含量、酶活性、细胞通透性以及藻细胞超微
收稿日期：2011-09-01
基金项目：浙江省自然科学基金项目(Y5100376,Y5100365);浙江省
大学生科技创新项目和创业孵化项目(3070JQ4111060P)
* 责任作者, 教授, lhj@mail.zjgsu.edu.cn
5期 段 炼等：离子液体 1-丁基-3-甲基咪唑氯盐对斜生栅藻的毒性效应 887

结构的观察等 5 个方面,获得供试离子液体对藻
类影响的参数,为认识和评价离子液体环境安全
性提供理论依据.
1 材料与方法
1.1 藻种及培养条件
斜生栅藻(S.obliquu)购自中国科学院武汉水
生生物研究所国家淡水藻种库(FACHB).将藻种
接种至灭过菌的水生 4 号(HB-4)人工培养液[11]
中,于 SPX智能型可编程光照培养箱恒温光照培
养.培养条件:用4层纱布封口以防污染,培养温度
为 25℃,光照 63μmol/(m2·s),光暗比为 16h:8h.每
天定时摇动 3次.
1.2 主要试剂
1-丁基-3-甲基咪唑氯盐([BMIM]Cl)购自中
国科学院兰州化学物理研究所绿色化学与催化
中心,纯度为 99%;考马斯亮蓝和牛血清白蛋白购
自上海生工生物工程有限公司;TEM样品包埋剂
为 SPI-CHEM Spurr resin,产自美国;其他试剂均
为分析纯;水为二次亚沸蒸馏水.
1.3 实验方法
取 100mL 浓度为 3.5×105 个/mL 的藻液,
[BMIM]Cl 处 理 浓 度 为 0,20,40,80,120,180,
250mg/L,调节 pH8.0,每一处理设置 3 组平行.实
验分 2 批处理,第 1 批每天定时测定生物量,96h
后测叶绿素含量,另 1 批培养 96h后测定过氧化
氢酶活性、超氧化物歧化酶活性、细胞通透性,
取对照及中浓度 80mg/L[BMIM]Cl 处理的藻液
进行细胞超微结构观察.
1.4 分析测定方法
1.4.1 生长抑制 采用显微镜下血球计数板进
行计数,并在波长680nm下测定斜生栅藻光密度,
建立不同藻细胞浓度和光密度之间的关系 .
[BMIM]Cl 对藻的抑制率=100%×(对照组生物量
-处理组生物量)/对照组生物量[12].采用 Logistic
模型对浓度-抑制率之间的关系进行拟合,计算
相应的 IC50值[13].
1.4.2 叶绿素含量 取 60mL 藻液 3000g 离心
10min后加 90%丙酮,摇匀,在低温暗处抽提 24h,
在 3000g离心 10min后取上清液,在 750nm处调
零以扣除溶液中悬浮液的吸光值 ,采用
Humphrey和 Jeffrey公式计算叶绿素 a和叶绿素
b的含量[14].
1.4.3 氧化应激 取 60mL 藻液在 4℃,6000r/
min 下离心 10min;弃去上清液,加入 10mL 的
50mmol/L 磷酸缓冲液,用超声波细胞破碎仪破
碎藻细胞(破碎条件:功率 800W,破碎 3s,间隔 10s,
破碎 20 次);在 4℃,15000r/min 下离心 10min,取
悬浮液在-80℃冰箱中保存.过氧化氢酶 (CAT)
参照 Aebi 等 [15]的方法测定,超氧化物歧化酶
(SOD)用氮蓝四唑法(NBT法)[16]测定.
1.4.4 细胞通透性影响 参照 Vigneault 等[17]
的方法研究[BMIM]Cl 对藻细胞通透性的影响.
向藻液(藻细胞密度为 7.0×105 个/mL)中移取适
量荧光素二乙酸甲酯 (FDA)溶液使其浓度为
3.0×10-6mol/L.用荧光分光光度计测定 FDA加入
后 10min 内的水解速率,在没有藻液的空白溶液
中 1h内 FDA 没有水解.溶液荧光强度随时间变
化的线性方程的斜率为水解速率,以此反应藻细
胞的通透性.
1.4.5 透射电镜观察 分别取 96h 的对照、
80mg/L[BMIM]Cl处理的藻液,3000r/min离心后
收集的藻体用于细胞超微结构观察.用 2.5%的戊
二醛固定 12h后,用磷酸缓冲液漂洗 3次;再用锇
酸固定,酒精梯度脱水后,用丙酮梯度脱水;包埋
剂浸透后包埋 12h,36℃到 60℃聚合后修块,切片
后染色,水洗,干燥,最后在日立 Model H-7650 透
射电镜下观察斜生栅藻的超微结构[13].以上工作
在浙江大学生物电镜室完成.
1.5 数据处理与分析
所有数据统计分析用 Origin8.0软件处理.
2 结果与讨论
2.1 [BMIM]Cl对斜生栅藻生物量的影响
在处理后24h时,[BMIM]Cl对斜生栅藻的生
长抑制作用不明显,低浓度处理组对斜生栅藻的
生长反而有一定的促进作用,20 和 40mg/L 的处
理抑制率分别为-3%、-4%,高浓度(250mg/L)对
斜生栅藻的生长抑制率也仅为 25%.由图 1可以
看出,低浓度处理组的斜生栅藻的生长随着时间
888 中 国 环 境 科 学 32卷

的延长抑制率降低,40mg/L 处理 48,72,96h 的抑
制率分别为 23.8%、15.8%和 7.6%,表现出低浓度
处理下生长的恢复.而高浓度处理组,抑制率随着
培养时间的延长逐渐增大 ,250mg/L 处理组
48,72,96h的抑制率分别为 67%、78%和 84%.通
过斜生栅藻的生长抑制率计算得 IC50(表 1),随着
培养时间的延长 IC50值减小, 48h IC50、72h IC50
和 96h IC50分别为 103.77,76.44,68.49mg/L.

0 50 100 150 200 250
0
20
40
60
80
48h
72h
96h生
长
抑
制
率
(%
)
浓度(mg/L)
图 1 采用 Logistic模型拟合的浓度-抑制率之间的关系
曲线
Fig.1 Concentration-response fitting curve using the
Logistic model
表 1 Logistic模型参数和预测的 IC50值
Table 1 Parameters of the Logistic model and the IC50
时间(h) A1 A2 p IC50 R2
48 -9.11 99.4 0.96 103.77 0.9905
72 10.9 78.8 3.95 76.44 0.9997
96 3.53 83.8 5.53 68.49 0.9999
注:用Logistic模型进行IC50拟合:y= A2+[A1− A2]/[1+(x/x0)p],y代表
藻的抑制率,x代表[BMIM]Cl的浓度,x0代表IC50值,A1,A2和p是
常量
不同的离子液体对藻类的毒性不同,李俊峰
等[18]研究了 6 种咪唑类离子液体对斜生栅藻的
毒性效应,发现烷基取代链长度的增加将增大其
对斜生栅藻的毒性.本实验在固定藻的培养条件
下,[BMIM]Cl 的毒性随着时间的延长而增强,表
现为抑制率增加,IC50值减小.
2.2 [BMIM]Cl对斜生栅藻叶绿素含量的影响
叶绿素作为植物进行光合作用的主要色素,
其含量高低能够反映出光合作用水平的强弱[19].
[BMIM]Cl处理后 96h斜生栅藻的 Chla 和 Chlb
含量的变化趋势与其生物量的变化趋势一致(表
2),低浓度处理组Chla和Chlb的含量低于对照组
但没有达到显著水平(P>0.05),经 20 和 40mg/L
处理的藻细胞 Chla 的含量分别是对照的 95.2%
和 88.0%;随着[BMIM]Cl 浓度的增加,Chla 和
Chlb含量总体呈下降趋势,180、250mg/L处理组
Chla 的含量分别是对照的 31.3%和 26.5%,与对
照相比差异达到显著水平(P<0.05).Chlb 含量的
下降趋势与 Chla 含量下降趋势一致.[BMIM]Cl
浓度的升高导致藻细胞生长受抑制,Chla和 Chlb
的浓度下降.这可能是因为[BMIM]Cl 进入藻细
胞内部产生活性氧,细胞内活性氧的积累导致叶
绿素和叶绿体结构破坏,通过对藻细胞超微结构
的观察,发现[BMIM]Cl 对叶绿体片层结构产生
一定影响,从而降低叶绿素合成相关酶的活性,叶
绿素合成受阻致使藻细胞内叶绿素含量减少,在
实验后期也可以观察到高浓度处理的藻体溶液
变白.
表 2 [BMIM]Cl处理 96h后斜生栅藻 Chla和 Chlb含量
Table 2 The chlorophyll a and chlorophyll b content of S.
obliqnus after 96 h [BMIM]Cl exposure
浓度(mg/L) Chla(mg/L) Chlb(mg/L) Chla/Chlb
0 0.83±0.09c 0.76±0.07d 1.09
20 0.79±0.04c 0.75±0.10d 1.07
40 0.73±0.05c 0.64±0.06d 1.15
80 0.70±0.06bc 0.45±0.09c 1.56
120 0.59±0.11b 0.35±0.11bc 1.72
180 0.26±0.08a 0.17±0.07a 1.65
250 0.22±0.03a 0.24±0.06ab 0.92
注:数据后的小写字母表示P<0.05水平上的差异显著性
2.3 [BMIM]Cl对斜生栅藻CAT和 SOD活性的
影响
由图 2a 可知经[BMIM]Cl 不同浓度处理,斜
生栅藻 CAT活性整体呈现减小的趋势.在低浓度
处理组(20mg/L),CAT 酶活性是对照的 99.7%,与
对照相比没有达到显著水平.80mg/L处理组CAT
酶活性是 0.048U/mg 蛋白 ,经 180、250mg/L
[BMIM]Cl处理的藻细胞 CAT活性降低到 0.024
和 0.017U/mg蛋白,分别是对照组(0.070U/mg蛋
5期 段 炼等：离子液体 1-丁基-3-甲基咪唑氯盐对斜生栅藻的毒性效应 889

白)的 34.3%和 24.3%.与对照相比,[BMIM]Cl 处
理对斜生栅藻细胞的 SOD活性表现为低浓度激
活高浓度抑制(图 2b).在 20mg/L实验组,SOD 活
性是对照组 102.8%,与对照相比没有达到显著水
平.随着处理浓度的增加 SOD 活性减小,当处理
浓度达到 180,250mg/L时,SOD 活性分别是对照
的 62.5%和 57.0%.

0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
a
abbc
c c
d
250180120804020
C
AT
活
性
[ U
/(m
in
m
g
pr
ot
ei
n)
]
浓度(mg/L)
0
d
(a)


0
2
4
6
8
10
SO
D
活
性
(U
/m
g
pr
ot
ei
n)

0 20 40 80 120 180 250
b b b
b
a
a
a
(b)
浓度(mg/L)
图 2 [BMIM]Cl处理 96h后斜生栅藻 CAT和
SOD活性
Fig.2 Catalase and Superoxide Dismutase activity of S.
obliqnus after 96h [BMIM] Cl exposure
小写字母表示 P<0.05水平上的差异显著性
不同的环境胁迫下如重金属、农药等都会
影响生物的生长,这些影响因素可能会产生一
些活性氧自由基(ROS),ROS 如不能够及时清除,
聚集在生物体内会破坏生物体内的蛋白质、核
酸和脂类等,对生物产生损害作用[20].ROS 能够
诱导抗氧化酶系的活性,超氧自由基在 SOD 的
催化下与氢离子结合,生成过氧化氢,过氧化氢
在过氧化氢酶作用下生成水和氧气 [21].已有报
道证明污染物对藻细胞抗氧化酶系的影响 [22].
本研究中低浓度处理对 SOD 与 CAT 活性影响
不大并表现出一定程度的增大 ,表现出对
[BMIM]Cl 处理的氧化应激反应,这可能是斜生
栅藻表现出的应对[BMIM]Cl 影响的一种保护
机制;在高浓度处理组,斜生栅藻生长受到抑制,
酶活性受到影响而降低.
2.4 [BMIM]Cl对斜生栅藻细胞通透性的影响

0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
250 180 120 80 4020
细
胞
通
透
性
( F
/m
in
)
浓度(mg/L)
0

图 3 [BMIM]Cl处理 96h后斜生栅藻的细胞通透性
Fig.3 Cell permeability of S. obliqnus after 96h [BMIM]
Cl exposure
没有荧光活性的荧光素二乙酸甲酯(FDA)
可被体内的脂酶代谢生成具有荧光活性的荧光
素[23],FDA 难以通过完整的细胞膜,因此荧光素
的荧光强度可用以表征细胞膜的完整性和通透
性[24-25].单位时间内测定的荧光强度越大,表明藻
类细胞的代谢活性越高,细胞膜的通透性越强[26].
[BMIM]Cl 对藻细胞通透性的影响如图 3 所示.
[BMIM]Cl 增加了斜生栅藻的细胞通透性 .
20mg/L[BMIM]Cl 处理的藻细胞通透性为对照
的 1.5 倍,随着浓度的升高,这种刺激效应更加明
显.高浓度处理显著增加了细胞通透性,当处理浓
度增加为 120,180mg/L 时,藻细胞的通透性分别
为对照的 5.7和 7.4倍.
2.5 斜生栅藻的细胞超微结构观察
图 4 是对照(图 4A1 和 4A2)和 80mg/L
[BMIM] Cl处理(图 4B1、4B2、4B3和 4B4)的藻
细胞超微结构图.在对照全景图(图 4A1)中有许
多完整的单个细胞,呈椭圆形和纺锤形,排列比较
密集.在图 4A2中的藻细胞有完整的细胞壁,致密
厚实的细胞膜.叶绿体环绕细胞并占了大半的细
胞容积,叶绿体中可以看到清晰的片层结构.线粒
890 中 国 环 境 科 学 32卷

体数量较多且内部结构完整,脊较明显,基质电子
密度高.圆形蛋白核完整,核仁和核质清晰.
在 80mg/L[BMIM]Cl处理的藻中,全景图(图
4B1)观察到一些藻细胞形态发生了改变,数量明
显减少.在单个细胞中可以明显观察到质壁分离
现象(图 4B4),图 4B2、4B3中叶绿体的片层结构
断裂且层次不清晰,还有一些脂质球体分布在叶
绿体内(图 4B3、4B4).可以观察到有些线粒体大
小正常但嵴的数量增多(图 4B2),还有一些线粒
体变形肿胀,嵴却减少(图 4B3、4B4),线粒体内还
可以看到清晰的膜间隙,在液泡中存在一些沉淀
物质(图 4B2、4B4).

A1
2m

A2
V
CW
M
N
M M
M M M
M
M
PY
Chl
0.5m

B1
2m
B2
PY
CM CW
ChlPRPR
PR
M
M
M
M
V
0.2m
B3
M
M
M
N
CM
CW
PY
Chl
F
0.2m

B4
M
M
M
N
F
PY
CM
CW
Chl
0.2m
图 4 80mg/L[BMIM]Cl处理 96h后斜生栅藻细胞透射
电子显微镜观察
Fig.4 Transmission electron micrographs of S. obliquus
cells after 96 h in 80 mg/L[BMIM]Cl treatment
A1和 A2为对照细胞, B1、B2、B3和 B4为 80mg/L [BMIM]Cl处
理组藻细胞.A1和 B1代表藻细胞全景图(2μm),A2、B2、B3和 B4
是具有代表性的单个藻细胞结构(0.5和 0.2μm), Chl=叶绿体;
M=线粒体;N=细胞核;PY=蛋白核;V=液泡;CW=细
胞壁;CM=细胞膜; F=脂质球体;PR=沉淀
研究表明,逆境条件对藻类细胞有毒害作用,
使得藻细胞变形、破裂,胞壁和原生质体结合疏
松,对藻细胞超微结构中叶绿体、线粒体等结构
毒害较大[22,27].咪唑类化合物的结构和阳离子表
面活性剂相似,[BMIM]Cl是一端亲水(咪唑端)一
端亲油(烷基端)的两亲分子.表面活性剂对藻类
的作用主要是能引起膜脂结构的破坏和组成的
改变[28].[BMIM]Cl 对斜生栅藻的影响与表面活
性剂的影响类似,通过TEM观察,[BMIM]Cl引起
藻细胞的质壁分离,[BMIM]Cl 透过细胞壁,渗透
到含有大量脂类的细胞膜中,影响了细胞的正常
生长.[BMIM]Cl 进入细胞后破坏了叶绿体的结
构,导致叶绿体的片层结构断裂,叶绿素含量下降,
影响了光合作用的进行.脂质球体的变化可以反
映出细胞在胁迫条件下的受伤害程度 [29],TEM
观察发现 80mg/L[BMIM]Cl 处理的藻细胞叶绿
体内分布有脂质球体(图 4B3 和 4B4).线粒体作
为有氧呼吸产生能量的主要场所,是对各种损伤
最为敏感的细胞器之一,为了获得代谢所需的能
量,线粒体承担了更重的任务从而引发了病变.本
研究观察到线粒体嵴数量的减少以及嵴肿
胀,[BMIM]Cl 可能对藻细胞的能量转换系统产
生影响,从而阻碍物质和能量的传递,影响藻正常
的生长代谢.
3 结论
3.1 在试验浓度范围(0,20,40,80,120,180,250mg/L)
内,随着浓度的增大,[BMIM]Cl 对斜生栅藻的生
长抑制作用增强,导致藻类叶绿素含量下降.
3.2 [BMIM]Cl 低浓度(20mg/L)处理组,斜生栅
藻的 SOD与 CAT活性增大,表现出对[BMIM]Cl
处理的氧化应激反应;随着[BMIM] Cl 处理浓度
的增加,斜生栅藻的 SOD与 CAT活性下降.
3.3 [BMIM]Cl 破坏了斜生栅藻细胞膜,随化合
物浓度增加细胞通透性增强.
3.4 暴露于 80mg/L[BMIM]Cl溶液中,斜生栅藻
细胞的超微结构受到了影响,造成质壁分离,叶绿
体片层断裂,线粒体嵴数量减少.
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作者简介：段 炼(1991-),女,安徽安庆人,浙江工商大学环境科学
与工程学院本科生,主要研究方向为污染物生态毒理.