全 文 :量子点(Quantum dot)是一种准零维(Quasi-zero-
dimensional)的纳米材料,由少量的原子所构成,又被
称为半导体纳米微晶体,是一种由Ⅱ-Ⅵ族或Ⅲ-Ⅴ
族元素组成的、稳定的、溶于水的、尺寸在 2~20 nm之
间的纳米晶粒[1]。由于量子点具有独特的光学、电子、
化学和生物功能性质,被广泛应用于从能源到医
学、生物医学和生物分析成像的各个领域[2]。纳米硫
化镉(CdS QDs)是一种常用的量子点,有独特的光电
化学性能,广泛应用于光化学电池和储能器件,在光
致发光、电致发光、传感器、红外窗口材料、光催化等
许多领域有着广泛的应用[3]。随着硫化镉量子点在生
摘 要:采用 96 h急性毒性实验的方法,研究了新型纳米材料硫化镉量子点(CdS)对斜生栅藻的毒性效应。结果表明,随着量子点
浓度的增大,其对斜生栅藻生长的抑制作用也在增大,并在浓度为 1.0 mg·L-1时达到了显著抑制作用。通过光学显微镜观察发现,
经过量子点处理之后的斜生栅藻细胞形态出现了变化,并且随着处理浓度的增大,藻细胞颜色变浅的程度也增大,这说明硫化镉量
子点可能对藻细胞色素的合成存在阻碍作用。在处理 96 h后,硫化镉量子点对藻细胞光合色素含量的影响和藻密度的影响是一致
的,各浓度组 SOD(超氧化物歧化酶)含量相比于对照组均出现了显著变化,而 MDA(丙二醛)含量则是在浓度为 0.2、0.4、0.6 mg·L-1
时与对照组相比变化较小,在浓度为 0.8、1.0 mg·L-1时出现较显著变化,并且 SOD和 MDA含量在浓度为 1.0 mg·L-1时呈明显负相
关关系,这说明在各组均发生了不同程度的脂质过氧化反应。
关键词:量子点硫化镉;斜生栅藻;光合色素;超氧化物歧化酶;丙二醛
中图分类号:X503.23 文献标志码:A 文章编号:1672-2043(2013)03-0524-06 doi:10.11654/jaes.2013.03.018
纳米硫化镉量子点对斜生栅藻的毒性研究
王 蓉,林溢琦,孙相振,钟 秋,耿 辉,熊 丽 *
(湖北省遗传调控与整合生物学重点实验室,华中师范大学生命科学学院,武汉 430079)
Effect of Quantum Dot Cadmium Sulfide on Scenedesmus obliquus
WANG Rong, LIN Yi-qi, SUN Xiang-zhen, ZHONG Qiu, GENG Hui, XIONG Li*
(Hubei Key Laboratory of Genetic Regulation and Integrative Biology, College of Life Sciences, Central China Normal University, Wuhan
430079, China)
Abstract:Nanotechnology engineering is rapidly growing with promises of substantial benefits. However, worries have been raised that their
properties making them so attractive are thought to have potential health or environmental hazards. This study was designed to assess the a-
cute toxicity of quantum dot cadmium sulfide(CdS QDs)nanomaterial on aquatic ecosystem. It is widely used in light chemical batteries, en-
ergy storage device, photoluminescence, electroluminescence, sensors, infrared window material and light catalysis. Scenedesmus obliquus
was exposed to different CdS QDs concentrations(0 mg·L-1, 0.2 mg·L-1, 0.5 mg·L-1 and 1 mg·L-1)and algal growth was daily assayed while
shape and color of cells, photosynthesis pigments, free malondialdehyde(MDA)and superoxide dismutase(SOD)content were assayed after
96 h exposure. The concentration of 1.0 mg·L-1 caused a significant algal growth inhibition. The optical microscopy images showed cells′ ten-
dancy to turn pallor when CdS QDs concentration is increased, indicating that it might inhibit the synthesis of chlorophylls whose content
varied with cell density. The MDA and SOD contents were opposite, indicating that varying degrees of lipid peroxidation occurred in the cell
membrane. This study contributes to the assessment of toxicological effect of quantum dot cadmium sulfide on aquatic ecosystem.
Keywords:quantum dot cadmium sulfide; Scenedesmus obliquus; photosynthesis pigments; SOD; MDA
收稿日期:2012-09-11
基金项目:国家大学生创新性试验计划项目;国家自然科学基金
(30771429.31071653);教育部留学归国人员科研基金
作者简介:王 蓉(1990—),女,湖南常德人,在读本科生。
*通信作者:熊 丽 E-mail:xionglily@mail.ccnu.edu.cn
2013,32(3):524-529 2013年 3月农 业 环 境 科 学 学 报
Journal of Agro-Environment Science
第 32卷第 1期2013年 3月
物医学等研究及生产中的广泛应用,以硫化镉量子点
为原料的产品可能随着产品的使用、丢弃使其释放、
渗入或流入土壤和水体等介质中,与此密切相关的药
物毒性问题以及对人类环境可能产生的污染问题都
日渐引起研究者的高度关注。目前对量子点的毒性尚
未进行充分的检验,因此,评价量子点的生物安全性
已成为 21世纪毒理学的新课题[4]。
藻类是水生生态系统的初级生产者,其种类多样
性和初级生产量直接影响水生态系统的结构和功能,
因而成为监测评价水环境质量的重要指标[5]。斜生栅
藻(Scenedesmus obliquus)是一种常见的浮游藻类,对
毒物敏感、易获得、个体小、繁殖快,在较短时间内即
可得到化学物质对其许多世代及种群水平的影响评
价,因而成为检测评价水环境质量的一种常用的、重
要的测试生物[6]。
本实验通过不同浓度硫化镉量子点对斜生栅藻
细胞密度和形态、光合色素含量、SOD和 MDA含量
的影响进行研究,以期为硫化镉量子点对斜生栅藻的
毒性和生物安全性研究提供依据。
1 材料和方法
1.1 实验材料
斜生栅藻(S. obliquus)由中国科学院武汉水生
生物研究所藻种库提供(No.FACHB39),并经室内扩
大培养用于实验。斜生栅藻的培养基为 HB-4培养
基[7],所有试剂均为分析纯。
硫化镉量子点母液制备:采用乳化液膜法合成硫
化镉量子点[8]。将溶于无水乙醇的硫化镉量子点样品
取出,自然风干。称取粉末状硫化镉量子点 0.1 g,用
蒸馏水溶解,使用前用超声波振荡溶解 30 min,获得
分散均匀的 5 mg·L-1母液,4℃下储存备用。
1.2 实验方法
1.2.1 驯化培养
将斜生栅藻在无菌条件下转移至 HB-4 培养液
中,于光照培养箱中驯化培养 1周,至对数生长期进
一步扩大培养。培养条件为:温度(25±0.5)℃,pH 7~
8;明暗周期比 12 h∶12 h,光强 3000 lx,静置培养,每
日定时人工摇动 3次[9]。
1.2.2 纳米硫化镉量子点对斜生栅藻生长的影响
将处于对数生长期的斜生栅藻接种于灭菌的
HB-4人工培养液中,起始藻密度均为 1.1×106 cells·
mL-1,实验设置 6个硫化镉量子点浓度梯度(0、0.2、
0.4、0.6、0.8、1.0 mg·L-1),实验处理前将母液置于超声
仪中 10 min使溶液稳定、均匀。每个浓度设 3个平
行,采用容积为 100 mL的灭菌锥形瓶进行分装,每瓶
中藻液的体积为 50 mL。每隔 24 h用血球计数板测定
藻细胞密度(cells·mL-1)[10]。
1.2.3 光合色素的测定
培养 96 h后,取 20 mL藻液于离心机(Eppendorf
5415R)中 5000 r·min-1,4 ℃下离心 10 min,收集藻细
胞。取 5 mL 80%丙酮制成细胞悬液,转移到 10 mL试
管中,用封口膜密封,黑暗条件下抽提 24 h后,充分
混匀,吸取 1.2 mL于微量离心管中,8500 r·min-1离
心 15 min,取上清液于 96 孔板中,以 80%丙酮为空
白对照,用酶标仪(BIO-TEC)测定 OD663、OD645、OD450
值。光合色素含量计算公式如下[11]:
C-a=12.21×OD663-2.81× OD645
C-b=20.13× OD645-5.03× OD663
C-k=(1000×OD450-3.27×C-a-104×C-b)/229
式中:C-a 为叶绿素 a;C-b 为叶绿素 b;C-k 为类胡
萝卜素。单位均为 μg·mL-1。
以 80%的丙酮作为空白对照,测定 300~800 nm
波长范围内叶绿素的连续吸收光谱。
1.2.4 粗酶液的提取
取 100 mL藻液于冷冻离心机在 4℃、5000 r·min-1
下离心 15 min,收集藻细胞,用磷酸缓冲溶液(0.1 mol·
L-1,pH 7.8)润洗藻细胞 3次,每组中加入预冷的磷酸缓
冲溶液 1.2 mL(0.1 mol·L-1,pH 7.8)和少量的石英砂进
行冰浴研磨,将匀浆液在 4℃下 8500 r·min-1离心 15
min,取上清液并记下总体积,冷冻保存备用[10]。
1.2.5 超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定
采用 Beachchamp[12]建立的 Bewley[13]改良的氮蓝
四唑(NBT)光化学还原反应法。酶活力单位定义参见
Bewley等[13]。蛋白质含量用考马斯亮蓝法测定[14],以
牛血清蛋白做标准曲线。
1.2.6 丙二醛(MDA)含量的测定
参照 Heath[15]和林植芳等 [16]的方法,采用硫代巴
比妥酸(TBA)法测定 MDA的含量。
1.3 实验数据处理
实验数据处理采用 Origin 6.0统计分析软件,进
行 t检测和差异显著性分析。图中的 *和 **分别表
示在 P<0.05和 P<0.01时差异显著和极显著。
2 结果与分析
2.1 硫化镉量子点对斜生栅藻生长的影响
图 1显示不同浓度量子点对斜生栅藻的生长影
王 蓉,等:纳米硫化镉量子点对斜生栅藻的毒性研究 525
农业环境科学学报 第 32卷第 3期
响。由图 1可以看出,对照组和 0.2 mg·L-1实验组的
细胞呈现 S型生长曲线,而剩余 4个实验组的细胞生
长趋势则是在 72 h时达到峰值后出现了明显的减少
现象。24 h时,相比于对照,高浓度组(0.6、0.8、1.0
mg·L-1)已经开始对藻细胞的生长表现出明显的抑制
作用,并且抑制作用随着浓度增大而增大。72 h时,
0.4、0.6、0.8、1.0 mg·L-1实验组的细胞数达到生长的
峰值;至 96 h时,上述几组的细胞数出现了大幅度减
少的现象,与对照组相比分别下降了 45.5%、72.1%、
79.4%和 83.6%,低浓度组(0.2 mg·L-1)的细胞数相对
于空白对照组减少了 16.4%。从图中可以看出,量子
点对斜生栅藻生长的抑制作用随着量子点浓度的增
大而增大。
2.2 硫化镉量子点对斜生栅藻光合色素含量的影响
图 2表示用不同浓度硫化镉量子点对斜生栅藻
处理 96 h后,对光合色素含量产生的影响。从图中可
以看出随着量子点浓度的增大,其抑制藻类光合色素
合成的作用也增大。在 96 h测定叶绿素 a的含量,各
实验组从低浓度到高浓度其叶绿素 a的含量相比于
空白对照分别减少了 30.56%、46.77%、56.57%、
70.75%、87.18%。综上可知三种光合色素中,硫化镉
量子点对叶绿素 a含量的影响是最大的。
图 3表示硫化镉量子点对斜生栅藻处理 96 h后
吸收光谱的影响。由图可见,各浓度组的吸收光谱谱
带相似。在蓝光区 430 nm处和红光区 663 nm处均出
现了明显的吸收峰,其分别为叶绿素 a、b的特征吸收
峰。可见不同染毒浓度组明显影响了吸收峰值的大
小,其结果和藻细胞的种群动态变化趋势、光合色素
含量的变化是一致的。可以推测,不同浓度的硫化镉
量子点可能通过影响藻细胞的生长数量,进而影响各
浓度组光合色素的含量。
2.3 硫化镉量子点对斜生栅藻 SOD含量的影响
图 4表示处理 96 h后,硫化镉量子点对斜生栅
藻 SOD含量的影响。由图可以看出,随着暴露浓度的
增大,SOD含量呈现出波动变化。与对照组相比,当暴
露浓度为 0.2 mg·L-1时,SOD含量增加 74.68%;暴露
浓度为 0.4 mg·L-1时,SOD含量下降 38.29%;当暴露
浓度为 0.6 mg·L-1时,SOD增加 25.06%;在高浓度组
(0.8、1.0 mg·L-1)处理下,SOD含量随浓度的增大而降
低,两组分别降低 18.64%、69.42%。
2.4 硫化镉量子点对斜生栅藻 MDA含量的影响
图 5表示处理 96 h后,硫化镉量子点对斜生栅
藻 MDA含量的影响。由图可以看出,在较低暴露浓
度(0.2、0.4、0.6 mg·L-1)下,MDA含量变化不大。与对
照组相比,在暴露浓度为 0.2 mg·L-1(低浓度)时,MDA
含量下降 9.16%;在暴露浓度为 0.4 mg·L-1时,MDA
上升 3.63%;在 0.6 mg·L-1(高浓度)时,MDA下降
4.58%;在暴露浓度为 0.8 mg·L -1 时,MDA 降低
图 3 CdS QDs对斜生栅藻吸收光谱的影响
Figure 3 Effects of CdS QDs nanoparticles on the absorption
spectrum of S.obliquus
图 1 CdS QDs对斜生栅藻生长的影响
Figure 1 Effect of CdS QDs nanoparticles on growth of S.oliquus
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
培养时间 Culture time/h
细
胞
数
Ce
ll
de
sit
y/
×1
06
ce
lls
·
m
L-
1
0 24 48 72 96
**
0 mg·L-1
0.2 mg·L-1
0.4 mg·L-1
0.6 mg·L-1
0.8 mg·L-1
1.0 mg·L-1
**
**
**
**
**
****
**
**
**
**
**
**
**
**
4
3
2
1
0
光合色素类别
Photosynthetic pigment types
光
合
色
素
的
含
量
/μ
g ·
m
L-
1
Ph
ot
os
yn
th
et
ic
pi
gm
en
t′s
co
nt
en
t
C-a C-b C-k
**
0 mg·L-1
0.2 mg·L-1
0.4 mg·L-1
0.6 mg·L-1
0.8 mg·L-1
1.0 mg·L-1
**
**
**
**
**
****
**
**
**
**
**
**
图 2 CdS QDs对斜生栅藻光合色素含量的影响
Figure 2 Effects of CdS QDs nanoparticles on the photosynthetic
pigment content of S.obliquus
0.500
0.400
0.300
0.200
0.100
0
Wavelength/nm
吸
光
度
OD
360 420 480 540 600 660 720 780
丙酮对照
0 mg·L-1
0.2 mg·L-1
0.4 mg·L-1
0.6 mg·L-1
0.8 mg·L-1
1.0 mg·L-1
Spectral scan
526
第 32卷第 1期2013年 3月
图 6 光镜拍照培养 96 h后的斜生栅藻细胞形态
Figure 6 Light microscopy images of S. obliquus cells
after 96 h exposure
53.86%;1.0 mg·L-1时,MDA升高 62.60%。
2.5 硫化镉量子点对斜生栅藻细胞形态的影响
图 6为处理 96 h后,在光学显微镜下以 40倍物
镜拍摄到细胞形态的变化。正常条件下生长的斜生栅
藻细胞呈纺锤形,两端尖细[17]。实验过程中每日定时
人工摇动 3次,摇动时间每次 2 min,使细胞呈单细胞
状态。与对照组(图 6a)相比,到浓度为 0.6 mg·L-1时
视野下细胞数目明显减少(图 6b),而且在同一浓度
下的其他视野中,经仔细观察,发现出现藻形态的变
化,变化出现于两端边缘,细胞整体趋向于圆形。通过
观察发现,随暴露浓度升高,细胞颜色变浅、数目急剧
减少,如图 6c。
3 讨论
经过 96 h的急性毒性实验,硫化镉量子点对斜生
栅藻生长的抑制作用随着浓度的增大而增大。有研究
表明,关于硫化镉量子点的毒性机制研究主要集中在
重金属元 Cd2+的释放、氧化过程中活性氧的产生以及
活性氧自由基介导的氧化应激等方面的探讨[18]。其对
细胞的毒性作用机制可概括为以下两点:(1)量子点
诱导产生活性氧,进而对细胞产生氧化损伤作用[19];
(2)纳米量子点释放内核重金属离子,通过释放的重
金属离子对细胞产生毒性作用[20]。因此,可推测本实
验中 Cd2+的释放和活性氧的氧化损伤作用是硫化镉
量子点造成细胞毒性的主要原因。
在本实验的生长抑制测试中,不同浓度暴露组细
胞数量均在 96 h时出现了明显的下降。由此可见,硫
化镉量子点对藻细胞生长具有明显的抑制作用,且抑
制作用随暴露浓度的增大而增大,在高浓度(0.8、1.0
mg·L-1)时抑制作用极显著(P<0.01)。有研究表明,较
低暴露浓度时硫化镉量子点的细胞毒性机制可能是
活性氧的氧化损伤,而在较高暴露浓度时,可能Cd2+
10 μm
10 μm
10 μm
图 5 不同浓度 CdS QDs对斜生栅藻 MDA含量的影响
Figure 5 Effects of different CdS QDs nanoparticles on the MDA
activities of S.obliquus
0.13
0.12
0.11
0.10
0.09
0.08
0.07
0.06
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
0
M
DA
含
量
/μ
m
ol ·
m
L-
1
**
**
*
CdS QDs处理/mg·L-1
0.2 0.4 0.6 0.8 1.00
图 4 不同浓度 CdS QDs对斜生栅藻 SOD含量的影响
Figure 4 Effects of different CdS QDs nanoparticles on the SOD
activities of S.obliquus
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
SO
D
含
量
/×
10
3
U ·
m
g-
1
FW
**
**
**
**
**
CdS QDs处理/mg·L-1
0.2 0.4 0.6 0.8 1.00
a
b
c
王 蓉,等:纳米硫化镉量子点对斜生栅藻的毒性研究 527
农业环境科学学报 第 32卷第 3期
的释放占主导地位[1]。因此可推测,本实验中低浓度
组的生长抑制主要由氧化损伤引起,随着暴露浓度
升高,Cd2+的释放浓度增大,对细胞的毒性作用增强。
光合色素是反映植物利用光照能力的重要指标,
在植物的生理、生长过程中起着至关重要的作用,因
此可作为反映植物应对环境胁迫状况的重要指标。本
实验中,随着硫化镉量子点暴露浓度增大,藻细胞具
有颜色变浅、光合色素含量减少的趋势,这与其对藻
细胞生长抑制趋势一致。这表明,在低浓度硫化镉量
子点暴露下,细胞中活性氧积累,影响了叶绿体正常
生理功能;而在中、高浓度硫化镉量子点暴露下,Cd2+
的释放增多对细胞产生毒性作用,破坏了叶绿体结
构,使叶绿素合成受阻[1]。由于细胞无法正常进行光合
作用,进一步导致藻类生长受阻、细胞颜色变浅[21]。
在藻细胞的正常代谢过程中可产生各种活性氧
代谢物,如超氧阴离子、单线态氧、过氧化氢和羟自由
基等[22]。细胞内的 SOD能清除过多活性氧代谢物,维
持细胞内氧自由基处于正常水平,在减轻脂质过氧化
作用和膜损伤方面有重要作用[23]。MDA是生物膜中
多种不饱和脂肪酸在氧自由基的攻击下形成的脂质
过氧化最终产物之一,MDA能使膜的通透性增强,其
浓度可以表示脂质过氧化强度和膜系统伤害程度。本
实验中,MDA的含量在 0.2、0.4、0.6 mg·L-1暴露浓度
下与对照组相比变化不大,说明细胞膜的脂质过氧化
程度不明显,细胞膜没有受到明显损伤。在 0.2 mg·L-1
暴露浓度下,SOD含量提高可能是由于硫化镉量子点
诱导 O2·等活性氧自由基产生,增大了氧自由基的产
生量[22],O2·含量一定程度的增加能诱导 SOD含量的
上升,以保持细胞清除自由基的正常功能[24]。在 0.4
mg·L-1暴露浓度下,硫化镉量子点的毒性影响开始超
出机体的耐受能力,SOD受到损伤,含量下降,这是机
体中毒反应的前兆[24],这与硫化镉量子点对藻细胞生
长的抑制作用一致。在暴露浓度为 0.6 mg·L-1下,SOD
含量再次升高可能是由于 Cd2+的释放造成的。研究表
明,无表面涂层的量子点材料易发生表面氧化,分解
释放出 Cd2+,Cd2+对体外细胞的增殖、存活能力均能产
生直接作用[23]。本实验采用的硫化镉量子点未经表面
修饰,能够氧化解离,释放 Cd2+,而 Cd2+浓度增加作为
逆境胁迫条件,诱导藻细胞产生应激效应,使 SOD含
量升高。在 0.8 mg·L-1浓度处理下,SOD和 MDA含量
均显著降低,可能是由于藻细胞的吞饮作用使硫化镉
量子点进入细胞。有研究表明,量子点能够直接对细
胞器结构造成损伤[25],因此推测细胞内的线粒体和叶
绿体可能受到损伤,使细胞内产生的自由氧基减少,
MDA的含量随之下降,同时 SOD合成受阻,含量也
随之下降。在高浓度 1.0 mg·L-1下,SOD含量明显下
降可能是因为硫化镉量子点诱导产生大量活性氧自
由基,使细胞长时间维持较高的 O2·水平,造成细胞
内活性物质包括酶损伤,毒性影响超出机体耐受能
力,SOD受到损伤,含量持续下降[24]。同时,细胞脂质
过氧化程度加剧,导致 MDA的含量大幅升高。
4 结论
硫化镉量子点对斜生栅藻细胞具有细胞毒性作
用,且毒性效应与硫化镉量子点的暴露浓度有关。低
暴露浓度致毒机制主要是由活性氧引起的氧化损伤,
氧化损伤作用导致藻细胞出现生长抑制、光合色素含
量下降。当暴露浓度为 0.6、0.8、1.0 mg·L-1时,由于
Cd2+的释放程度加大,在原有氧化损伤的基础上,加
剧了硫化镉量子点对细胞的毒性效应,导致藻细胞出
现显著的生长抑制;SOD和 MDA含量出现的相应变
化表明高浓度的硫化镉量子点对斜生栅藻的细胞膜
造成了损伤。
硫化镉量子点对斜生栅藻细胞致毒的主要原因
可能是 Cd2+的释放和活性氧的氧化损伤作用,其具体
作用机制还有待进一步研究。硫化镉量子点作为一种
新型的广泛使用的材料,其对水环境的潜在危害不容
忽视,相关部门在制定硫化镉量子点安全标准时应当
慎重考虑。
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