全 文 ：第 32卷第 3期
20 1 1年 5月
水 生 态 学 杂 志
Journal of Hydroecology
Vol． 32，No． 3
May， 2011
收稿日期:2011 － 01 － 20
基金项目:国家自然科学基金 (U0733007、U1033602 和
41073057)资助。
通讯作者:刘正文。E-mail:zliu@ niglas． ac． cn
作者简介:包苑榆，1985 年，女，硕士研究生，主要从事淡水生态
与环境修复研究。E-mail:xuanyecao_85@ 163． com
基于15 N稳定同位素技术的斜生栅藻对硝氮和氨氮吸收研究
包苑榆1，钟 萍1，韦桂峰1，郭海森1，刘正文1，2
(1．暨南大学水生生物研究中心，广东 广州 510632;2．中国科学院南京地理与湖泊研究所，江苏 南京 210008)
摘要:硝氮(NO －3 -N)和氨氮(NH
+
4 -N)是水体中无机氮的主要形态。利用
15 N 稳定同位素技术研究了斜生栅藻
(Scendesmus obliquus)对 NO －3 -N和 NH
+
4 -N的吸收特征。结果显示，在相同浓度条件下，斜生栅藻对 NH
+
4 -N 的吸
收速率显著高于对 NO －3 -N 的吸收率，在 180 min 的试验中，对
15NH +4 -N的吸收速率为 0． 62 ～ 1． 15 μmol /
(g·min) ;对15NO －3 -N的吸收速率为 0． 08 ～ 0． 15 μmol /(g·min)。在 NO
－
3 -N 和 NH
+
4 -N 2 种形态氮源同时存在
的混合组中，斜生栅藻对 NO －3 -N的吸收速率［0． 12 ～ 1． 00μmol /(g·min) ］显著低于 NO
－
3 -N 作为唯一氮源的单
一组［0. 78 ～ 1． 23 μmol /(g·min) ］，表明 NH +4 -N 的存在对藻类吸收 NO
－
3 -N 有抑制作用。在
14 NO －3 -N 和
15NO －3 -N同时存在时，斜生栅藻优先吸收
14NO －3 -N，产生同位素分馏效应，但不同形态氮对藻类氮吸收的影响远远
大于同位素的影响。
关键词:15N稳定同位素;斜生栅藻;硝氮;氨氮
中图分类号:Q503 文献标志码:A 文章编号:1674 － 3075(2011)03 － 0016 － 05
人类的频繁活动加剧了水体富营养化，导致浮
游植物的大量繁殖，容易暴发“水华”。氮是影响浮
游植物生产力的主要因素之一，而硝氮和氨氮是藻
类利用氮的主要形态(Chapman ＆ Craigie，1977;
Dortch，1982)。研究藻类对氮吸收的传统方法主要
是通过测定不同时间溶液中氮含量的变化来计算
(Harlin ＆ Wheeler，1985) ;但有研究发现，培养过
程中藻类除了消耗溶液中的氮外，也会向溶液中释
放氮(Dugdale ＆ Goering，1967) ，所以该方法并不
能很好地反映藻类对氮的吸收情况。随着稳定同位
素示踪技术的飞速发展，越来越多的学者开始利用
15N 稳定同位素研究藻类对氮的吸收(Haxen ＆ Le-
wos，1981;Peterson ＆ Fry，1987;Waser et al，
1998)。15N稳定同位素技术具有灵敏度高、藻类吸
收试验时间短、氮吸收的关键过程更清楚等优点
(Fujita et al，1988)。单一形态氮吸收动力学的研究
已有很多，这些研究通常反映藻类在饥饿状态下对
某种单一形态氮的吸收情况。自然水体通常同时存
在多种形态的氮，而利用15 N 稳定同位素技术比较
在多种形态氮源共存的富营养条件下，藻类对不同
形态氮吸收特征的研究尚未见报道。
有研究表明，水体中氮缺乏时铜绿微囊藻易形
成优势，氮丰富时斜生栅藻(Scendesmus obliquus)容
易形成优势(许海等，2008) ，说明氮对斜生栅藻竞
争力有重要的影响;然而，藻类对不同形态氮的吸收
速率不同，说明氮对藻类的影响可能与氮的形态有
关。本文以斜生栅藻为对象，通过设置单一形态氮
(硝氮)和混合形态氮(硝氮 +氨氮)2 组试验，利用
15N和14N区分不同形态氮源，测定斜生栅藻15 N 的
含量，从而计算出藻类对氮的吸收速率，探讨不同形
态氮源对藻类吸收的影响，从而揭示氮源形态对浮
游植物群落结构的影响机理。
1 材料与方法
1． 1 藻种分离与培养
斜生栅藻分离自暨南大学明湖，纯化后保种于
暨南大学水生生物研究所藻种室，于试验前进行扩
大培养。
1． 2 试验设计
取一定量的藻液，以 3 200 r /min 的速度离心
5 min，去掉上清液后用无氮培养基洗涤，再次离心
去上清液，如此重复 2 次，接种于装有培养液的三角
瓶中。试验所用的培养基是在 BG11 配方(Rippka
＆ Herdman，1992)的基础上改良，将总氮(TN)浓度
调整为 3． 0 mg /L并改变其氮源。试验设置单一形
态氮(NO －3 -N)和混合形态氮(NO
－
3 -N + NH
+
4 -N)
2 组，见表 1。 15 NH4Cl、Na
15NO3的
15 N 丰度均达
99． 0%以上。
表 1 试验组设置及氮源浓度
Tab． 1 Concentration and forms of nitrogen
source used in groups mg /L
氮源 单一组 混合组
14NO －3 -N 2． 5 2． 5
15NO －3 -N 0． 5 0． 0
15NH +4 -N 0． 0 0． 5
TN 3． 0 3． 0
斜生栅藻生物量用干重表示，用已称重的 GF /F
滤膜定量抽滤藻液，然后将滤膜置于烘箱中 60℃烘
48 h至恒重，减去滤膜重量即为藻的生物量。
试验在添加氮后分别于 0、30、60、90、120、150、
180 min取样，立即以 5 000 r /min 离心，将上清液置
于小瓶中，于 4℃下保存并用碱性过硫酸钾消解紫
外分光光度法测定溶解态总氮(DTN)的浓度。剩
下的藻泥置于烘箱中 60℃烘干 48 h至恒重，放入锡
囊，用英国 Sercon 20-20 质谱仪对斜生栅藻中的15N
稳定同位素测定 δ 15 N(δ 15 N 为15 N 稳定同位素比
率，指样品中15 N 稳定同位素比值相对标准相应比
值的千分偏差)。
1． 3 计算公式
1． 3． 1 斜生栅藻15N吸收速率
δ 15N(‰)=(R样品 /R标准 － 1) × 1 000 (1)
式中 R样品、R标准分别为样品和标准的
15 N / 14 N，
氮稳定性同位素分析标准为空气(Moriotti，1984)。
由(1)式得到:R样品 = ［δ
15N(‰)/1 000 + 1］
× R标准 (2)
15N同位素占藻内 N的原子比例(A，%)用下式
得出:
A = R样品 /(R样品 + 1) (3)
15N同位素富集度 a1(%)由下式得出:
a1 = A － a0 (4)
式(4)中:a0 为试验添加前藻
15 N 丰度，a0 =
0. 365%。
藻对15N 的吸收速率 V1［μmol /(g·min) ］计算
式:
V1 = b × a1 × 100 /(15·T) (5)
式中:b为样品中 N 占干重的比例(%) ;15 为
15N的原子量;T为反应吸收的时间(min)。
1． 3． 2 斜生栅藻14N吸收速率
V2 = (Cf － Ci)/(Dw·T) (6)
式中:V2 为斜生栅藻对
14 N 的吸收速率
［μmol /(g·min) ］;Ci、Cf 分别为某段时间内溶液中
DTN的起始浓度和结束浓度(μmol /L) ;Dw 为斜生
栅藻的生物量(g /L) ;T为反应吸收的时间(min)。
2 结果
2． 1 斜生栅藻对15N的吸收速率
单一组和混合组中15 N 的浓度均为 0． 5 mg /L，
斜生栅藻对15 N 的吸收速率分别代表了对15 NO －3 -N
和15NH +4 -N的吸收速率，结果见图 1。可见斜生栅藻
对15NH +4 -N的吸收速率始终远大于对
15 NO －3 -N 吸收
速率。
斜生栅藻对15NH +4 -N的吸收速率随时间的增加
呈上 升 趋 势，且 幅 度 较 大，从 30 min 时 的
0． 63 μmol /(g·min)升至 180 min时的 1． 13 μmol /
(g·min) ;对15NO －3 -N 的吸收速率随时间的增加呈
下 降 趋 势，但 幅 度 较 小，从 30 min 时 的
0． 12 μmol /(g·min)降至 180 min时的 0． 08 μmol /
(g·min)。
图 1 斜生栅藻对15N的吸收速率
Fig． 1 Comparison of 15N uptake rate in
single and mixed groups
2． 2 斜生栅藻对14N的吸收速率
单一组和混合组中的 14 NO －3 -N 初始浓度均为
2． 5 mg /L，斜生栅藻对14N的吸收速率见图 2。结果
显示，单一组始终高于混合组。随着吸收时间增加，
单一组和混合组中斜生栅藻对14NO －3 -N的吸收速率
均有所下降，混合组下降的幅度比单一组大。
2． 3 15N /14N比较
单一组和混合组中 15 N / 14 N 的初始比例均为
20． 35%。随着斜生栅藻对氮的选择性吸收，培养液
中的15N / 14N比例不断变化，且在单一组和混合组表
现出不一样的趋势，见图 3。在单一组中，溶液中
15N / 14N的比例随着时间的增加而上升，但是180 min
内上升的幅度非常小，从开始的 20. 35% 升至
180 min时的 21． 57%;混合组中的15N / 14N的比例随
着时间的增加而下降，并且下降幅度较大，从开始时
的 20. 35%下降至 180 min时的 7． 21%。
712011 年第 3 期 包苑榆等，基于15N稳定同位素技术的斜生栅藻对硝氮和氨氮吸收研究
图 2 斜生栅藻对14N的吸收速率
Fig． 2 Comparison of 14N uptake rate in
single and mixed groups
图 3 藻对15N /14N的吸收速率比较
Fig． 3 Comparison of 15N /14N in the medium
solution of single and mixed groups
3 讨论
3． 1 斜生栅藻对氨氮和硝氮的吸收速率
斜生栅藻对 15 NH +4 -N 的吸收率显著高于
15NO －3 -N，说明斜生栅藻偏好吸收NH
+
4 -N。Morris
(1974)、Ohmori等(1977)和 Guerrero等(1981)也发
现，蓝藻和多种其他微藻对NH +4 -N的吸收利用优于
其他形态的氮源，这是因为藻类可以直接以NH +4 -N
作为合成氨基酸的底物，而 NO －3 -N要通过一系列酶
先还原成 NO －2 -N再还原成 NH
+
4 -N方能被藻类用以
合成氨基酸。
斜生栅藻对15NH +4 -N的吸收速率在 60 min前较
为平缓，之后显著上升，可能是由于溶液中氨氮初始
浓度较高，且不在藻类吸收的理想浓度范围内，故对
藻类吸收氨氮产生一定的抑制作用。Arzul 等
(2001)对米氏凯伦藻的研究结果指出，当氨氮浓度
达到 30. 0 ～ 46． 5 μmol /L 时，抑制藻的同化作用。
本试验进行到 60 min 时，15 NH +4 -N浓度下降到
29. 28 μmol /L，斜生栅藻吸收氨氮受到的抑制作用
减小，故 60 min 后对15 NH +4 -N吸收速率逐渐上升。
由此可见，湖泊等水体氨氮的增加对藻类生长影响
比硝氮更显著，对浮游植物群落结构的影响也更大。
混合组中斜生栅藻对14NO －3 -N的吸收速率始终
低于单一组(图 2) ，可能是因为15NH +4 -N的存在，抑
制了斜生栅藻对 NO －3 -N的吸收，这与已有研究中得
到的 NH +4 -N抑制藻类吸收 NO
－
3 -N 的结论一致
(Ohmori et al，1977;Dortch，1990;Lomas ＆ Glib-
ert，1999)。混合组中14 NO －3 -N 吸收速率于 60 min
后显著降低，主要是由于 0 ～ 60 min 时溶液中
15NH +4 -N浓度较高，抑制了斜生栅藻对氨氮的同化
作用，此段时间内藻对硝氮的吸收受到氨氮影响相
对较小，故14NO －3 -N的吸收速率较大。而后
15NH +4 -N
浓度下降到一定程度，斜生栅藻对15 NH +4 -N 的吸收
速率开始上升，从而抑制了对14NO －3 -N的吸收，所以
60 min后，14NO －3 -N 吸收速率下降。目前在研究藻
类对氮的吸收时，往往用不同形态氮分别对藻类进
行培养，然后比较吸收特征，根据吸收速率等特征的
大小，分析不同形态氮对藻类的影响(Harlin ＆
Wheeler，1985)。而在水体中，往往是不同形态的
氮同时存在，互相可能存在干扰。本研究利用 15 N
稳定同位素技术，设置混合形态氮源对斜生栅藻进
行培养，得到藻对不同形态氮吸收特征，结果显示同
一种形态氮在混合组中的吸收速率不同于单一组，
更直接和真实地证明多种形态氮同时存在时，藻类
对一种形态氮的吸收受另一种形态氮的影响。
3． 2 同位素对斜生栅藻吸收氨氮和硝氮的影响
由于不同同位素之间存在原子质量差异，反应
速率也有差异(黄达峰等，2006)。在单一组中同时
存在14 NO －3 -N 和
15 NO －3 -N，因此斜生栅藻优先吸收
14NO －3 -N，这种同位素分馏可能会低估斜生栅藻对
15NO －3 -N的吸收。溶液中剩下的
15N / 14N在试验过程
中变化不大，因此这种分馏作用影响较小，故对
15NO －3 -N吸收的低估不多。
单一组中，添加的15 N 和14 N 均为硝氮，溶液中
15N /14N的比例随着时间的增加而上升，主要是由于
斜生栅藻优先吸收14 N，造成同位素分馏效应，使溶
液中剩余的15 N / 14N 的比例逐渐上升，但在 180 min
内，溶液中15 N / 14 N 增长很小，即同位素分馏不大。
而混合组中的15 N / 14 N 的比例随着时间而下降(图
3) ，且下降幅度较大，这是由于15N为氨氮，而14N 为
硝氮，氮形态的不同造成藻类对15 N 和14 N 吸收的巨
大差异，剩下培养液中15N / 14N大幅下降。该结果也
表明，不同形态氮对藻类氮吸收的影响远远大于同
位素分馏的影响。
81 第32卷第 3 期 水 生 态 学 杂 志 2011 年 5 月
参考文献
黄达峰，罗修泉，李喜斌，等． 2006． 同位素质谱技术与应用
［M］． 北京:化学工业出版社．
许海，杨林章，刘兆普． 2008． 铜绿微囊藻和斜生栅藻生长的
氮营养动力学特征［J］． 环境科学研究，21(1) :69 － 73．
Arzul G，Seguel M，Clement A． 2001． Effect of marine animal
excretions on differential growth of phytoplankton［J］． IC-
ES Journal of Marine Science，58:386 － 390．
Chapman A R O，Craigie J S． 1977． Seasonal growth in Lami-
naria longicruris:relations with dissolved inorganic nutri-
ents and internal reserves of nitrogen［J］． Marine Biology，
40:197 － 205．
Dortch Q． 1982． Effect of growth conditions on accumulation of
internal nitrate，ammonium，amino acids，and protein in
three marine diatoms［J］． Journal of Experimental Marine
Biology and Ecology，61(3) :243 － 264．
Dortch Q． 1990． The interaction between ammonium and nitrate
uptake in phytoplankton［J］． Marine Ecology Progress Se-
ries，61:183 － 201．
Dugdale R C，Goering J J． 1967． Uptake of new and regenerated
forms of nitrogen in primary productivity ［J］． Limnology
and Oceanography，12(2) :196 － 206．
Fujita R M，Wheeler P A，Edwards R L． 1988． Metabolic reg-
ulation of ammonium uptake by Ulva rigida (Chlorophyta) :
a compartmental analysis of the rate-limiting step for uptake
［J］． Journal of Phycology，24:560 － 566．
Guerrero M G，Vega J M，Losads M． 1981． The assimilatory
nitrate reducing system and its regulation［J］． Annual Re-
view of Plant Physology and Plant Molecular Biology，32:
169 － 204．
Harlin M M，Wheeler P A． 1985． Ecological Field Methods:
Macroalgae． Handbook of Phy-cological Methods ［M］．
Cambridge，New York:Cambridge University Press:493 －
508．
Haxen P G，Lewos A M． 1981． Nitrate assimilation in the ma-
rine kelp，Macrocystis angustifolia (Phaeophyceae) ［J］．
Botany Marne，24:631 － 635．
Lomas M W，Glibert P M． 1999． Interactions between NH +4 and
NO －3 uptake and assimilation:comparison of diatoms and
dinoflagellates at several growth temperatures［J］． Marine
Biology，133:541 － 551．
Mariotti A． 1984． Natural 15N abundance measurements and at-
mospheric nitrogen standard calibration［J］． Nature，311:
251 － 252．
Morris I． 1974． Nitrogen assimilation and protein synthesis:Al-
gal physiology and biochemistry ［C］． Oxford，Blackwall
Scientific Publishers:583 － 609．
Naldi M，Wheeler P A． 2002． 15N measurements of ammonium
and nitrate uptake by Ulva fenestrate (Chlorophyta)and
Gracilaria pacifica (Rhodophyta) :comparison of net nutri-
ent disappearance，release of ammonium and nitrate，and
15N accumulation in algal tissue［J］． Journal of Phycololy，
38:135 － 155．
Ohmori M，Ohmori K，Strotmann H． 1977． Inhibition of nitrate
uptake by ammonia in a blue-green alga，Anabaena cylin-
drical［J］． Archives of Microbiology，114:225 － 229．
Peterson B J，Fry B． 1987． Stable isotopes in ecosystem studies
［J］． Annual Review of Ecology and Systematics，18:293
－ 320．
Waser N A D，Harrison P J，Nielsen B et al． 1998． Nitrogen i-
sotope fractionation during the uptake and assimilation of
nitrate，nitrite，ammonium，and urea by a marine diatom
［J］． Limnology and Oceanography，43(2) :215 － 224．
(责任编辑 万月华)
912011 年第 3 期 包苑榆等，基于15N稳定同位素技术的斜生栅藻对硝氮和氨氮吸收研究
Study on Uptake of Nitrate and Ammonium by Scendesmus obliquus
Based on 15N Stable Isotope Technique
BAO Yuan-yu1，ZHONG Ping1，WEI Gui-feng1，GUO Hai-sen1，LIU Zheng-wen1，2
(1． Institute of Hydrobiology，Jinan University，Guangzhou 510632，China;
2． Nanjing Institute of Geography and Limnology，Chinese Academy of Sciences，Nanjing 210008，China)
Abstract:Nitrate (NO －3 -N)and ammonium (NH
+
4 -N)nitrogen are the main forms of inorganic nitrogen in wa-
ters． This paper studied the uptake characteristics of NO －3 -N and NH
+
4 -N by Scendesmus obliquus based on
15N sta-
ble isotope technique． The result showed that the NH +4 -N uptake rate was significantly higher than NO
－
3 -N uptake
rate at the same nitrogen concentration，15NH +4 -N uptake rate was 0． 62 － 1． 15 μmol /(g·min)while
15NO －3 -N
uptake rate was 0． 08 － 0． 15 μmol /(g·min)in this 3 h experiment． The NO －3 -N uptake rate in the mixed nitrogen
group［0． 12 － 1． 00 μmol /(g·min) ］in which both NO －3 -N and NH
+
4 -N presented was significantly lower than
that in the single nitrogen group［0． 78 － 1． 23 μmol /(g·min) ］in which only NO －3 -N presented，indicating that
the presence of NH +4 -N inhibits the uptake of NO
－
3 -N． The result also showed that when
15NO －3 -N and
14NO －3 -N
existed simultaneously，Scendesmus obliquus took up 14NO －3 -N preferentially which produces isotope fractionation．
However，the effect of different forms of nitrogen source is far greater than the effect of isotope fractionation．
Key words:15N stable isotope;Scendesmus obliquus;nitrate;ammonium
02 第32卷第 3 期 水 生 态 学 杂 志 2011 年 5 月